携带幽门螺杆菌ureB和IL-2质粒DNA的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗构建

目的　构建编码幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,H .pylori)尿素酶B亚单位 (ureB)基因和小鼠IL 2基因以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的核酸疫苗 ,体外转染Cos 7细胞 ,鉴定其表达蛋白的免疫性。方法　应用聚合酶链式反应 (PCR)技术从H .pylori标准菌株CCUG1 7874基因组DNA扩增ureB基因 ,从重组质粒 pCIneo IL 2扩增小鼠IL 2基因 ,通过T A克隆分别插入 pUCmT载体 ,检测ureB及IL 2的核苷酸序列 ,通过酶切、连接反应分别克隆入真核表达载体 pIRES ,PCR和酶切反应进行鉴定 ;重组载体 pIRES ureB和 pIRES ureB IL 2转入减毒鼠伤寒沙门菌LB50 0 0 ,抽提质粒 ,再次转入SL72 0 7,反复传代 ,鉴定核酸疫苗载体菌的稳定性。通过脂质体法将重组载体 pIRES ureB和pIRES ureB IL 2转染Cos 7细胞 ,SDS PAGE及Westernblot法检测表达蛋白的免疫性。结果　扩增出长约 1 70 0bp的ureB基因和 51 0bpIL 2 ,测序结果表明 ,扩增出的ureB基因与基因库H .pyloriureB序列一致 ,IL 2序列和小鼠的IL 2序列一致 ,PCR和酶切鉴定结果证实ureB和IL 2基因克隆入真核表达载体 pIRES ,并成功构建了稳定的幽门螺杆菌ureB和IL 2基因以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的核酸疫苗 ,并且以Westernblot检测到特异性的相对分子质量 (Mr)为 6 6× 1 0 3的UreB蛋白     

结核分枝杆菌Ag85B基因疫苗免疫保护作用的初步研究

目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱分离基因免疫BALB/c小鼠的T细胞,并以5×106 T细胞/只小鼠过继免疫正常BALB/c小鼠,立即用105 CFU的MTB毒株经小鼠尾静脉攻击感染。4 wk后分别计数脾脏中的细菌负荷。结果:与生理盐水对照组相比较,pTB30m及pTB30s质粒免疫组BALB/c小鼠脾脏中的细菌负荷均减少,分别为0.645(log10 CFU,P<0.01)和0.839(log10CFU,P<0.001);而空质粒对照组小鼠脾脏中的细菌负荷减少较少。经质粒pTB30m和pTB30s免疫的BALB/c小鼠的T细胞,过继免疫的正常BALB/c小鼠,对攻击感染的MTB H37Rv毒株在脾脏中的增殖具有部分抑制作用。结论:pTB30s免疫的BALB/c小鼠,对MTB H37 Rv毒株攻击的保护作用优于pTB30m质粒免疫,有望进一步用于结核病的防治研究。     

口服鼠疫F1-V重组融合基因DNA活菌疫苗的构建及免疫原性研究

目的 构建携带鼠疫耶尔森菌F1-V融合基因的重组减毒沙门菌苗,口服免疫Balb/c小鼠检测其免疫原性,为口服鼠疫活载体DNA疫苗研究打下基础.方法 将F1-V融合基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,进一步依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd-pVAX1/F1-V),提取重组质粒转染COS-7细胞并做免疫组化和Western-blot检测F1-V融合蛋白在细胞中的表达.以1×109CFU/只的剂量3次口服免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中抗体水平.结果 构建的重组减毒沙门菌转染COS-7细胞后,免疫组化和Western-blot试验证明F1-V融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清有特异性抗体IgG产生.结论 构建的重组沙门菌能运送DNA疫苗到体内并成功释放质粒刺激机体产生特异性免疫应答,为口服鼠疫活载体DNA疫苗的黏膜免疫研究打下了基础.     

幽门螺杆菌感染小鼠及其抗原免疫小鼠后体液免疫应答的比较

目的：比较BALB／c小鼠感染H.pylori后以及经H.pylori UreB抗原口服免疫后的体液免疫应答的差异。方法：80只BALB／c小鼠分为感染组和免疫组，感染组灌喂H.pylori小鼠适应株；免疫组灌喂重组H.pylori UreB抗原和佐剂LTB。在试验的0，2，6和10周时每组分别取10只小鼠收集唾液及血液标本，用ELISA法检测抗UreBIgG和IgA抗体，同时采集胃组织作H.pylori感染检测。结果：感染组小鼠在灌喂H.pylori后2，6，10周，感染率均为100％，其血清中抗UreB IgG增高明显，但血清及唾液中均未见IgA的明显升高，；免疫组小鼠在初次免疫后第6，10周后，血清及唾液中抗UreB,IgG和IgA抗体的均显著升高。结论：H.yplori感染BALB／ c小鼠不能诱导其产生明显的特异性黏膜免疫应答，而重组UreB可作为良好的免疫原诱导其产生分泌型IgA抗体。     

基于幽门螺杆菌UreB优势抗原表位多抗原肽疫苗制备及其免疫保护作用

目的 构建串联式幽门螺杆菌UreB抗原优势表位UreB322和UreB527原核重组表达系统,制备UreB322和UreB527表位与多肽载体Poly-Asp-Lys的多抗原肽(MAP)疫苗并确定其免疫原性和免疫保护性.方法 采用连接引物PCR构建含肠激酶(EK)位点的串联式UreB322和UreB527表位基因及其原核表达系统.表达的目的重组融合蛋白8×[rEK-UreB322-EK-UreB527-EK]经EK水解后用Sephadex G-25柱分离rUreB322-EK和rUreB527-EK片段.采用碳二亚胺法将rUreB322-EK、rUreB527-EK与Poly-Asp-Lys载体分子交联,制备出多抗原肽疫苗MAP-rUreB322/B527.采用ELISA和Western blot分别检测各重组表位肽及MAP-rUreB322/527的抗原性和免疫反应性.采用幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠模型检测MAP-rUreB322/527免疫保护效果.结果 获得了8次重复串联的UreB322和UreB527编码基因及其原核表达系统,目的融合蛋白8×[rEKUreB322-EK-rUreB527-EK]表达量可达细菌总蛋白的48％.肠激酶可将目的融合蛋白完全水解为rUreB322-EK和rUreB527-EK片段.rUreB322-EK和rUreB527-EK与Poly-Asp-Lys交联率高达92.5％.幽门螺杆菌全菌抗体及rUreB-IgG均能识别rUreB322-EK、rUreB527-EK和MAP-rUmB322/527并与之结合.MAP-rUreB322/527免疫小鼠血清抗体水平明显高于rUreB(P＜0.05).50或100μgMAP-rUreB322/527对幽门螺杆菌SS1株感染小鼠的保护率(83.3％和91.7％)明显高于等量rUreB(41.7％和50.0％)(P＜0.05).结论 本研究成功地构建了幽门螺杆菌UreB抗原优势表位UreB322和UreB527重复串联式编码基因及其原核表达系统,基于UreB优势抗原表位的多抗原肽疫苗MAPrUreB322/527能显著提高免疫保护效果.     

幽门螺杆菌双亚单位基因疫苗的构建及免疫原性研究

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）两个保护性亚单位UreB、HspA融合基因疫苗并观察其免疫原性。方法：从Hp基因组分别扩增出UreB、HspA基因片段,采用重叠延伸PCR方法将两个基因片段构建融合基因,以BglⅡ和XhoⅠ酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,经测序确认后转染COS-7细胞,Western blot检测目的蛋白表达,胫前肌注射免疫小鼠后收集血清检测特异性抗体效价。结果：经测序后证实成功将融合基因构建到真核表达载体中,免疫印记检测到目的蛋白表达,并具有良好的抗原性,免疫小鼠后能够产生特异性抗体。结论：成功构建Hp双价DNA疫苗,免疫小鼠后显示出良好的免疫原性,为Hp进一步基因疫苗的研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）UreB-Ompll融合蛋白的重组疫苗候选株，在大肠杆菌中表达UreB-Ompll融合蛋白，并检测其免疫学活性。方法：用PCR方法扩增郑州分离坳菌株MEL-HP27的ureB和ompll基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-ompl1融合基因，将融合基因ureB-ompl1插入原核表达载体pET30a（＋）、pET28a（＋）及pMAL-c2X中，筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达，采用Westernblot对表达产物进行鉴定，并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白，应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析，纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠，Westernblot对免疫小鼠血清进行检测。结果：特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB—ompll克隆人表达载体pE330a（＋）、pET28a（＋）与pMAL—c2X中；重组菌TBl（pMAL-ureB—ompl1）经诱导获得了高效表达的MBP-UreB—Ompll融合蛋白，该融合蛋白可以被却免疫小鼠血清和却阳性患者血清中的相应抗体所识别，纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后，与纯化的融合蛋白进行杂交，结果显示在M，134000处出现特异杂交带，融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论：成功地构建并筛选出了却MELHP27融合蛋白UreB-Ompl1的重组疫苗候选株TBl（pMAL-ureB—ompll），为坳蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株,在大肠杆菌中表达UreB-Omp11融合蛋白,并检测其免疫学活性。方法:用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的ureB和omp11基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-omp11融合基因,将融合基因ureB-omp11插入原核表达载体pET30a( )、pET28a( )及pMAL-c2X中,筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达,采用Western blot对表达产物进行鉴定,并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白,应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析,纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠,Western blot对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB-omp11克隆入表达载体pET30a( )、pET28a( )与pMAL-c2X中;重组菌TB1(pMAL-ureB-omp11)经诱导获得了高效表达的MBP-UreB-Omp11融合蛋白,该融合蛋白可以被Hp免疫小鼠血清和Hp阳性患者血清中的相应抗体所识别,纯化后的融合蛋白纯度达90%以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在Mr134000处出现特异杂交带,融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论:成功地构建并筛选出了HpMELHP27融合蛋白UreB-Omp11的重组疫苗候选株TB1(pMAL-ureB-omp11),为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB基因融合及表达的研究

目的　构建和表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位 (UreB)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)的重组融合蛋白 ,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌染色体DNA中扩增出 1713bp的ureB基因 ,并克隆至pFS2 .2载体中与ltB基因融合 ,将ltB ureB融合基因插入改造后的原核表达载体PinPointTMXa Ⅱ ,并在工程菌E .coliJM10 9中诱导表达。结果　经序列分析 ,ltB ureB融合基因由 2 10 3个碱基组成 ,为编码 70 1个氨基酸残基的多肽。SDS PAGE和Westernblot检测发现 ,融合蛋白的相对分子质量 (Mr)约为 75× 10 3 ,并与幽门螺杆菌感染的阳性血清发生抗原抗体反应 ,ELISA检测显示 ,融合蛋白中存在LTB组分。同时发现所表达的融合蛋白无尿素酶活性 ,但保持与LT受体 神经节苷脂GM1结合的活性。结论　LTB UreB融合蛋白有可能用于幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究     

HPV11型L2E7融合蛋白的原核表达及其免疫效果观察

目的构建人乳头瘤病毒11型L2E7原核表达系统pET9aHPV11L2E7，并纯化蛋白进行小鼠免疫效果研究。方法从尖锐湿疣组织中扩增人乳头瘤病毒11型12、E7基因片段，构建DET9aHPV11L2E7原核表达重组质粒并测序，在大肠埃希菌宿主菌BL21（DE3＋）中经IPTG诱导表达融合蛋白L2E7（553个氨基酸），经SDS—PAGE电泳和Western Blot进行鉴定。CM离子交换介质纯化蛋白免疫BALB／c小鼠，进行细胞免疫水平和体液免疫水平的检测。结果成功构建了pET9 aHPV11L2E7原核表达系统，纯化获得的HPV11L2E7蛋白免疫BALB／c小鼠后能检测到针对HPV11E7特异性的细胞免疫，血清中能检测到高效价抗HPV11L2E7抗体。结论纯化的HPV11L2E7融合蛋白能够引发特异性细胞和体液免疫反应，能作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。     

表达幽门螺杆菌hpaA重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建和鉴定

目的：构建表达幽门螺杆菌（H.pylori)hpaA的重组减毒鼠伤寒沙门低 疫苗菌。方法：用基因工程的方法将hpaA基因克隆入原核表达质粒pTrc99A,并进行了基因测序。重组质粒经鉴定后再导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261,提取重组疫苗菌质粒,PCR和酶切鉴定,筛选阳性克隆。用SDS－PAGE电泳和Western blot进行HpaA表达和鉴定。结果：经PCR和酶切证实,构建了含hpaA的重组原核表达质粒pTrc99A-hpaA,并将后者成功转化了减毒鼠伤寒沙门氏菌。HpaA能在疫苗菌中以二聚体形式表达,HpaA量约占全菌体蛋白量的17％,Westem blot证实其有免疫原性。结论：构建了表达H.pylori hpaA的重组减毒鼠伤寒沙门氏疫苗菌,为探索制备H.pylori口服活疫苗尊定了基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位核酸疫苗的构建及鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌HpureB基因,并构建其核酸疫苗。方法:以HpNCTC11637株基因组DNA为模板,用PCR扩增ureB基因,并亚克隆至pMD18-T载体中。将目的基因经SalI、BglⅡ酶切纯化后插入pTCAE中,转化E.coliDH5α。经SalI、XhoI酶切并测序鉴定的阳性重组质粒命名为pT-ureB。以电穿孔法将pT-ureB转染CHO细胞,用Wes-tern blot检测UreB蛋白的表达。结果:克隆重组后得到pT-ureB。将pT-ureB以电穿孔法转染CHO细胞后,取其培养上清进行Western blot检测,在UreB的相对分子质量(Mr)为62000处出现特异性条带。结论:成功地构建了HpureB核酸疫苗。体外转染CHO细胞后,经Western blot检测证实有UreB蛋白的表达,为进一步的相关研究奠定了基础。     

表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株的构建

目的 采用平衡致死系统构建表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株。方法 PCR扩增幽门螺直菌尿素酶B亚单位,与pYA3149(asd^ ）载体质粒重组,转化减毒的伤寒沙门氏菌突变株,SDS-PAGE,用western-bolt分析其表达,并观察重组菌体外传代培养的稳定性。结果 利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的重组减毒沙门氏菌工程菌株,且在有选择压力的条件下在体外能稳定地繁殖、生长和传代。结论 表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒伤寒沙门氏菌工程菌株的成功构建为发展幽门螺杆菌的口服基因工程疫苗奠定了基础。     

表达pCDR1 Th表位减毒鼠伤寒沙门菌株的构建

目的构建表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株。方法全基因合成pCDR1两条核苷酸链,在C端加上6-His标签,退火互补后插入原核表达载体pYA3149中,构建重组质粒pR1,将该重组质粒转入鼠沙门菌终宿主菌株X4550,获得杂合菌株X4550（pR1）。体外诱导表达后斑点印迹鉴定表位肽的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。体外诱导后6h细菌裂解上清液中,检测到表位肽的表达,该蛋白能与鼠抗His单克隆抗体特异结合。重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。结论成功构建了能稳定表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株。     

表达鼠精子Cyritestin蛋白的减毒沙门氏菌疫苗株的构建及其鉴定

目的 构建表达鼠精子eyritestin蛋白的可口服减毒沙让氏菌活疫苗株。方法 应用质粒TAZ83／13，将之进行双酶切获得含有成熟cyritestin蛋白cDNA序列的酶切片段。将其插入表达载体yA3149中，构建重组质粒pCFL。将该重组质粒转入鼠沙门氏伤寒杆菌疫苗株X4632和X4550中，以获得重组菌株X4632（pCFL)和X4550（pCFL)。结果 该两种无抗药性的重组菌株在体外营养选择压力下，可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。X4550(pCFL)在体内可较稳定地害居于Peyer‘s结，肠系膜淋巴结和脾脏；X4632（pCFL)可较稳定地定居于Peyer‘s结。二者均可表达被抗cyritestin单抗（mAb)识别的重组cyritestin蛋白。口服该疫苗菌株无明显的毒性作用。结论 X4632（pCFL),X4550（pCFL)疫苗株的构建，为研究以cyritestin为靶抗原的精子抗原避孕疫苗打下了基础。     

表达肠出血性大肠杆菌 O157:H7 EspA 抗原的减毒沙门氏菌株的构建

目的 利用平衡致死系统构建表达O157:H7 EspA 的减毒鼠伤寒沙门氏菌.方法 构建表达EspA的重组质粒,再将其转入终宿主菌减毒鼠伤寒沙门氏菌x4550 株中构建成口服活疫苗株,用IPTG进行诱导表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳、Westen-blot检测EspA蛋白的表达情况.并观察重组菌体外培养的稳定性.结果 利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达O157:H7 EspA的重组减毒沙门氏菌,经Tricine-SDS-PAGE电泳出现了1条Mr约21 000的蛋白条带,Westen-blot检测能与抗EspA的单克隆抗体发生特异性反应.且在没有选择压力的条件下体外能稳定地繁殖、生长和传代.结论 表达O157:H7 EspA的重组减毒沙门氏菌构建成功,为发展口服抗EHEC O157:H7的疫苗奠定了初步基础.     

幽门螺杆菌HspA和UreB双价侯选疫苗株的构建

目的 构建表达幽门螺杆菌的组成成分热休克蛋白Ａ亚单位（ＨｓｐＡ）和尿素酶Ｂ亚单位（ＵｒｅＢ）的重组蛋的白质的侯选菌株。方法 用ＰＣＲ方法从幽门螺杆菌的染色休ＤＮＡ上分别扩增出ＨｓｐＡ和ＵｒｅＢ基因片段,将它们融合插入原核表达载体ｐＥＴ－２３ｂ（＋）中,并在ＢＬ２１（ＤＥ３）大肠杆菌表达。结果 经测序,ＨｓｐＡ－ＵｒｅＢ（ＨＵ）事例基因片段由２０６１ｂｐ组成,为编码６８７个氨基酸残基的多肽。ＳＤＳ－     

鼠精子表面蛋白cyritestin在沙门氏菌平衡致死系统中的高效表达

目的 松建表达鼠精子cyritestin蛋白的可口服减毒沙门氏菌活疫苗株。方法 将编码成熟cyritestin蛋白cDNA序列的酶切片段插入含pUC复制子的表达载体pYA3339中,构建重组质粒pMCY,将该重组质粒转入鼠沙门氏伤寒杆菌疫苗株X4550,获得杂合菌株X4550（pMCY）。应用 western blot对重组菌所表达的重组cyritestin蛋白进行免疫分析,结果 该无抗药性的杂合菌株在体外营养选择压力下可较稳定携带重组质粒传代繁殖,在体内可较稳定地定居于Peyer‘s结、肠系膜淋巴结和脾脏。该重组菌可高水平表达重组cyritestin蛋白。结论 高效表达cyritestin蛋白的X4550（pMCY）疫苗株可用于免疫性避孕研究。