从分化胚胎干细胞中分选血管构建种子细胞的实验研究

目的本研究主要比较了应用免疫磁珠(MACS)和流式细胞仪(FACS)两种分选手段,从ES分化细胞中获得血管平滑肌细胞和内皮细胞的效率。方法利用MACS和FACS从ES分化细胞中分选出FLK-1阳性细胞,分别在VEGF和PDGF诱导培养下获得血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,运用MACS和FACS进行细胞性质和纯度鉴定,并对两种方法所获细胞的活力和细胞得率进行比较研究。结果利用MACS分选获得的FLK-1阳性细胞经过PDGF诱导培养后可以得到108～109量级和纯度超过90%的血管平滑肌细胞,可满足构建血管的需要,而利用FACS分选难以获得构建血管肌层所需的大量细胞。利用FACS分选的FLK-1阳性细胞经过VEGF诱导培养后的纯度约60%,表达vWF和吸收低密度脂蛋白(Ac-LDL)的血管内皮细胞;而利用MACS从ES细胞中分选获得的血管内皮细胞纯度较低,两种分选方法获得的细胞活力无明显差别。结论因组织工程血管构建所需要的平滑肌细胞数量巨大,宜选用MACS从ES分化细胞中分选获得;而血管内皮细胞宜选用FACS分选获得。     

创面愈合过程中脂肪细胞内转化生长因子-β各亚型的表达特点及其生物学意义

目的　观察深Ⅱ度烫伤大鼠上皮组织修复过程中皮下脂肪组织内脂肪细胞转化生长因子 (TGF) β1、2、3亚型的表达特点及生物学意义。 方法　将 3 6只Wistar大鼠随机分为正常对照组 (A组 ,n =6)和单纯烫伤组 (B组 ,n =3 0 )。利用大鼠 5 %深Ⅱ度烫伤模型 ,于伤后 1、3、7、14和2 1d采取全层创面皮肤标本 ,采用免疫组织化学染色法检测真皮下脂肪细胞TGF β1、2、3的表达 ,并以病理学染色观察肉芽组织的形成及创面的收缩情况。结果　正常皮肤组织内脂肪细胞中均有TGF β1、2、3的表达。单纯烫伤创面愈合的过程中 ,伤后 1d ,脂肪组织内脂肪细胞膜表面TGF β1表达较弱 ,但TGF β2、3的表达较强 ,伤后 3d ,脂肪细胞TGF β1表达有所增强 ,TGF β2、3的表达进一步增强。此时创面深层脂肪组织内有新的微小血管形成。至 14d ,创面收缩 ,脂肪组织TGF β1表达维持在较高水平 ,TGF β2、3的表达也较高。真皮浅层大量的微小血管形成 ,密度明显增强。 2 1d创面完全愈合 ,在新愈合组织内有一定量的血管形成 ,TGF β各亚型的表达有所减弱 ,但TGF β2、3的表达仍强于TGF β1。 结论　组织修复过程中 ,脂肪细胞释放的TGF β可能有助于肉芽组织充填和微小血管网的形成 ,在创面愈合中扮演重要角色。     

骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞定向肝细胞样分化的诱导条件，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法分离小鼠骨髓间充质干细胞，在特定肝细胞培养液中用肝细胞生长因子(HGF)和表皮细胞生长因子(EGF)定向诱导。在倒置显微镜下观察细胞形态。应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经HGF和EGF诱导7d后变为肝细胞样圆形；2周后免疫荧光染色可见分化后细胞表达肝细胞标志物CK18和白蛋白。结论骨髓间充质干细胞在特定条件诱导下可以向肝细胞方向分化。有可能作为肝组织工程的种子细胞来源。     

大鼠脂肪干细胞体外定向诱导为血管内皮细胞的研究

目的研究大鼠脂肪干细胞(Adipose-Derived Stem Cells, ADSCs)体外定向诱导分化为血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs)的可行性.方法取SD大鼠腹股沟区脂肪组织获取ADSCs进行体外培养并检测其多向分化能力,取4代细胞在血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)诱导下向内皮方向分化,检测内皮细胞标志物血管性假血友病因子(Von Willebrand Factor, vWF)表达.结果 ADSCs在体外能迅速扩增,具有多向分化的能力.在 VEGF、bFGF 诱导下,ADSCs能迅速分化为VECs,大多数细胞vWF阳性表达,与阳性对照组相似.结论 ADSCs在特定诱导环境下可以分化为VECs,有望成为组织工程领域内治疗勃起功能障碍(erectile dysfunction, ED)新的种子细胞来源.     

人脐带间充质干细胞向血管内皮祖细胞诱导分化的实验研究

目的探讨人脐带间充质干细胞定向诱导分化为血管内皮祖细胞的可行性,为构建组织工程血管瓣膜内皮化提供新的细胞来源。方法无菌条件下取剖宫产新生儿脐带,复合胶原酶消化法获取脐带间充质干细胞进行培养,以流式细胞仪检测脐带间充质细胞的表面标志。取扩增3～6代的脐带间充质干细胞用VEGF和b-FGF诱导分化。用免疫荧光法鉴定内皮祖细胞的标志。结果脐带间充质干细胞可以诱导分化为血管内皮样细胞,表达CD34、CD133和vWF,且Dil-acLDL实验阳性。结论脐带间充质干细胞可以诱导分化为血管内皮祖细胞,可为构建组织工程血管瓣膜提供新的种子细胞来源。     

体外定向诱导小鼠胚胎干细胞向内皮细胞分化的研究

目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向内皮细胞分化的条件,为组织工程血管提供种子细胞。方法取怀孕12.5d的昆明小白鼠1只,断颈处死,取其胚胎,培养制备小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)。常规复苏ESC后进行体外培养,采用悬滴-悬浮法制备拟胚体(embryoid body,EB)。将EB分两组:实验组加入含有3ng/ml转化生长因子β1、50ng/ml血管内皮细胞生长因子及1μmol/L激活素受体样激酶选择性抑制剂的EB培养基;对照组只加入EB培养基。倒置显微镜下观察细胞生长情况。采用RT-PCR及免疫组织化学染色检测诱导细胞vWF和CD34的表达,验证细胞性质。结果原代MEF生长迅速,第3天细胞融合达90%左右,细胞呈长梭形,有少量侧支,细胞核饱满,有2~3个核仁,细胞排列紧密。传至3~5代,细胞呈多角形,胞浆饱满,有3~4个核仁,细胞表面分泌较多细胞颗粒。ESC在饲养层上保持未分化状态,细胞团形态呈鸟巢样,边缘平整,单个细胞体积小,折光性强,核质比高,增长速度快。悬滴培养3d的EB肉眼可见,再经悬浮培养3d后,形成较大的透亮EB;EB贴壁后第2天,球体略摊开。实验组第4~7天,EB周围有许多圆形细胞产生,第10~14天,可见由大量圆形细胞组成的血管样结构自EB周围生长;对照组EB周围未见血管样结构生长。免疫组织化学染色见EB周围大量vWF染色阳性细胞,RT-PCR检测到vWF和CD34的表达。结论ESC在特定的条件下可以分化为内皮细胞,有可能为组织工程血管提供大量的种子细胞。     

鼠外周血内皮祖细胞体外培养鉴定与诱导分化

目的探讨鼠外周血来源的血管内皮祖细胞(EPCs)体外培养鉴定及诱导分化的方法。方法从鼠外周血中分离获取EPCs,进行体外培养扩增,并在培养液中添加VEGF及bFGF,采用免疫组织化学技术和流式细胞仪进行EPCs的细胞表面标志物检测。结果培养3~4d,可观察到梭形贴壁细胞,14d左右贴壁细胞呈条索状结构,贴壁细胞是表达血管内皮细胞的特异性标志。结论鼠外周血中含有EPCs,在一定条件下,可分化成血管内皮细胞。     

骨髓诱导分化内皮细胞构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

骨髓基质干细胞（BMSCs）在特定培养条件下能够诱导分化为内皮细胞,是构建组织工程心脏瓣膜（TEHV）较有前景的种子细胞来源.我们研究探讨应用BMSCs诱导分化的内皮细胞和猪去细胞瓣膜支架体外构建TEHV的可行性.     

血管内皮生长因子与类风湿性关节炎

血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor ,VEGF)或称血管渗透因子 (vascularpermeabilityfactor ,VPF) ,是一种能特异性促进血管内皮细胞增殖、维持血管内皮细胞分化状态、提高微血管通透性的细胞因子。血小板源性生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子 (EGF)、角化细胞生长因子 (KGF)、肿瘤坏死因子α(TNF α)、转化生长因子 β1(TGF β1)等的促血管发生作用都是由VEGF的作用介导的。血管的发生始终贯穿于胚胎发育、器官分化、肿瘤生长以及组织修复等生理病理过…     

术后狭窄胆管转化生长因子-β1的表达及意义

目的　观察转化生长因子 β1(TGF β1)在术后狭窄胆道中的表达和分布 ,探讨其在良性胆管狭窄形成过程中的作用及意义。方法　采用免疫组织化学streptavidin biotincomplex(SABC)法检测了 12例术后 3～ 6个月狭窄胆道组织中TGF β1的的表达和分布情况 ,并与 5例正常胆道组织进行对照研究。结果　狭窄胆道组织中TGF β1主要表达于肉芽组织、成纤维细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞。正常胆管壁纤维组织表达较弱 ,阳性细胞均数为 12 .45± 6.2 4;TGF β1在术后狭窄胆道组织中的表达较强 ,本组 12例标本中 10例表达 ,2例表达 ,阳性细胞均数为5 9 .5 2± 8.3 3 ,与正常胆管比较差异有非常显著性 (P <0 .0 1)。结论　TGF β1高表达是造成胆道狭窄过程中成纤维细胞增殖旺盛、细胞外基质过度沉积、瘢痕增生的重要因素。     

胚胎干细胞源性肝细胞的获得及体内移植研究

目的 探讨体外定向诱导小鼠胚胎干细胞(ES细胞)分化为肝细胞的方法及肝损伤模型肝内移植的可行性.方法 常规培养ES细胞后,继续悬浮培养4 d以形成拟胚体(EBs),转移EBs到铺有明胶的6孔板中贴壁培养,并添加3 mmol/L丁酸钠开始诱导分化,7 d后加入淤胆血清筛选、纯化ES源性肝细胞,分化过程中用光学显微镜和电子显微镜观察细胞形态及超微结构的改变;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肝细胞特异性标志基因:白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、甲状腺素运载蛋白(TTR)、α1抗胰蛋白酶(AAT)、葡萄糖6磷酸酶(G6P)、酪氨酸转氨酶(TAT)mRNA水平的表达;以荧光示踪剂CFDA-SE标记诱导获得的肝细胞,并移植到肝损伤小鼠肝内,观察移植细胞在肝内的定居、增殖情况.结果 诱导分化过程中,ES细胞形态逐渐出现肝细胞样改变,其超微结构与小鼠肝细胞超微结构十分相似;RT-PCR结果显示,随着诱导时间的推进,标志肝细胞发育过程的ALB、AFP、TTR、AAT、G6P、TAT mRNA顺序表达;肝内移植实验结果显示:ES源性肝细胞可在肝损伤小鼠肝内定居并增殖.结论 丁酸钠联合淤胆血清可以诱导ES细胞分化为肝细胞,ES源性肝细胞肝损伤模型体内移植是可行的,这有可能为细胞移植治疗难治性肝病提供一种新的细胞来源.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化成平滑肌细胞

目的分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并体外定向诱导分化成平滑肌细胞,为BMSCs移植治疗勃起功能障碍(ED)大鼠模型提供种子细胞。方法分离培养大鼠BMSCs,取第3~4代细胞,流式细胞术检测BMSCs表面分子CD49d、CD73、CD90、CD105和CD106、造血干细胞表面分子CD34和CD45、血管内皮细胞特异性表面分子CD31表达情况,采用平滑肌细胞诱导培养基诱导分化,通过免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和结蛋白(Desmin)进行鉴定细胞分化。结果培养细胞阳性表达BMSCs表面分子CD49d、CD73、CD90、CD105和CD106,同时造血干细胞表面分子CD34和CD45及血管内皮细胞表面分子CD31阴性表达,且经过平滑肌细胞诱导培养基诱导分化后α-SMA和Desmin免疫荧光检测均阳性反应。结论成功从大鼠骨髓中分离培养BMSCs,为BMSCs和基因修饰BMSCs移植治疗ED提供种子细胞。     

犬骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究

目的：研究犬骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外定向诱导,向血管内皮细胞（ECs）方向分化,探讨其作为组织工程血管种子细胞的可行性。方法：获取犬骨髓单个核细胞,体外分离出MSCs。将分离的MSCs接种于含EBM-2完全培养液的培养瓶,向内皮样细胞定向诱导分化;LG-DMEM完全培养液培养的MSCs作为对照组。对MSCs表型进行流式细胞仪鉴定;诱导的内皮样细胞进行CD31、Ⅷ因子免疫细胞化学鉴定和摄取Dil-Ac-LDL、结合FITC-UEA的双染色功能鉴定。结果：流式细胞术检测培养的原代MSCs表面标志CD44表达呈阳性,而CD34表达则呈阴性;诱导分化的内皮样细胞具有内皮细胞形态特征,与成体内皮细胞相似;诱导的内皮样细胞Ⅷ因子染色和CD31免疫荧光染色均呈明显阳性,对照组细胞为阴性;诱导的内皮样细胞Dil-Ac-LDL摄取实验和FITC-UEA结合实验,细胞呈阳性表现。结论：在体外用骨髓MSCs能够成功诱导分化为血管内皮样细胞,为组织工程血管内皮化提供了一种可行的种子细胞来源。     

巨噬细胞及转化生长因子-β1在肝外胆管损伤修复过程中的表达及其意义

目的　观察巨噬细胞 (MΦ)及转化生长因子 β1(TGF β1)在胆道愈合过程中的表达和分布 ,探讨其在良性胆管狭窄形成过程中的作用及意义。方法　通过制作犬胆管损伤修复模型 ,术后分为 1周组、3周组、3个月组、6个月组。采用免疫组织化学过氧化酶标记的链霉卵白素 (SP)法对MΦ、TGF β1在各组中的表达和分布进行研究。结果　MΦ 1周时表达 ,与其他各期比较差异有显著性(P <0 .0 5 ) ,3周～ 6个月表达差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;TGF β1愈合过程中持续表达较强 ,各期比较差异无显著性 (P >0 .0 5 )。MΦ主要表达于粘膜固有层 ;TGF β1主要表达于肉芽组织、成纤维细胞、MΦ及血管内皮细胞。结论　MΦ、TGF β1高表达是造成胆道愈合过程成纤维细胞增殖旺盛、细胞外基质过度沉积、瘢痕增生的重要因素。     

骨髓CD34+细胞体外分化为血管内皮细胞的研究

目的 研究骨髓CD34^ 细胞体外分化为内皮细胞的能力，并初步探讨其分化条件。方法 利用免疫磁珠法从骨髓中提取CD34^ 细胞，体外经血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维生长因子(bFGF)及胰岛素样生长因子-1(IGF-1)等诱导分化后，观察细胞生长及形态变化，并通过检测细胞血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、Ⅷ因子相关抗原抗体表达和摄取乙酰化-低密度脂蛋白(Ac-LDL)情况等对分化细胞进行鉴定。结果 用免疫磁珠法从骨髓中可以提取高纯度CD34^ 细胞，定向诱导后细胞呈卵石形，透射电镜显示细胞内具有特征性的W—P小体，免疫荧光染色检测细胞相关抗原VEGFR-2、Ⅷ／vWF呈阳性，同时细胞摄取Ac—LDL。结论 骨髓CD34^ 细胞是具有多向分化潜能的干细胞，经VEGF、bFGF、IGF-1等诱导，可以分化为血管内皮细胞，是理想的组织工程种子细胞。     

盐酸特拉唑嗪诱导人前列腺间质细胞凋亡的机制研究

目的　探讨盐酸特拉唑嗪诱导人前列腺间质细胞凋亡的机制。方法　在原代体外培养的人增生前列腺间质细胞中加入不同浓度的盐酸特拉唑嗪、转化生长因子 (TGF) β1及TGF β1抗体 ,用原位凋亡法 (TUNEL)检测细胞的凋亡状况 ,TGF β1酶联免疫粘附试验 (ELISA)试剂盒检测细胞悬液A值。结果　盐酸特拉唑嗪和TGF β1均可诱导体外培养的人前列腺间质细胞凋亡 ,且具有浓度依赖性 ;加入特异性TGF β1抗体后细胞凋亡率减少 72 .7% (P <0 .0 1) ;盐酸特拉唑嗪组细胞悬液TGF β1浓度的A值较对照组高 87.5 % (P <0 .0 1)。 结论　盐酸特拉唑嗪诱导人前列腺间质细胞凋亡通过或至少部分通过细胞自分泌TGF β1引起。     

鼠外周血内皮祖细胞体外培养鉴定与诱导分化

目的探讨鼠外周血来源的血管内皮祖细胞（EPCs）体外培养鉴定及诱导分化的方法。方法从鼠外周血中分离获取EPCs,进行体外培养扩增,并在培养液中添加VEGF及bFGF,采用免疫组织化学技术和流式细胞仪进行EPCs的细胞表面标志物检测。结果培养3-4d,可观察到梭形贴壁细胞,14d左右贴壁细胞呈条索状结构,贴壁细胞是表达血管内皮细胞的特异性标志。结论鼠外周血中含有EPCs,在一定条件下,可分化成血管内皮细胞。     

鼠胚胎干细胞诱导分化内皮样细胞

目的 采用简单贴壁培养方法诱导胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)分化为内皮样细胞,为组织工程血管及细胞替代治疗提供新的种子细胞.方法 小鼠ESC株SV129按2×104个/cm2密度传代培养,采用ESC培养基添加1 000 U/mL白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF)维持其未分化状态.撤除LIF,ESC悬浮培养形成拟胚体(embryoid body,EB),将培养第4天的EB置于含VEGF的培养基中贴壁培养,诱导分化.采用免疫组织化学染色、流式细胞仪分析、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine-labeledacetylated low density lipoprotein,DiI-Ac-LDL)摄取实验以及透射电镜检查鉴定分化细胞的性质.结果 分化产生的内皮样细胞具有内皮细胞形态特征,能摄取DiI-Ac-LDL.ESC诱导分化培养产生的第15代细胞免疫组织化学染色呈Flk-1和CD31阳性;流式细胞仪检测ESC传至9代后CD31阳性细胞>90%;透射电镜可见怀布尔-帕拉德体及内皮细胞间紧密连接.结论 采用简单贴壁培养的方法,单独使用VEGF即可诱导ESC分化为内皮样细胞.诱导培养方法操作简便,经济实用,可为组织工程血管及细胞替代治疗提供所需内皮样细胞.     

雄激素和转化生长因子β_1协同调节前列腺基质细胞增殖和分化

目的　探讨双氢睾酮 (DHT)和转化生长因子 β1(TGF β1)对体外培养的前列腺基质细胞增殖和分化的影响及前列腺基质增生的机制。　方法　体外培养人前列腺基质细胞 ,加入DHT和TGF β1,采用MTT法检测细胞增殖 ,免疫组化、RT PCR方法检测平滑肌细胞特异性标记蛋白的表达。　结果　对平顶期的前列腺基质细胞 ,单独应用DHT或TGF β1无显著刺激增殖作用 (P >0 .0 5 ) ;DHT和TGF β1联合应用时 ,可显著刺激基质细胞增殖 (P <0 .0 1)。TGF β1可使前列腺基质细胞中平滑肌细胞特异性标记蛋白的表达增加 (P <0 .0 5 ) ,与DHT联合应用时这种作用更强。　结论　DHT和TGF β1具有协同促进前列腺基质细胞增殖和分化的作用。TGF β1和雄激素可能是前列腺基质增生和平滑肌细胞过度增殖的重要诱因     

诱导兔骨髓间充质干细胞成为内皮细胞

[目的] 研究骨髓间充质干细胞（mensenchymal stemcells，MSCs）向内皮细胞分化的可行性。[方法] 密度梯度离心法分离兔骨髓间充质干细胞行体外培养和连续传代，获得较纯的MSCs。采用第2代的MSCs，以血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）进行体外诱导，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，免疫荧光方法鉴定内皮细胞，并通过透射电镜观察内皮细胞特异性WP小体。[结果] 分化后的细胞在光镜下具有内皮细胞的形态学特征；免疫荧光染色证实实验组诱导后的细胞为内皮细胞。透射电镜显示诱导后细胞内出现内皮细胞特异性WP小体。【结论] 成体中的MSCs在一定诱导条件下可以表现内皮细胞样特征，是组织工程血管化理想的种子细胞。