大鼠白细胞介素—10cDNA的克隆

目的：克隆大鼠白细胞介素－10（IL－10)cDNA的全长序列，为其分子生物学利用奠定基础，方法：无菌条件下切取大鼠的脾脏，收集脾细胞，用脂多糖（LPS）刺激培养4h离心得到一定量细胞，加入变性液，一步法提取细胞总RNA；逆转录合成IL－10的第1条链，用自己设计的特异性上下游引物进行PCR扩增，得到期望相对分子质量的PCR产物；酶切后插入pcDNA3载体，转染感受态细胞进行筛选制备，并行PCR、酶切鉴定和测序。结果：脾细胞经LPS刺激后IL－10转录水平增加，从提取的RNA转录产物中容易扩增出期望相对分子质量的PCR产物，酶切和PCR鉴定证明所得IL－10cDNA相对分子质量与其因库报告的相近，测序表明得到的IL－10cDNA充阢与基因库报告的序列完全一致，结论，大鼠的IL－10cDNA全长序被成功克隆。     

人白细胞介素—6受体cDNA的克隆

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术座人的外周血单个核细胞中扩增出人ＩＬ－６受体的特异性ｃＤＮＡ片段，经琼脂糖电泳证实扩增片段大约为１４００碱基对。运用ＤＮＡ重组技术，将获得的片段连接到ｐＵＣ１８质粒中，经转化，筛选，酶切鉴定构建出重组质粒ｐＵＣＩＬ－６受体。     

人白细胞介素10的克隆及分泌表达

目的：研究人白细胞介素10（hIL-10)的高效分泌表达。方法：根据Genbank报道的hIL-10基因序列，人工合成hIL-10基因，并将某些稀有密码子替换成E.Coli偏爱密码子，克隆至pUC18质粒中，测序结果与预期一致，将hIL-10基因克隆至PET22b，构建分泌表达克隆PET22b-hIL-10，经IPTG诱导在大肠杆菌BL21（DE3）中表达hIL-10天然蛋白。结果：SDS－PGAE电泳及凝胶密度扫描分析显示，重组蛋白分子量约为18KD和21KD(含信号肽），不同温度条件下重组蛋白的表达状态和表达量不同，结论：18摄氏度重组蛋白hIL-10的表达量为7．6％。     

人白细胞介素-10 cDNA的克隆、测序和真核表达载体的构建

目的 克隆、测序人白细胞介素－10 cDNA开放阅读框架。方法 刀豆蛋白A活化的人外周血核细胞培养后用于提取总RNA,以随机引物行逆转录反应合成hIL-10 cDNA第一链,并以hIL-10 特异性引物行PCR扩增,将PCR产物克隆至pUC18中测序并构建真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。结果 PCR扩出550bp特异性片段,经克隆至pUC18后测序表明序列同源性与GenBank报道完全一致,并克隆鉴定了真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。结论 成功克隆了人白细胞介素－10 cDNA开放阅读框架,序列分析证实与ＧenBank录入序列同源性达１００％,并成功构建了真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。     

人白细胞介素18cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

获得ＩＬ－１８全长ｃＤＮＡ序列，研究ＩＬ－１８在大直菌中的表达。方法利用ＲＴ－ＰＣＲ方法人人外周血单个核细胞中扩增出人白细胞介素的ｃＤＮＡ，以Ｓａｎｇｅｒ双脱氧法测序。     

重组人白细胞介素10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆编码人白细胞介素10（hIL-10）基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中进行表达.方法：应用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体.采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑（MTT）检测hIL-10蛋白的活性.结果：RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功.在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化.结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础.     

人白细胞介素-10在大肠杆菌中的表达

目的克隆人IL-10 cDNA的全长序列，构建原核表达载体并诱导其表达。方法无菌条件下静脉采取正常人外周血10ml。加入等体积的生理盐水稀释后，加入淋巴细胞分离液，离心收集细胞，提取细胞总RNA。以细胞总RNA为模板，进行RT—PCR，克隆出IL-10 cDNA，经双酶切后插入表达载体pMon中，用pMon—IL10重组体转染大肠杆菌DH5a。用萘啶酮酸诱导使重组人IL-10在大肠杆菌中表达，对表达产物进行SDS—PAGE电泳及Western—blot分析。结果人外周血单核细胞经ConA刺激后，IL—10转录水平增加，有利于IL-10 cDNA的克隆；克隆的IL-10 cDNA经测序证实与基因库报告的序列完全一致，插入pMon载体后经萘啶酮酸诱导能够在大肠杆菌DH5a表达；表达的蛋白质能与兔抗人IL—10特异性结合。结论人IL-10 cDNA被成功克隆并能够在大肠杆菌中表达。     

人白细胞介素17cDNA的克隆及表达

目的 获取重组的人白细胞介素17以进行科学研究和应用。方法 应用RT－PCR的方法，从经PHA活化的人外周血单个核细胞中扩增hIL-17cDNA的编码序列，将其克隆至测序载体pBS SKⅡ（ ）中进行测序，再将其亚克隆至表达载体pBV220中，在大肠杆菌XL1－Blue中进行表达。结果 克隆获得了hIL-17cDNA，经热诱导后使hIL-17蛋白在大肠杆菌中的表达量达到了39．7％。结论 通过克隆hIL-17cDNA的编码序列及热诱导使hIL-17蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

人白细胞介素18（hIL—18）的cDNA基因克隆及序列测定

目的：克隆人白细胞介素18（IL－18）全长cDNA基因,进一步探讨人白细胞介素18的功效。方法：采用RT－PCR的方法从人肝组织中扩增出人白细胞介素18（IL－18）基因,并克隆到真核表达的绿色荧光蛋白报告载体pEGFP-NI中,结果：经PCR及DNA序列测定得以证实其序列与文献报导一致,结论：该实验成功地克隆了IL－18cDNA,并将其重组构建了含有IL－18cDNA的真核表达载体pEGFP-N1-IL18。     

Chemical synthesis and cloning of human calcitonin (hCT) cDNA

Humancalcitonin(hCT)isanoligo--peptidehormonecontaining32aminoacidresidues(aa)whichisproducedbytheC--parafollicularcellsofthethyroidglandinhumans.Togetherwiththearathyoidichormoneand1,25--dihydroxycholecalciferol,hCTplaysanimportantroleintheregulationofcalciumandphosphatemetabolism.Itstimulatestheimmobilizationofthecalciuminthebonesystem,preventingtheresorptionofthebones.ThehCThasbeenadministeredfortreatmentofpatientssufferingfromvariousdiseaseswherestronghypercalcemiaorboneresorptionoccurs…     

人白细胞介素7基因克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人白细胞介素7（hIL-7）的真核表达载体。方法：从人脾脏组织的总RNA中，用RT－PCR方法扩增出编码成熟hIL-7的cDNA，将其克隆于pMD18-T质粒中，并进行序列测定。再将hIL-7cDNA以正义及反义插入真核、原核双重表达载体pBK-CMV质粒，转化至大肠杆菌DH5α。最后将表达的lacz-hIL-7重组蛋白行SDS－PAGE电泳，并作考马斯亮蓝染色分析，western blot鉴定。结果：hIL-7序列测定结果与预期一致。pBK-CMV-hIL-7（正义插入）的无隆表达重组蛋白，western blot证实此蛋白为IL－7。结论：成功构建了hIL-7的真核表达载体，为进一步研究hIL-7的抗肿瘤作用创造了条件。     

人IL-10基因重组复制缺陷型腺病毒DNA的构建

目的 构建人IL-10基因的重组腺病毒并进行体外表达和检测。方法从质粒pcDNA3IL-10的CMV启动子下游完整切下IL-10 cDNA的片段,将其定向插入Gateway载体,在克隆酶的作用下将阳性克隆质粒转入目的腺病毒载体。PacI酶线性化IL-10腺病毒DNA后阳离子质脂体转染293A细胞,获得人IL-10的复制缺陷型重组腺病毒。体外感染人胰腺癌细胞株Bxpc-3和大鼠胰腺细胞株AR-42J;Western blot检测人IL-10的表达。结果 成功地构建人IL-10重组腺病毒,病毒滴度达2×109PFU/mL。体外感染的细胞株均检测到IL-10的表达。结论 构建复制缺陷型重组腺病毒能够介导IL-10的基因表达,为细胞因子的抗炎冶疗奠定实验基础。     

人白细胞介素10 cDNA重组质粒在细胞和大鼠体内的转染和表达

目的研究人白细胞介素10（hIL-10）cDNA重组质粒的转染和表达,为以后的基因治疗研究奠定基础。方法构建hIL-10 cDNA真核表达重组质粒pcDNA3-hIL-10后进行酶切和测序鉴定。以SA脂质体介导对照质粒pcDNA3及重组质粒pcDNA3-hIL-10转染COS7细胞和SD大鼠,用ELISA方法检测COS7细胞培养液及大鼠胰腺、肺和肝脏组织中hIL-10的含量。结果用pcDNA3-hIL-10质粒转染COS7细胞48 h后,在培养液中检测到hIL-10蛋白浓度为38 000 pg／mL,而对照组仅为55 pg／mL。hIL-10基因转染24 h后大鼠胰腺、肺和肝脏组织hIL-10的产生量达到峰值,以后逐渐下降,至96 h仍显著高于对照组（P〈0．05）,1周后降至正常水平。结论本研究构建的pcDNA3-hIL-10重组质粒可以在真核细胞及大鼠体内高效表达。     

人降钙素cDNA的化学合成与克隆

目的；克隆人降钙素ｃＤＮＡ。方法和结果；应用ＡＢＩ３９１ＤＮＡ合成仪，将人降钙素ｃＤＮＡ分成６个片段合成。退火、磷酸化，连接，最终将人降钙素ｃＤＮＡ克隆于载体ｐＧＥＭ７Ｚ（＋），经ＤＮＡ双链测离，证明克隆利的人降钙素ｃＤＮＡ序列与设计的完全一致。结论；本研究为寡肽ｃＤＮＡ的化学合成与克隆提供了简捷、可靠的方法；为人的降钙素ＤＮＡ的主效表达奠定了基础。     

白细胞介素10基因转染延长移植物存活的研究

目的　克隆大鼠白细胞介素 10 (IL - 10 )的cDNA序列并研究IL - 10基因转染对移植物的保护作用。方法　一步法从脂多糖 (LPS)刺激培养的脾细胞中提取细胞总RNA ,逆转录PCR(RT -PCR)克隆出IL - 10的cDNA。将IL - 10cDNA插入pcDNA3载体进行制备、纯化。建立大鼠异位心脏移植模型 ,在脂质体介导下将pcDNA-IL10重组体通过冠状动脉灌注转染移植心脏。观察移植心脏的存活时间 ,半定量RT -PCR法检测移植心脏IL- 10的转录水平 ,ELISA法检测IL - 10的表达水平。结果　大鼠IL - 10cDNA全长序列被成功克隆 ,序列测定证实与基因库报告的结果完全一致。基因转染的移植心脏平均存活时间明显延长 (17.8天vs 8.5天 ,P <0 .0 1) ;RT-PCR法在对照组未发现IL - 10转录 ,而在基因转染组有 3只移植心脏表现高水平转录 ;基因转染后 3天IL - 10的表达明显增加 (2 70 .8ng Lvs 3 1.5ng L ,P <0 .0 1) ,且移植心脏输出静脉血IL - 10高于外周静脉血 (2 70 .8ng Lvs 163 .5ng L)。结论　通过冠状动脉灌注能够进行基因转染 ,IL - 10基因转染可以延长移植心脏的存活时间     

白细胞介素-10对人树突状细胞表型及致炎细胞因子分泌的影响

目的 观察白细胞介素(IL)-10对体外培养人树突状细胞(DC)表型和致炎细胞因子IL-12分泌的影响，探讨IL-10对DC炎性成熟过程中的负调节作用。方法 通过SCF、GM-CSF、TGF-β、Flt-3和TNF-α体外培养体系，从脐血CD34造血干细胞中诱导扩增获得DC，并于细胞成熟中用重组人IL-10进行干预。流式细胞仪分析细胞表型CD1a、CD11c、CD83、CD80、CD86和HLA-DR；RT-PCR检测IL-12 p35、p40mRNA表达；ELISA法测定IL-12 p70分泌的含量。结果 IL-10可下调成熟中DC表面CD11c、CD83、CD80和CD86的表达，同时可抑制DC内IL．12p35、p40mRNA的转录和IL-12p70的分泌。结论 IL-10可抑制DC黏附共刺激分子表达和致炎细胞因子的合成，提示其不仅可调抑DC的递呈抗原功能，且参与了炎症局部微环境的调节。