大鼠白细胞介素—10cDNA的克隆

目的：克隆大鼠白细胞介素－10（IL－10)cDNA的全长序列，为其分子生物学利用奠定基础，方法：无菌条件下切取大鼠的脾脏，收集脾细胞，用脂多糖（LPS）刺激培养4h离心得到一定量细胞，加入变性液，一步法提取细胞总RNA；逆转录合成IL－10的第1条链，用自己设计的特异性上下游引物进行PCR扩增，得到期望相对分子质量的PCR产物；酶切后插入pcDNA3载体，转染感受态细胞进行筛选制备，并行PCR、酶切鉴定和测序。结果：脾细胞经LPS刺激后IL－10转录水平增加，从提取的RNA转录产物中容易扩增出期望相对分子质量的PCR产物，酶切和PCR鉴定证明所得IL－10cDNA相对分子质量与其因库报告的相近，测序表明得到的IL－10cDNA充阢与基因库报告的序列完全一致，结论，大鼠的IL－10cDNA全长序被成功克隆。     

人白细胞介素-10在大肠杆菌中的表达

目的克隆人IL-10 cDNA的全长序列，构建原核表达载体并诱导其表达。方法无菌条件下静脉采取正常人外周血10ml。加入等体积的生理盐水稀释后，加入淋巴细胞分离液，离心收集细胞，提取细胞总RNA。以细胞总RNA为模板，进行RT—PCR，克隆出IL-10 cDNA，经双酶切后插入表达载体pMon中，用pMon—IL10重组体转染大肠杆菌DH5a。用萘啶酮酸诱导使重组人IL-10在大肠杆菌中表达，对表达产物进行SDS—PAGE电泳及Western—blot分析。结果人外周血单核细胞经ConA刺激后，IL—10转录水平增加，有利于IL-10 cDNA的克隆；克隆的IL-10 cDNA经测序证实与基因库报告的序列完全一致，插入pMon载体后经萘啶酮酸诱导能够在大肠杆菌DH5a表达；表达的蛋白质能与兔抗人IL—10特异性结合。结论人IL-10 cDNA被成功克隆并能够在大肠杆菌中表达。     

人外周血IL-12 P35 cDNA的巢式PCR扩增、克隆与测序

目的 克隆中国汉族人IL—12P35 cDNA序列，并进行序列测定。方法 利用反转录巢式PCR从健康人外周血总RNA中扩增IL—12P35 cDNA序列，插入T载体PMD—T中，重组质粒转化大肠杆菌JM109，所获克隆经PCR初筛后进行酶切鉴定，阳性克隆进行DNA测序。结果 从健康人外周血总DNA中扩增出约670bp条带，与预期大小相同，PCR与酶切鉴定证明得到PMD／P35阳性克隆，DNA测序证实了插入片段的正确性。结论 在体外成功的扩增、克隆了中国汉族人IL—12P35 cDNA序列。为继续开展IL—12的基础与应用研究奠定了基础。     

人自然杀伤细胞抑制性受体P58.2基因克隆与鉴定

目的：P58．2基因克隆与鉴定。方法：采用RT—PCR技术，从正常人外周血单个核细胞中扩增自然杀伤细胞抑制性受体P58．2基因全长cDNA，经酶切后构建重组克隆载体，双酶切和测序鉴定。结果：RT—PCR获得了预期的扩增产物P58．2全长cDNA，成功构建了pSPORT1-P58．2重组克隆载体，酶切、酶谱分析与预期结果相符。DNA测序结果与GenBank登记的人P58．2cDNA全长碱基序列一致。结论：pSPORT1-P58．2重组克隆载体构建成功；P58．2基因序列与文献报道一致，为下一步构建表达载体和基因转染等工作打下良好的基础。     

人白细胞介素23 p19亚基基因的克隆和序列分析

目的:克隆人白细胞介素-23(IL-23)p19亚基基因。方法:分离健康成年人外周血单个核细胞,常规培养后用脂多糖至终浓度为100 ng/m l刺激增殖12 h,收集细胞并提取细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增人IL-23 p19 cDNA编码基因,克隆至pMD18-T载体,PCR鉴定后进行序列测定。结果:RT-PCR产物电泳结果显示所扩增的基因为734 bp,基因测序显示其序列与GenBank报道的人IL-23 p19基因序列完全一致。结论:成功地克隆了人IL-23 p19 cDNA编码基因。     

猪白细胞介素12 p35、p40亚基基因的克隆和序列分析

目的:克隆猪白细胞介素(IL)-12p35、p40亚基基因,为制备猪囊尾蚴的复合基因疫苗奠定基础。方法:分别分离成年猪的外周血单个核细胞和脾细胞,培养10h后用IFN-γ(100ng/ml)刺激增殖12h,随后加入细菌脂多糖(1μg/ml)刺激培养3h,分别收集细胞并提取细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增猪IL-12p35、p40cDNA编码基因,克隆至pMD18-T载体,经PCR和双酶切鉴定后进行序列测定。结果:猪IL-12p35、p40cDNAPCR产物电泳结果证明所克隆的基因分别为616bp和1011bp,基因测序结果与GenBank报道的基因序列各有一个碱基差异,但编码氨基酸无差异,证实分别为猪IL-12p35、p40cDNA编码基因。结论:成功克隆了猪IL-12p35、p40cDNA编码基因。     

国人白细胞介素16的基因克隆及其序列分析

目的：获得中国IL-16cDNA，供体外表达和转染使用。方法：从组胺刺激的正常人外周血单核细胞中分离总RNA，利用半巢式RT-PCR、T-A克隆等技术得到特异的片段cDNA。结果：序列测定证实，所得片段确实为IL-16cDNA。结论：成功克隆了中国人白细胞介素IL-16cDNA。     

小鼠OX40真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40的真核表达载体。方法从ConA活化的小鼠牌淋巴细胞中提取总RNA，应用RT-PCR方法，扩增获得编码小鼠OX40分子的cDNA，并将其克隆到PUCm-T载体，经PCR、酶切和测序分析证实，进而脂质体法转染HUVECS，G418筛选，RT-PCR法鉴定获得表达OX40分子的阳性细胞株。结果构建的pIRES2-EGFP-OX40重组真核表达载体经PCR、酶切和测序分析，证实该片段与GeneBank记载的小鼠OX40cDNA序列完全一致。筛选获得能表达小鼠OX40蛋白的HUVECs转基因细胞。结论成功构建小鼠OX40转基因细胞，该克隆细胞为进一步研究OX40分子的功能奠定了基础。     

mTOR反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的反义RNA真核表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSNC）功能的影响。方法：提取人VSMC总RNA，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增mTOR基因cDNA序列，经pGEM-T载体克隆后双酶切，将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1，构建mTOR基因反义RNA真核表达载体。转染VSMC，采用Western blot法检验反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：经RT-PCR获得664bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为mTOR基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR，测序证明序列正确后转染VSMC，证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达，VSMC的分裂、增殖过程受阻。结论：已经成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体。     

重组人白细胞介素10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆编码人白细胞介素10（hIL-10）基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中进行表达.方法：应用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体.采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑（MTT）检测hIL-10蛋白的活性.结果：RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功.在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化.结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础.     

IL-3基因cDNA的克隆、测序及其在脐血造血干细胞中的表达

目的:克隆人IL- 3基因cDNA ,构建真核表达质粒并转导脐带血造血干细胞(HSC) ,探讨IL -3在HSC中的表达情况,从而为脐血HSC扩增及移植奠定基础。方法:从人外周血单个核细胞中提取IL -3mRNA ,用逆转录 聚合酶链反应(RT- PCR)扩增IL -3cDNA ,通过T/A克隆法,构建真核表达型载体pcDNA3/IL- 3。将pcDNA3/IL -3质粒转导脐血HSC ,并于1～7d检测IL- 3表达情况。结果:pcDNA3/IL -3重组质粒的插入基因与I-L 3基因序列相同;pcDNA3/IL- 3转导脐血HSC后,经检测能够有效表达。结论:成功克隆了hIL- 3基因cDNA并构建了重组质粒pcD -NA3/IL- 3,该质粒转导脐血HSC后,能在短期内有效表达。     

白细胞介素10基因转染延长移植物存活的研究

目的　克隆大鼠白细胞介素 10 (IL - 10 )的cDNA序列并研究IL - 10基因转染对移植物的保护作用。方法　一步法从脂多糖 (LPS)刺激培养的脾细胞中提取细胞总RNA ,逆转录PCR(RT -PCR)克隆出IL - 10的cDNA。将IL - 10cDNA插入pcDNA3载体进行制备、纯化。建立大鼠异位心脏移植模型 ,在脂质体介导下将pcDNA-IL10重组体通过冠状动脉灌注转染移植心脏。观察移植心脏的存活时间 ,半定量RT -PCR法检测移植心脏IL- 10的转录水平 ,ELISA法检测IL - 10的表达水平。结果　大鼠IL - 10cDNA全长序列被成功克隆 ,序列测定证实与基因库报告的结果完全一致。基因转染的移植心脏平均存活时间明显延长 (17.8天vs 8.5天 ,P <0 .0 1) ;RT-PCR法在对照组未发现IL - 10转录 ,而在基因转染组有 3只移植心脏表现高水平转录 ;基因转染后 3天IL - 10的表达明显增加 (2 70 .8ng Lvs 3 1.5ng L ,P <0 .0 1) ,且移植心脏输出静脉血IL - 10高于外周静脉血 (2 70 .8ng Lvs 163 .5ng L)。结论　通过冠状动脉灌注能够进行基因转染 ,IL - 10基因转染可以延长移植心脏的存活时间     

高滴度表达抑制转录因子的重组腺相关病毒的制备

目的 获得表达小鼠抑制转录因子ROG(repressor of GATA-3)基因；构建表达ROG的重组腺相关病毒载体，制备腺相关病毒。方法 设计、合成引物，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从CTLL-2细胞总RNA中扩增ROG基因，测序成功后，最终连接于pAAV-MCS，双酶切、PCR鉴定阳性重组质粒，并在Hela细胞中表达；制备高滴度重组腺相关病毒。结果 成功扩增了小鼠ROG基因，构建表达ROG基因的重组腺相关病毒表达载体，并成功表达于Hela细胞。结论 本实验构建的小鼠ROG重组腺相关病毒将为哮喘的基因治疗研究奠定物质基础。     

端粒酶抑制剂筛选模型诱饵载体的构建与转化

目的构建含不同人端粒酶RNA基因片段的诱饵融合表达载体并转化酵母,用于酵母三杂交方法筛选端粒酶抑制剂。方法采用RT—PCR方法从肿瘤细胞中扩增人端粒酶RNA（hTR）基因后,分别扩增hTR基因假结合体区CR4-CR5及H／ACA和CR7区hTR基因片段,纯化分离定向克隆到pRH3诱饵质粒,构建包含不同hTR目的基因片段的重组质粒,转化大肠杆菌,经PCR、酶切、测序鉴定后,将阳性重组质粒转化酵母菌,进行毒性自激活检验。结果测序结果证实,含不同hTR基因片段诱饵重组质粒pRH3-hTR构建成功,转化酵母后无毒性和自激活性。结论成功构建了酵母三杂交系统诱饵载体,可于酵母三杂交系统筛选端粒酶抑制剂及在酵母中研究hTERT和hTR间的相互作用．     

镉和镍恶性转化16HBE上调基因eIF3 p36的克隆与序列

目的分析镉和镍恶性转化16HBE（人支气管上皮细胞）成瘤细胞株中翻译起始因子eIF3 p36基因序列的变化情况，探讨镉、镍重金属的致癌分子机制。方法取正常对照16HBE细胞、氯化镉（CAC12）和结晶型硫化镍（NiS）恶性转化的16HBE细胞，用有限稀释法分别建立单细胞克隆株，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）获得目的基因翻译起始因子eIF3 p36的eDNA，将目的基因产物连接到T载体中，转化、扩增重组质粒。提取大肠杆菌中的重组质粒进行DNA测序。将三组DNA测序所得到的基因序列进行对比分析。结果镉、镍转化组各细胞株（各10株）翻译起始因子的eIF3 p36 cDNA测序结果与正常对照细胞（10株）比较未发现基因的突变位点；所有镉、镍转化细胞和正常对照细胞株eIF3 p36 cDNA序列与Genbank数据库进行同源性分析，相似性比值均为100％。结论实验中镉、镍恶性转化16HBE细胞中翻译起始因子eIF3 p36上调未见基因序列改变，提示在镉、镍致癌中可能涉及到表遗传机制。     

重组人SMAC及SMAC-PTD的制备

目的制备重组人SMAC及SMAC-PTD.方法经RT-PCR从人HeLa细胞中扩增人野生型SMAC及SMAC-PTD cDNA,分别构建于原核表达质粒pET28a( ),测序正确后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2 -NTA层析纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白.结果RT-PCR扩增分别得到编码人SMAC及SMAC-PTD cDNA片断,测序结果正确,重组蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达.结论成功制备了高纯度的人野生型SMAC及SMAC-PTD融合蛋白,为进一步研究奠定了基础.     

分子克隆人血小板生成素基因

目的：克隆人血小板生成素基因，方法：采用ＲＴ一ＰＣＲ的方法。结果：从人胎肝中克隆出全长的血小板生成素（ＴＰＯ）基因，并亚克隆至ＰＵＣｌｌ８载体中。该ｃＤＮＡ全长１０６２ＢＰ，编码３５３个氨基酸，经序列测定与Ｂａｒｔｌｅｙ等人报道的完全一致［１］。结论：已获得人血小板生成素基因，此项工作为基因工程生产ＴＰＯ奠定了良好基础。     

人白细胞介素－6受体cDNA的克隆

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从人的外周血单个核细胞中扩增出人ＩＬ－６受体的特异性ｃＤＮＡ片段，经琼脂糖电泳证实扩增片段大约为１４００碱基对。运用ＤＮＡ重组技术，将获得的片段连接到ＰＵＣ１８质粒中，经转化、筛选、酶切鉴定构建出重组质粒ｐＵＣＩＬ－６受体；经序列分析证实为编码人ＩＬ－６受体的ｃＤＮＡ片段。