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1.
目的:克隆大鼠白细胞介素-10(IL-10)cDNA的全长序列,为其分子生物学利用奠定基础,方法:无菌条件下切取大鼠的脾脏,收集脾细胞,用脂多糖(LPS)刺激培养4h离心得到一定量细胞,加入变性液,一步法提取细胞总RNA;逆转录合成IL-10的第1条链,用自己设计的特异性上下游引物进行PCR扩增,得到期望相对分子质量的PCR产物;酶切后插入pcDNA3载体,转染感受态细胞进行筛选制备,并行PCR、酶切鉴定和测序。结果:脾细胞经LPS刺激后IL-10转录水平增加,从提取的RNA转录产物中容易扩增出期望相对分子质量的PCR产物,酶切和PCR鉴定证明所得IL-10cDNA相对分子质量与其因库报告的相近,测序表明得到的IL-10cDNA充阢与基因库报告的序列完全一致,结论,大鼠的IL-10cDNA全长序被成功克隆。 相似文献
2.
应用RT-PCR技术座人的外周血单个核细胞中扩增出人IL-6受体的特异性cDNA片段,经琼脂糖电泳证实扩增片段大约为1400碱基对。运用DNA重组技术,将获得的片段连接到pUC18质粒中,经转化,筛选,酶切鉴定构建出重组质粒pUCIL-6受体。 相似文献
3.
人白细胞介素10的克隆及分泌表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:研究人白细胞介素10(hIL-10)的高效分泌表达。方法:根据Genbank报道的hIL-10基因序列,人工合成hIL-10基因,并将某些稀有密码子替换成E.Coli偏爱密码子,克隆至pUC18质粒中,测序结果与预期一致,将hIL-10基因克隆至PET22b,构建分泌表达克隆PET22b-hIL-10,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达hIL-10天然蛋白。结果:SDS-PGAE电泳及凝胶密度扫描分析显示,重组蛋白分子量约为18KD和21KD(含信号肽),不同温度条件下重组蛋白的表达状态和表达量不同,结论:18摄氏度重组蛋白hIL-10的表达量为7.6%。 相似文献
4.
人白细胞介素-10 cDNA的克隆、测序和真核表达载体的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 克隆、测序人白细胞介素-10 cDNA开放阅读框架。方法 刀豆蛋白A活化的人外周血核细胞培养后用于提取总RNA,以随机引物行逆转录反应合成hIL-10 cDNA第一链,并以hIL-10 特异性引物行PCR扩增,将PCR产物克隆至pUC18中测序并构建真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。结果 PCR扩出550bp特异性片段,经克隆至pUC18后测序表明序列同源性与GenBank报道完全一致,并克隆鉴定了真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。结论 成功克隆了人白细胞介素-10 cDNA开放阅读框架,序列分析证实与GenBank录入序列同源性达100%,并成功构建了真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。 相似文献
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人白细胞介素18cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达 总被引:1,自引:0,他引:1
获得IL-18全长cDNA序列,研究IL-18在大直菌中的表达。方法利用RT-PCR方法人人外周血单个核细胞中扩增出人白细胞介素的cDNA,以Sanger双脱氧法测序。 相似文献
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目的:克隆编码人白细胞介素10(hIL-10)基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行表达.方法:应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体.采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑(MTT)检测hIL-10蛋白的活性.结果:RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功.在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化.结论:成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础. 相似文献
7.
目的克隆人IL-10 cDNA的全长序列,构建原核表达载体并诱导其表达。方法无菌条件下静脉采取正常人外周血10ml。加入等体积的生理盐水稀释后,加入淋巴细胞分离液,离心收集细胞,提取细胞总RNA。以细胞总RNA为模板,进行RT—PCR,克隆出IL-10 cDNA,经双酶切后插入表达载体pMon中,用pMon—IL10重组体转染大肠杆菌DH5a。用萘啶酮酸诱导使重组人IL-10在大肠杆菌中表达,对表达产物进行SDS—PAGE电泳及Western—blot分析。结果人外周血单核细胞经ConA刺激后,IL—10转录水平增加,有利于IL-10 cDNA的克隆;克隆的IL-10 cDNA经测序证实与基因库报告的序列完全一致,插入pMon载体后经萘啶酮酸诱导能够在大肠杆菌DH5a表达;表达的蛋白质能与兔抗人IL—10特异性结合。结论人IL-10 cDNA被成功克隆并能够在大肠杆菌中表达。 相似文献
8.
人白细胞介素17cDNA的克隆及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 获取重组的人白细胞介素17以进行科学研究和应用。方法 应用RT-PCR的方法,从经PHA活化的人外周血单个核细胞中扩增hIL-17cDNA的编码序列,将其克隆至测序载体pBS SKⅡ( )中进行测序,再将其亚克隆至表达载体pBV220中,在大肠杆菌XL1-Blue中进行表达。结果 克隆获得了hIL-17cDNA,经热诱导后使hIL-17蛋白在大肠杆菌中的表达量达到了39.7%。结论 通过克隆hIL-17cDNA的编码序列及热诱导使hIL-17蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。 相似文献
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人白细胞介素18(hIL—18)的cDNA基因克隆及序列测定 总被引:5,自引:1,他引:5
目的:克隆人白细胞介素18(IL-18)全长cDNA基因,进一步探讨人白细胞介素18的功效。方法:采用RT-PCR的方法从人肝组织中扩增出人白细胞介素18(IL-18)基因,并克隆到真核表达的绿色荧光蛋白报告载体pEGFP-NI中,结果:经PCR及DNA序列测定得以证实其序列与文献报导一致,结论:该实验成功地克隆了IL-18cDNA,并将其重组构建了含有IL-18cDNA的真核表达载体pEGFP-N1-IL18。 相似文献
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Humancalcitonin(hCT)isanoligo--peptidehormonecontaining32aminoacidresidues(aa)whichisproducedbytheC--parafollicularcellsofthethyroidglandinhumans.Togetherwiththearathyoidichormoneand1,25--dihydroxycholecalciferol,hCTplaysanimportantroleintheregulationofcalciumandphosphatemetabolism.Itstimulatestheimmobilizationofthecalciuminthebonesystem,preventingtheresorptionofthebones.ThehCThasbeenadministeredfortreatmentofpatientssufferingfromvariousdiseaseswherestronghypercalcemiaorboneresorptionoccurs… 相似文献
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人白细胞介素7基因克隆及其真核表达载体的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:构建人白细胞介素7(hIL-7)的真核表达载体。方法:从人脾脏组织的总RNA中,用RT-PCR方法扩增出编码成熟hIL-7的cDNA,将其克隆于pMD18-T质粒中,并进行序列测定。再将hIL-7cDNA以正义及反义插入真核、原核双重表达载体pBK-CMV质粒,转化至大肠杆菌DH5α。最后将表达的lacz-hIL-7重组蛋白行SDS-PAGE电泳,并作考马斯亮蓝染色分析,western blot鉴定。结果:hIL-7序列测定结果与预期一致。pBK-CMV-hIL-7(正义插入)的无隆表达重组蛋白,western blot证实此蛋白为IL-7。结论:成功构建了hIL-7的真核表达载体,为进一步研究hIL-7的抗肿瘤作用创造了条件。 相似文献
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人IL-10基因重组复制缺陷型腺病毒DNA的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 构建人IL-10基因的重组腺病毒并进行体外表达和检测。方法从质粒pcDNA3IL-10的CMV启动子下游完整切下IL-10 cDNA的片段,将其定向插入Gateway载体,在克隆酶的作用下将阳性克隆质粒转入目的腺病毒载体。PacI酶线性化IL-10腺病毒DNA后阳离子质脂体转染293A细胞,获得人IL-10的复制缺陷型重组腺病毒。体外感染人胰腺癌细胞株Bxpc-3和大鼠胰腺细胞株AR-42J;Western blot检测人IL-10的表达。结果 成功地构建人IL-10重组腺病毒,病毒滴度达2×109PFU/mL。体外感染的细胞株均检测到IL-10的表达。结论 构建复制缺陷型重组腺病毒能够介导IL-10的基因表达,为细胞因子的抗炎冶疗奠定实验基础。 相似文献
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目的研究人白细胞介素10(hIL-10)cDNA重组质粒的转染和表达,为以后的基因治疗研究奠定基础。方法构建hIL-10 cDNA真核表达重组质粒pcDNA3-hIL-10后进行酶切和测序鉴定。以SA脂质体介导对照质粒pcDNA3及重组质粒pcDNA3-hIL-10转染COS7细胞和SD大鼠,用ELISA方法检测COS7细胞培养液及大鼠胰腺、肺和肝脏组织中hIL-10的含量。结果用pcDNA3-hIL-10质粒转染COS7细胞48 h后,在培养液中检测到hIL-10蛋白浓度为38 000 pg/mL,而对照组仅为55 pg/mL。hIL-10基因转染24 h后大鼠胰腺、肺和肝脏组织hIL-10的产生量达到峰值,以后逐渐下降,至96 h仍显著高于对照组(P〈0.05),1周后降至正常水平。结论本研究构建的pcDNA3-hIL-10重组质粒可以在真核细胞及大鼠体内高效表达。 相似文献
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人降钙素cDNA的化学合成与克隆 总被引:1,自引:2,他引:1
目的;克隆人降钙素cDNA。方法和结果;应用ABI391DNA合成仪,将人降钙素cDNA分成6个片段合成。退火、磷酸化,连接,最终将人降钙素cDNA克隆于载体pGEM7Z(+),经DNA双链测离,证明克隆利的人降钙素cDNA序列与设计的完全一致。结论;本研究为寡肽cDNA的化学合成与克隆提供了简捷、可靠的方法;为人的降钙素DNA的主效表达奠定了基础。 相似文献
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目的 克隆大鼠白细胞介素 10 (IL - 10 )的cDNA序列并研究IL - 10基因转染对移植物的保护作用。方法 一步法从脂多糖 (LPS)刺激培养的脾细胞中提取细胞总RNA ,逆转录PCR(RT -PCR)克隆出IL - 10的cDNA。将IL - 10cDNA插入pcDNA3载体进行制备、纯化。建立大鼠异位心脏移植模型 ,在脂质体介导下将pcDNA-IL10重组体通过冠状动脉灌注转染移植心脏。观察移植心脏的存活时间 ,半定量RT -PCR法检测移植心脏IL- 10的转录水平 ,ELISA法检测IL - 10的表达水平。结果 大鼠IL - 10cDNA全长序列被成功克隆 ,序列测定证实与基因库报告的结果完全一致。基因转染的移植心脏平均存活时间明显延长 (17.8天vs 8.5天 ,P <0 .0 1) ;RT-PCR法在对照组未发现IL - 10转录 ,而在基因转染组有 3只移植心脏表现高水平转录 ;基因转染后 3天IL - 10的表达明显增加 (2 70 .8ng Lvs 3 1.5ng L ,P <0 .0 1) ,且移植心脏输出静脉血IL - 10高于外周静脉血 (2 70 .8ng Lvs 163 .5ng L)。结论 通过冠状动脉灌注能够进行基因转染 ,IL - 10基因转染可以延长移植心脏的存活时间 相似文献
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白细胞介素-10对人树突状细胞表型及致炎细胞因子分泌的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 观察白细胞介素(IL)-10对体外培养人树突状细胞(DC)表型和致炎细胞因子IL-12分泌的影响,探讨IL-10对DC炎性成熟过程中的负调节作用。方法 通过SCF、GM-CSF、TGF-β、Flt-3和TNF-α体外培养体系,从脐血CD34造血干细胞中诱导扩增获得DC,并于细胞成熟中用重组人IL-10进行干预。流式细胞仪分析细胞表型CD1a、CD11c、CD83、CD80、CD86和HLA-DR;RT-PCR检测IL-12 p35、p40mRNA表达;ELISA法测定IL-12 p70分泌的含量。结果 IL-10可下调成熟中DC表面CD11c、CD83、CD80和CD86的表达,同时可抑制DC内IL.12p35、p40mRNA的转录和IL-12p70的分泌。结论 IL-10可抑制DC黏附共刺激分子表达和致炎细胞因子的合成,提示其不仅可调抑DC的递呈抗原功能,且参与了炎症局部微环境的调节。 相似文献