磁共振活体示踪经冠状动脉骨髓间充质干细胞移植:验证其与病理组织学结果的一致性

背景:目前动物实验及临床研究证明经冠状动脉移植骨髓间充质干细胞可改善心肌梗死后的心脏功能,但骨髓间充质干细胞经冠状动脉移植后能否到达心肌梗死部位仍存在争议.目的:磁共振活体示踪经冠状动脉注射的骨髓间充质干细胞能否到达心肌梗死部位.方法:全骨髓法分离培养猪骨髓间充质干细胞,超顺磁性氧化铁标记后胰酶消化,调整细胞浓度为10~(10)L~(-1).10只猪均建立心肌梗死模型,造模后1周通过OTW球囊导管经冠状动脉将标记好的骨髓间充质干细胞悬液定向移植至梗死区.普鲁士蓝染色评价细胞标记效率,采用快速梯度回波序列完成长轴位四腔心和二腔心扫描,在以长轴位四腔心和二腔心为定位相,垂直于室间隔获得左心室短轴位图像.结果与结论:超顺磁性氧化铁可安全有效标记骨髓间充质干细胞,经冠状动脉注射的骨髓间充质干细胞能到达心肌梗死区及交界区,磁共振能示踪到超顺磁性氧化铁标记的骨髓间充质干细胞,示踪结果与病理组织学检查一致,且磁共振示踪时间可长达5周.     

以CM-Dil作为骨髓干细胞移植示踪剂的可行性术

背景:供体细胞的示踪始终是干细胞移植研究中面临的一个重要问题,以往用于干细胞移植的示踪技术主要有核素、5-溴脱氧尿嘧啶核苷、绿色荧光蛋白、Hoechst和荧光原位杂交等.目的:探讨CM-Dil作为骨髓干细胞移植示踪剂的可行性和示踪效果.设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2004-10/2007-12在中山大学附属第一医院神经科实验室完成.材料:四五周龄雄性DL小鼠80只为供体,2月龄遗传性肝功能障碍模型TX小鼠40只为受体,均由澳大利亚Dean教授馈赠.CM-Dil为Molecular Probes公司产品.方法:全骨髓法体外分离培养供体鼠骨髓干细胞,加入CM-Dil行荧光标记,无菌条件下经尾静脉注入已放疗的受体鼠体内,注射悬液量为0.2 mL/只,细胞数1.2×107个/只,于移植后不同时间取肝脏标本制备切片.主要观察指标:荧光倒置显微镜下观察CM-Dil标记细胞情况,流式细胞仪测定荧光标记率.供体细胞移植后在受体鼠肝脏的示踪.PCR半定量分析供体细胞在受体鼠肝脏中的比例.结果:荧光显微镜下CM-Dil标记的骨髓干细胞呈红色荧光,CM-Dil标记率为99.9%.在受体鼠肝脏组织内,CM-Dil的荧光在移植后第1天即可看到,渐增多,第4周达高峰,后渐下降.移植后第7天可检测到Sry基因,随后其变化趋势同CM-Dil荧光.结论:CM-Dil是良好的骨髓干细胞移植示踪剂,第4周时示踪效果最为显著.     

PKH-26标记骨髓间充质干细胞气管移植的体内示踪

背景:PKH-26已经被成功应用于标记骨髓间充质干细胞并进行体内示踪。目的:通过气管移植合并静脉移植PKH-26标记的骨髓间充质干细胞评价PKH-26的示踪效果,并检测骨髓间充质干细胞在体内向受损组织的迁移情况。方法:用贴壁法进行骨髓间充质干细胞的原代细胞培养,以PKH-26标记3～5代骨髓间充质干细胞经鼠尾静脉移植入气管移植的受体大鼠体内,用等量的PBS注射作为实验对照。结果与结论:用PKH-26进行细胞骨髓间充质干细胞标记后,荧光显微镜下观察可见几乎所有骨髓间充质干细胞均有红色荧光。移植后8周仍可见受体气管和移植气管处有红色荧光标记。远离吻合口的受体气管基本未见红色荧光标记物。结果表明骨髓间充质干细胞经静脉移植后,可向损伤的气管组织迁移并定植,而且可随移植气管的血管化逐渐由受体气管切缘向移植气管迁移,最后可定植于移植段气管。PKH-26的红色荧光标记稳定性高,是可应用于长期观察的无降解的荧光标记物。     

超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞心肌活体示踪及体外实验☆

背景:活体示踪移植干细胞,影像学评估移植细胞动态变化的趋势是目前的热点研究方向。目的:探讨MRI活体示踪超顺磁性氧化铁标记的骨髓间充质干细胞移植修复心肌的可行性及有效性。方法:经导管应用球囊封堵前降支动脉建立家猪心肌梗死模型,造模成功的动物随机分为2组:实验组在造模2周后于梗死区中央及梗死边缘区共5个点注射超顺磁性氧化铁-多聚赖氨酸混合物标记的骨髓间充质干细胞悬液1mL,对照组以同样方法注入等量的生理盐水。结果与结论:细胞移植后1h,2周,实验组中4只动物(100%)移植区在磁共振上呈明显的低信号改变,移植后4周示3只动物(75%)细胞移植区有低信号改变。移植后4周,心肌组织荧光免疫组化检测心脏结蛋白、心脏连接蛋白和心肌早期转录蛋白均有表达。结果可见应用MRI技术活体示踪动态观察移植的骨髓间充质干细胞是可行有效的。     

CM-Dil体外标记人脐带间充质干细胞传代示踪的可行性

背景: 掌握人脐带间充质干细胞的移植示踪方法是研究其生物学特性的关键.目的: 观察用CM-Dil标记人脐带间充质干细胞及在体外传代示踪的可行性.方法: 采用酶消化法体外分离培养人脐带间充质干细胞,通过流式细胞仪检测细胞免疫表型和细胞周期、体外成脂成骨诱导鉴定该细胞.将第5代细胞用CM-Dil标记,并将细胞传代,荧光显微镜观察体外标记情况.结果与结论: 第3代人脐带间充质干细胞强表达CD44,CD29,低表达CD106,不表达CD34、CD40;有80%以上的细胞处在G0/G1期,成脂成骨诱导后,油红O染色和碱性磷酸酶染色分别阳性.CM-Dil标记人脐带间充质干细胞细胞标记率达90%以上,体外传代后荧光强度逐渐减退,传8代后,荧光基本消失.说明人脐带间充质干细胞增殖、分化能力强,CM-Dil标记细胞示踪方法简单易行.     

PKH-26标记骨髓间充质干细胞气管移植的体内示踪

背景：PKH-26已经被成功应用于标记骨髓间充质干细胞并进行体内示踪。目的：通过气管移植合并静脉移植PKH-26标记的骨髓间充质干细胞评价PKH-26的示踪效果,并检测骨髓间充质干细胞在体内向受损组织的迁移情况。方法：用贴壁法进行骨髓间充质干细胞的原代细胞培养,以PKH-26标记3～5代骨髓间充质干细胞经鼠尾静脉移植入气管移植的受体大鼠体内,用等量的PBS注射作为实验对照。结果与结论：用PKH-26进行细胞骨髓间充质干细胞标记后,荧光显微镜下观察可见几乎所有骨髓间充质干细胞均有红色荧光。移植后8周仍可见受体气管和移植气管处有红色荧光标记。远离吻合口的受体气管基本未见红色荧光标记物。结果表明骨髓间充质干细胞经静脉移植后,可向损伤的气管组织迁移并定植,而且可随移植气管的血管化逐渐由受体气管切缘向移植气管迁移,最后可定植于移植段气管。PKH-26的红色荧光标记稳定性高,是可应用于长期观察的无降解的荧光标记物。     

经冠状动脉内注射体外培养骨髓间充质干细胞的安全性

目的:经冠状动脉内移植可以使移植细胞均匀的分布在移植血管相关心肌组织内,同时避免了心肌内注射引起的心肌损伤,是目前很多临床试验采用的移植途径.然而部分学者指出冠状动脉内注射移植可能会导致心肌梗死等并发症.观察经介入途径将骨髓间充质干细胞注射到心肌梗死猪冠状动脉内的可行性及安伞性.方法:实验于2005-06/2006-03在中国协和医科大学阜外心血管病医院、卫生部心血管病再生医学重点实验室完成.①实验材料:中华小型猪由中国农业大学实验动物基地提供,雌性,6个月龄.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:采用密度梯度离心法分离猪骨髓单个核细胞获取骨髓间充质干细胞,并采用超顺磁性氧化铁颗粒和荧光细胞膜标记物CM-DiI进行双重标记.阻断冠状动脉前降支中下1/3处90 min后开放制作猪心肌梗死模型.通过导管将骨髓间充质干细胞注射到心肌梗死模型动物的冠状动脉内,观察心电图及肌钙蛋白I在细胞移植后不同时期的变化,应用心脏磁共振在体示踪移植细胞在心脏内的分布,评价心脏形态和功能在细胞移植前后的变化,病理检查分析移植细胞在心肌组织内的分布以及体内非靶器官的再分布情况及组织形态改变.结果:①冠状动脉内移植骨髓间充质干细胞当时及24h后,心电图未见ST-T明显改变,肌钙蛋白未见明显升高.细胞移植后当时及24 h后左室舒张末期容积、左室收缩末期容积未见明显增大,左心室射血分数未见降低.移植后2周心脏功能明显改善,左心室容积明显缩小,左心室射血分数明显升高.②细胞移植前、移植后24 h、移植后2 d,反映心肌损伤的肌钙蛋白I均未出现明显升高,细胞移植过程中心电图未出现明显的变化.③病理检查发现移植细胞在心肌组织内均匀分布,2周后可见移植细胞在梗死区域存活,移植细胞存在向肺、肝、肾等非靶器官的再分布,移植细胞对非靶器官的组织形态无明显影响.结论:实验证明经冠状动脉内移植的骨髓间充质干细胞能够均匀的分布到相关心肌组织内,不会造成梗死心肌组织的功能损伤,并可以明显改善梗死心肌功能,对非靶器官组织形态无明显影响,经冠状动脉内移植骨髓间充质干细胞治疗猪急性心肌梗死是安全可行的.     

改良小鼠骨髓间充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性

背景:小鼠骨髓间充质干细胞培养不同于人及大鼠,培养扩展难度高,传代后干细胞活性保持时间短;又鉴于干细胞本身特点,使现有干细胞示踪方法作用时间短,这些因素均影响小鼠骨髓间充质干细胞的实验研究.目的:观察改良小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法及长效荧光标记干细胞的可行性.设计、时间及地点:观察性实验,于2008-06/12在解放军军事医学科学院完成.材料:C57BU6小鼠4～6周龄.体质量20g,雌雄不拘.方法:通过贴壁筛选和Percoll分离法,优化干细胞培养液血清和换液方式,培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞.参照以往人和猕猴间充质干细胞培养经验,对小鼠间充质干细胞培养血清选择Hyclone的顶级胎牛血清,控制血清为培养液的10%.用LG-DMEM培养液冲出骨髓细胞后,滤去骨渣和小肌肉碎块.然后加在相对密度1.082的percoll分离液上,以1.5×10~6/cm~2浓度接种75 cm~2培养瓶.对第2代骨髓间充质干细胞进行长效CM-Dil标记.主要观察指标:原代及传代小鼠骨髓间充质干细胞形态变化;对第2代小鼠骨髓间充质干细胞表面抗原,CD105,CD44,CD25,CD34进行流式细胞仪检测,评价改良方法获取干细胞纯度;通过成脂成骨分化,鉴定小鼠骨髓间充质干细胞的活性;观察多次传代后荧光细胞强度.结果:①小鼠骨髓间充质干细胞原代培养在接种48 h后可见贴壁细胞,培养第7天细胞多数伸展呈梭形,也有三角形,多角形和扁平形.3代后形态趋于统一,融合状态时细胞排列呈束状、漩涡状或放射状.②骨髓间充质干细胞特异性抗原高表达CD105,CD44;造血系抗原低表达CD34和CD45.③骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中,纺锤形的突起逐渐消失,胞体增大,培养10 d后,部分细胞呈聚集生长,随细胞生长密度的增长形成多层的结节结构.在脂肪诱导体系中,可见细胞由成纤维样逐渐缩短,9 d后胞浆中出现脂肪滴,油红O染色可见红色的脂肪颗粒.④首次标记,荧光显微镜观察可见长效CM-Dil标记在细胞膜发橙色光,标记率在80%以上.流式细胞仪检测CM-Dil细胞标记率可到47%以上,第4代培养细胞仍可见较多标记细胞.结论:改良方法早期第2代就可获得高浓度干细胞,同时长效CM-Dil标记方法稳定,标记率高,可作体内细胞示踪.     

MRI活体示踪心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞的移植

背景：干细胞移植的疗效和安全性评估均需要对体内干细胞的存活、分布、迁徙、增殖及分化进行连续监测。目的：观察MRI示踪超顺磁性氧化铁标记的骨髓间充质干细胞在缺血心肌组织的分布、迁徙情况。方法：直接贴壁法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞,获得的细胞进行免疫鉴定。以新型超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞,体外MRI成像确定其体内示踪的可行性。标记后锥虫蓝拒染试验、MTT比色试验分别检测标记细胞的活力、增殖情况。60只SD大鼠随机分为3组,制备大鼠心肌梗死模型2周后再次开胸移植含标记骨髓间充质干细胞的PBS混合液、含未标记骨髓间充质干细胞的PBS混合液和等量PBS。于移植后第1天、第3周行MRI检查,动态观察移植细胞的分布、迁徙,并根据MRI图像定位选择性行CD90免疫组化检查。结果与结论：骨髓间充质于细胞标记后,普鲁士蓝染色见胞浆内蓝色铁颗粒,标记效率为99％,标记细胞与未标记细胞间锥虫蓝拒染率、MTT吸光度差异无显著性意义。体外MRI可检测到标记细胞,并在T2WI及T2W／FFE序列上呈低信号。细胞移植1d后,在T2WI及T2W／FFE序列上可见标记细胞在梗死心肌边缘呈类圆形低信号;移植3周后,移植区域信号边界模糊,范围扩大,对比度降低。CD90免疫组化检测证实移植细胞可由梗死边缘向梗死区域迁徙。结果可见新型超顺磁性氧化铁可成功对大鼠骨髓间充质干细胞进行标记,细胞标记后可被MRI检测。     

大鼠骨髓间充质干细胞的PKH26标记和示踪

背景：骨髓间充质干细胞标记是体内迁移分化研究的重要环节。目的：对大鼠骨髓间充质干细胞进行PKH26标记,探讨PKH26标记对骨髓间充质干细胞的生长特征、分化的影响及体内示踪情况。方法：培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞,第2代细胞按PKH26标记程序进行细胞标记,观察标记组和未标记组细胞的增殖、周期和凋亡情况,对标记组细胞行成骨成脂体外诱导分化。尾静脉移植PKH26标记细胞,6周后荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞在子宫内膜的分布情况。结果与结论：PKH26标记对细胞增殖、凋亡和周期无明显影响,不影响成骨成脂诱导分化。子宫内膜组织中PKH26标记阳性的细胞分布于腺上皮和间质细胞。PKH26标记技术可用于示踪骨髓间充质迁移转归和干细胞移植方面的实验研究。     

CM-DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外体内的示踪观察

目的建立骨髓间充质干细胞（BMSCs）的一个简单、有效的标记和示踪方法并对BMSCs移植治疗心肌梗死作初步观察，为进一步的研究提供依据。方法应用CM—DiI细胞标记液标记第三代大鼠BMSCs，应用荧光显微镜对标记的细胞进行体外示踪观察；8只SD大鼠，制作急性心肌梗死模型，将已标记CM—DiI的BMSCs经心肌注射途径移植给急性心肌梗死模型大鼠，在移植后1周、2周、3周、4周分别取心肌组织行冰冻切片，并在荧光显微镜下观察移植细胞；于移植后4周应用免疫组织化学法检测移植细胞心肌缝隙连接蛋白43（connexin 43）的表达。结果CM-DiI标记大鼠BMSCs效率达100％，标记后BMSCs生长和增殖特性未受影响，形态无改变，经过传代培养14d仍然保持较清晰的红色荧光。已标记细胞在大鼠心梗模型心肌内移植后1周、2周、3周、4周，心肌组织冰冻切片可找到移植细胞，CM—DiI与BMSCs结合稳定，荧光标记效果维持一个月无明显衰退，免疫组化切片显示移植细胞少量表达connexin43。结论CM—DiI细胞标记液标记BMSCs，对细胞生长特性无影响，操作简单，标记效果好，BMSCs移植到梗死心肌4周后仍存活，并少量表达心肌特异性蛋白connexin43。CM—DiI标记细胞法可用于进一步的BMSCs移植治疗心肌梗死的研究。     

不同种类超顺磁性氧化铁标记猪骨髓间充质干细胞的体外MR成像

背景:干细胞磁性标记是新近开展的一项干细胞体外标记技术,结合MR成像设备可以活体监控移植入体内的干细胞.目的:明确超顺磁性氧化铁粒子体外标记猪骨髓间充质干细胞的方法、不同种类超顺磁性氧化铁标记细胞经MR成像的特征及可成像的最低标记细胞量.设计、时间及地点:对比观察,于2006-09/2007-03在苏州大学医学部心血管外科实验室及苏州大学附属第一医院影像中心完成.材料:猪髂骨骨髓由太湖梅山猪新鲜采集:超顺磁性氧化铁纳米颗粒为德国Schering公司产品;超微型超顺磁性氧化铁纳米颗粒由苏州大学化学与化工学院提供:铁颗粒晶核表面包被葡聚糖,3种超微型超顺磁性氧化铁包被葡聚糖后根据颗粒大小(12,15,20 nm)分别依次简称为1#,2#,3#.方法:分离、纯化、培养猪骨髓间充质干细胞,体外进行不同种类超顺磁性氧化铁标记,染色及荧光显微镜观察;测量并绘制未标记细胞和标记细胞的MTT生长曲线;选取不同的细胞量组(Feridex标记细胞分别选取1×106、5×105及1×105L-1量组,未标记细胞选取5×105L-1量组,1#、2#及3#超微型超顺磁性氧化铁标记细胞均选取5×105L-1量组)进行标记后MR成像,测量不同扫描序列标记细胞管的信号强度改变,并进行统计学分析.主要观察指标:超顺磁性氧化铁标记干细胞的普鲁士蓝染色检测标记率:标记干细胞的MTT生长曲线;双染色法检测细胞凋亡;不同Ependoff管内细胞团T1WI、T2WI和FFE图像的信号强度.结果:应用多聚赖氨酸介导干细胞磁标记方法标记骨髓间充质干细胞有效率为100%,普鲁士蓝染色见细胞浆内有多少不等的蓝染铁颗粒;超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在T2WI尤其是FFE(T2WI)序列信号明显降低;在25 mg/L Fe培养液标记浓度下,MR成像的最低细胞量为1×105;在不同种类超顺磁性氧化铁标记下,2#、3#USPIO与Feridex在T2WI及T2*WI上有显著性差异(P<0.01);而1#USPIO与Feridex在T2WI及T2WI上差异无显著性意义(P>0.05):Feridex标记间充质干细胞在T2WI及T2WI上与T1WI相比,差异均有显著性意义(P<0.01).结论:超顺磁性氧化铁可以简便标记间充质干细胞并且在适当浓度下对间充质干细胞的生物学活性没有影响,MR T2WI和T2*WI序列可敏感显像磁性标记的干细胞.     

CM-Dil及DAPI联合标记示踪人脐血单核细胞细胞膜及细胞核的可行性

背景：氯甲基-1,1十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基-吲哚-羧花青-高氯酸盐（chlormethylbenzamido-1,1-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylin-docarbocyamine,CM-DiI）和4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）是常用的活细胞示踪剂,分别用来标记细胞膜和细胞核。目的：观察应用细胞膜及细胞核标记物CM-DiI及DAPI联合示踪人脐血单核细胞的可行性及双标后人脐血单核细胞体外培养过程中细胞形态及活性的变化。方法：将新鲜分离的人脐血单核细胞用示踪剂CM-DiI及DAPI进行双标记,体外培养双标后的人脐血单核细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,锥虫蓝染色检测不同时间细胞活性,同时倒置荧光显微镜观察不同时间经CM-DiI和DAPI双标的人脐血单核细胞荧光染色阳性数。结果与结论：人脐血单核细胞在CM-DiI和DAPI联合标记15min后,荧光显微镜下可见标记细胞的细胞膜、细胞核分别在不同波长下分别呈现红色和蓝色的荧光。CM-DiI/DAPI双标后的人脐血单核细胞体外培养1,3,7,14,21d,CM-DiI和DAPI双染的阳性细胞数各时间点比较差异无显著性意义。锥虫蓝染色观察人脐血单核细胞存活率为95.6%-98.8%。双标后的人脐血单核细胞体外培养过程中细胞形态变化与未经示踪标记的脐血单核细胞相比差异不明显,仍保持了良好的生长状态、贴壁能力和细胞增殖能力。由此证实,CM-DiI和DAPI可有效标记人脐血单核细胞,两种示踪剂对活细胞无毒不良反应,荧光衰减较慢,适用于干细胞标记及示踪。     

猪骨髓间充质干细胞超顺磁性氧化铁标记方法的实验研究

目的：探索超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIO）标记猪骨髓间充质干细胞（MSCs）的合适方案。方法：分离培养猪MSCs,用不同SPIO浓度、不同共孵育时间进行标记,根据标记效率指标（普鲁士蓝染色、细胞铁浓度测定、细胞透射电镜检查）和标记毒性指标（台盼蓝排除试验、CCK-8试验）确定适宜的标记条件,然后对不同标记细胞进行磁共振（MR）体外成像。结果：（1）随着SPIO浓度的增加,MSCs细胞内平均含铁量相应升高;细胞涂片普鲁士蓝染色也显示细胞内蓝染颗粒相应增加。当SPIO浓度为25、50μg·mL-1时,细胞存活率和细胞活力与无SPIO时差异无统计学意义（P〉0.05）;但当SPIO浓度增加到100μg·mL-1时,CCK-8试验显示细胞活力下降（P〈0.01）;当SPIO浓度增加到200μg·mL-1时,细胞存活率和细胞活力均下降（P〈0.05）;（2）设定SPIO浓度为50μg.mL-1,随共孵育时间增加,细胞内含铁量逐渐升高（各组间比较均P〈0.01）;当标记时间为0、2、4、8、16、24h时,细胞存活率和细胞活力并差异无统计学意义（P〉0.05）;但当标记时间进一步延长到48h时,细胞存活率有所降低（P〈0.05）;（3）按＂50μg/ml×24h方案＂标记后,1.5TMR成像仪体外MRT2＊ WIflash检测阈值为7.5×104个细胞。结论：50μg·mL-1×24h方案是猪骨髓间充质干细胞比较合适的磁探针标记方案。     

SPIO标记浓度对BMSCs生物学特性的影响及体外MRI表现

目的：观察不同浓度超顺磁性氧化铁（SPIO）标记对干细胞生物学特性的影响及SPIO标记后BMSCs体外的MRI特征。材料与方法分离、培养SD大鼠的BMSCs,取第四代的BMSCs,通过流式细胞仪检测表面抗原。不同浓度的SPIO标记液标记BMSCs,通过普鲁士兰染色检测标记效率,台盼兰活细胞计数检测细胞活力,MTT法检测细胞增殖活性。通过MRI检查,观察体外不同浓度SPIO标记细胞的信号变化情况。结果 SPIO在25～50μg/ml的浓度范围可以安全、高效地标记BMSCs,不会影响BMSCs的表型、活力和增殖等生物学特性;当SPIO浓度在75μg/ml以上时,BMSCs活性及增殖能力逐渐降低。随着SPIO标记浓度的增加,细胞内摄入的铁逐渐增多,而T2信号强度则逐渐降低;当SPIO浓度≥50μg/ml,标记细胞的T2信号强度与普通BMSCs相比较均有明显差异（P〈0.05）。结论适当浓度的SPIO标记BMSCs对其生物学活性没有明显影响,且MRI扫描能够有效检测其信号变化。     

Ferumoxides–protamine sulfate is more effective than ferucarbotran for cell labeling: implications for clinically applicable cell tracking using MRI

The use of superparamagnetic iron oxide (SPIO) for labeling cells holds great promise for clinically applicable cell tracking using magnetic resonance imaging. For clinical application, an effectively and specifically labeled cell preparation is highly desired (i.e. a large amount of intracellular iron and a negligible amount of extracellular iron). In this study we performed a direct comparison of two SPIO labeling strategies that have both been reported as efficient and clinically translatable approaches. These approaches are cell labeling using ferumoxides–protamine complexes or ferucarabotran particles. Cell labeling was performed on primary human bone marrow stromal cells (hBMSCs) and chondrocytes. For both cell types ferumoxides–protamine resulted in a higher percentage of labeled cells, a higher total iron load, a larger amount of intracellular iron and a lower amount of extracellular iron aggregates, compared with ferucarbotran. Consequently, hBMSC and chondrocyte labeling with ferumoxides–protamine is more effective and results in more specific cell labeling than ferucarbotran. Copyright © 2009 John Wiley & Sons, Ltd.     

氯甲基苯甲酰胺标记大鼠肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞的可行性

背景:氯甲基苯甲酰胺被认为是目前较为稳定的细胞荧光标记物质。目的:观察荧光染料氯甲基苯甲酰胺标记肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞的标记效果及其对细胞形态、生长及增殖能力等生物学特性的影响。方法:采用胶原酶消化法分离、培养SD大鼠肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞,以氯甲基苯甲酰胺细胞标记液标记第3代肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞。结果与结论:荧光显微镜下观察氯甲基苯甲酰胺标记的肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞呈红色荧光,细胞标记率达95%以上,标记前后细胞形态、生长及增殖等方面无明显变化。经多次传代培养后,红色荧光细胞数量及强度有所下降,但细胞传代至第8代,氯甲基苯甲酰胺标记后的第15天细胞标记率仍可达50%以上。表明氯甲基苯甲酰胺可有效标记肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞,且方法简单,标记率高,对细胞无毒性,不影响细胞生物学特性。     

超顺磁性氧化铁体外标记大鼠骨髓基质干细胞的传代:细胞中铁粒子会随传代而变化吗?

背景:超顺磁性氧化铁作为磁共振对比剂已进行了大量临床实验,但其随标记细胞传代分化后的分布及代谢却报道甚少.目的:实验首次观察和描述了体外超顺磁性氧化铁标记的大鼠骨髓基质干细胞及其传代细胞的情况,并以磁共振信号检测铁粒子随细胞传代的演变情况.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-01在川北医学院附属医院医学影像研究所和风湿免疫研究所完成.材料:清洁级雌性大白鼠2只,由川北医学院动物中心提供.超顺磁性氧化铁由德国先灵公司惠赠.方法:抽取大鼠双侧股骨和胫骨的骨髓,采用贴壁法分离纯化骨髓基质干细胞,用铁浓度为42 mg/L的氧化铁-多聚赖氨酸复合物600 μL进行体外标记.主要观察指标:倒置显微镜下观察各代细胞标记阳性率,磁共振扫描测定磁共振信号强度变化百分率.结果:普鲁士蓝染色后,镜下第1代细胞超顺磁性氧化铁标记阳性率为100%,随着传代次数的增加,第1～5代细胞标记阳性率逐级降低.与未接受超顺磁性氧化铁标记的PBS对照比较,除第1,2代细胞信号强度变化率无明显变化外,随着细胞的传代磁共振信号强度变化百分率逐渐降低,细胞标记率与T2~*WI信号强度呈负性相关(r=-0.986 6,P<0.005).结论:标记入骨髓基质干细胞内的铁能随细胞的传代而传向子代,并可以在一定时期内用磁共振进行追踪检测,实验结果亦首次提出了磁标记的细胞铁粒子可随细胞传代而递减的规律.     

携带人肝细胞生长因子的腺病毒转染人骨髓间充质干细胞及超顺磁性氧化铁标记细胞体外MR成像

目的 评价携带人源化绿色荧光蛋白(hrGFP)-人肝细胞生长因子(hHGF)的腺病毒载体对人永生化骨髓间充质干细胞UE7T-13生物学特征的影响,并探讨对超顺磁性氧化铁(SPIO)标记细胞进行体外MR成像的可行性。 方法 构建和包装携带hrGFP-hHGF基因的腺病毒载体;以hrGFP-hHGF腺病毒转染UE7T-13细胞,检测细胞中hrGFP表达阳性率、hHGF mRNA及细胞上清液中hHGF水平;检测hrGFP-hHGF腺病毒对H₂O₂诱导细胞凋亡的影响。以SPIO标记UE7T-13细胞,检测标记后细胞内铁含量、细胞增殖及分化能力;对不同铁浓度SPIO标记的细胞行MRI。结果 成功构建hrGFP-hHGF腺病毒载体,将其转染UE7T-13细胞48 h后hrGFP阳性表达率达93.17%,hHGF mRNA表达提高3075.63倍,细胞上清液中hHGF水平显著升高,随后下降,于第14天仍高于hrGFP腺病毒转染细胞。hrGFP-hHGF腺病毒可抑制H₂O₂介导的细胞凋亡。SPIO标记后细胞铁染色阳性率达100%,细胞铁含量明显高于未标记细胞;SPIO标记不影响细胞增殖及分化能力;T2WI信号随标记铁浓度增高而降低。 结论 hrGFP-hHGF腺病毒载体可抑制H₂O₂介导的细胞凋亡;SPIO能高效标记细胞,不影响细胞增殖及分化能力,可用于细胞体外MR成像。     

Detection of viability of transplanted beta cells labeled with a novel contrast agent – polyvinylpyrrolidone‐coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by magnetic resonance imaging

Islets can be visualized on MRI by labeling with superparamagnetic contrast agent during the transplantation procedure. However, whether the signal intensity reflects the cell number and cellular viability has not been determined. We used a self‐synthesized novel superparamagnetic contrast agent –polyvinylpyrrolidone‐coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PVP‐SPIO) – to label β‐TC‐6 cells (a mouse insulinoma cell line) or primary islets with commercial Feridex as a control. The labeling efficiency of two agents was compared by Prussian blue staining, intracellular iron content determination and MR scanning. Cells were exposed to hypoxia, high‐glucose or exogenous H₂O₂ stimulation before/after PVP‐SPIO labeling. Normal and injured cells were also transplanted into renal subcapsule. A clinically used 3.0 T MR scan was performed in vitro and 24 h post‐transplantation to investigate the correlation between cellular viability and signal. Our PVP‐SPIO displayed superior biocompatibility and magnetic properties. All of the cells could be labeled at 100 µg/ml iron concentration after 24 h incubation. At 100 µg/ml iron concentration, 1 × 10⁵ β cells labeled with PVP‐SPIO could already be visualized in vitro by MRI, less than the detection threshold of Feridex. There existed a linear correlation between the number of labeled cells and R₂ value on the T₂‐weighted images. The signal intensity and the intracellular iron content declined along with the decreased viability of labeled cells. There was also a significant difference in signal intensity between injured and normal labeled cells after transplantation. From these results, we concluded that PVP‐SPIO possessed superior cell labeling efficiency, and β cells could be labeled without compromising viability and function. The signal intensity on MRI might be a useful predictor to evaluate the number and the viability of PVP‐SPIO‐labeled cells. Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd.