乙型肝炎病毒adr亚型全基因组分子克隆的建立

从单一人份HBsAg(adr)携带者血清中分离纯化HBV DNA,将其插在质粒pBR 322DNA的BamHI切点,转化大肠杆菌。经筛选得到了含完整乙型肝炎病毒(HBV)基因组的分子克隆,确定了8种限制性内切酶的切点数和位置,并用已知DNA序列的adw_2亚型HBV DNA基因特异性探针进行了基因定位。     

DNA印迹试验

DNA印迹是一种将电泳分离的DNA片段转移到固相支持物上用探针与靶DNA进行杂交的技术,又称Southem杂交。利用一种或多种限制内切酶酶切消化的基因组DNA,或经PCR获得扩增片段,经琼脂糖凝胶电泳,所得的DNA片段按分子大小分离,DNA片段经琼脂糖凝胶、变性,并将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上(多为硝酸纤维素膜,NC或尼龙膜),     

骨肉瘤基因组DNA的提取及部分酶切分析

目的比较提取骨肉瘤基因组DNA,建立基因组DNA的最佳部分酶切条件并制备其部分酶切产物。方法采用经典的基因组DNA提取法和改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA,以限制内切酶Sau3A I部分酶切,采用玻璃珠(SilverBeads)DNA胶回收试剂盒与蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA。结果提取基因组DNA片段大于150 kb,37℃,Sau3A I 1∶4(u/μg)部分酶切骨肉瘤基因组DNA 30 min获得18 kb~23 kb基因片段的富集,制备目的片段DNA。结论经改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA具有纯度、产量高,方法简单,无蛋白和RNA污染,片段足够长,可被Sau3AI部分酶切,玻璃珠(Sil-ver Beads)DNA胶回收试剂盒和蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA纯度高,无小的DNA片段混入,可满足构建入噬菌体载体(EMBL3)基因组文库。为构建骨肉瘤的入EMBL3载体基因组文库做好了前期工作。     

骨肉瘤基因组DNA的提取及部分酶切分析

目的比较提取骨肉瘤基因组DNA,建立基因组DNA的最佳部分酶切条件并制备其部分酶切产物.方法采用经典的基因组DNA提取法和改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA,以限制内切酶Sau3A I部分酶切,采用玻璃珠(Silver Beads)DNA胶回收试剂盒与蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA.结果提取基因组DNA片段大于150 kb,37℃,Sau3AI 14(u/μg)部分酶切骨肉瘤基因组DNA 30 min获得18 kb ～23kb基因片段的富集,制备目的片段DNA.结论经改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA具有纯度、产量高,方法简单,无蛋白和RNA污染,片段足够长,可被Sau3AI部分酶切,玻璃珠(Silver Beads)DNA胶回收试剂盒和蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA纯度高,无小的DNA片段混入,可满足构建入噬菌体载体(EMBL3)基因组文库.为构建骨肉瘤的入EMBL3载体基因组文库做好了前期工作.     

Q热立克次体DNA酶切片段的电泳分析

本文采用限制性核酸内切酶技术,对本室分离的Q热立克次体七医株,进行了DNA酶切片段的电泳分析,并以国外标准株(Grita株)作为参照。Q热立克次体经泛影葡胺密度梯度离心法进行分离纯化。提纯的立克次体DNA,用限制性核酸内切酶(HaeⅢ和BglⅠ)分别消解后,再经琼脂糖凝胶电泳法分析。本文结果证实,七医株和Grita株的酶切电泳图谱存在差异。这种差异在HaeⅢ酶谱上尤为明显。不仅两株立克次体DNA的绝大多数酶切片段的迁移距离不同,而且Grita株明显比七医株缺少包括4.3kb在内的几个HaeⅢ片段。     

牛雄性DNA特异的限制性片段研究

牛基因组DNA经PstI酶解后,以与性别有关的雌性蛇的小卫星DNA组份一BKm序列(p184)为探针进行分子杂交,回收4.4kb牛雄性DNA片段,以pUC_(19)为载体亚克隆,重组质粒经菌落原位杂交和Southern blot分子杂交鉴定。将此雄性DNA片段检测牛基因组DNA,观察到由于性别的不同而出现不一样的杂交模式。实验结果表明,用来自牛雄性DNA特异的限制性片段的重组质粒作探针,Southern blot分子杂交方法可以鉴定牛的性别。     

从微量血中快速制备线粒体DNA片段

目的 建立从微量血中快速制备线粒体DNA(mtDNA)片段。方法取50μl抗凝血和常规酶解法提取的血DNA,同时扩增核DNA(nDNA)上的基因片段和mtDNA上的基因片段,华美公司生产的RedyPCR(tm)微量全血DNA纯化系统进行比较,PCR相对定量分析比较这3种方法提取的mtDNA片段的纯度。结果RedyrPCR(tm)微量全血DNA纯化系统得到的mtDNA和常规酶解法提取的mtDNA有nDNA污染,而作者建立的方法获得的mtDNA纯度较高。结论同时与该法简便快捷地排除了nDNA的污染,适合于对mtDNA进行PCR分析和研究。     

DNA过氧化物酶探针在遗传性白内障基因诊断中的应用

目的:建立应用于遗传性白内障基因突变筛查的DNA过氧化物酶检测方法。方法:针对已报道的遗传性白内障的基因突变位点晶状体蛋白CRYAB的p.R11H突变[CRYAB-32(G>A)]和缝隙连接蛋白50(Cx50)的p.S276F突变[CX50-827(C>T)],设计DNA过氧化物酶分子探针,建立DNA过氧化物酶探针和靶序列核苷酸反应体系。两个突变位点的检测均分为6组,即阳性对照组、阴性对照组、阳性实验组、阴性实验组以及2个空白对照组。主要观测各组与DNA过氧化物酶探针的显色反应。结果:DNA过氧化物酶探针与含CRYAB-32(G>A)及CX50-827(C>T)的阳性标本,在特定反应中结合均显现浅绿色,而与不含该突变的野生型DNA片段不反应不显色。结论:有过氧化物酶活性的DNA过氧化物酶作为一类新的颜色反应标签可应用于遗传性白内障基因突变的检测,能实现检测的可视化,简化检测硬件和操作步骤。     

乙肝病毒小基因嵌合DNA疫苗的构建与鉴定

目的采用基因重组技术,将乙肝病毒4段小基因与协同刺激分子CD80基因嵌合,构建成嵌合乙肝小基因DNA疫苗。方法①根据文献选择和设计HBV的一段pres2、三段core表位编码小基因,以人工合成DNA片段P1~P10,通过退火、连接成为含约170bp的嵌合基因,用HindⅢ酶切;②提取和纯化pcDNA3-CD80,用HindⅢ酶切和去磷酸化;③将酶切小基因定向插入pcDNA3-CD80载体的HindⅢ位点之间,构建成pcHBV-CD80小基因质粒;④pcHBV-CD80转入E.coli JM109扩增、提取质粒,测序鉴定。结果①各DNA小片段经退火、连接,成功嵌合为一大小约170bp之目的基因;②pcDNA3-CD80提取、酶切均成功;③170bp之目的基因定向克隆到载体上,构建了重组质粒pcHBV-CD80,经测序鉴定均构建正确。结论乙肝病毒小基因与协同刺激分子CD80嵌合DNA疫苗构建成功。     

应用DNA分析技术早期证明异基因外周血造血干细胞移植成功

用异基因外周血造血干细胞移植(allo-PBSCT)的方法治疗白血病,正被用以取代骨髓移植。但在施行移植后如何尽早判断移植是否成功,对决定进一步治疗方案至关重要,人类DNA具有高度的遗传多态性,利用特异已知序列的DNA片段与目的DNA杂交所得到的DNA指纹图谱具有高度的个体特异性;而多聚酶链式反应(PCR)技术则是利用靶DNA序列侧翼上所结合的两个寡核苷酸引物经体外酶促合成特异DNA片段,笔者利用较为优秀的D_1S_(80)、D_1S_(111)、apoB及HUMTH01 4个位点的扩增片段长度多态性检测和最新研制的JL-02探针杂交所得的DNA指纹图技术对1例行allo-PBSCT患者的血液在移植后13天进行DNA分型检测,得到了确定其移植是否成功的明确结论,现报道如下。     

高水平乙型肝炎病毒复制诱导肝细胞QSG-7701凋亡

目的 观察高水平的HBV复制对QSG-7701细胞可能产生的致病效应.方法 采用磷酸钙沉淀方法转染质粒pUC18-HBV1.2(实验组)和空质粒pUC18(对照组)至QSG-7701细胞,细胞计数观察细胞生长曲线.转染后4 d,采用荧光实时定量PCR方法检测培养上清中HBV DNA水平;免疫荧光细胞化学染色检测细胞内的HBsAg表达;电子显微镜和末端脱氧核苷酸转移酶介导duTP缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡;Oliga信号传导基因芯片检测实验组和对照组的基因差异表达.结果 对照组细胞转染6 d后细胞数量增加(8.3±1.2)倍,凋亡细胞极少见.实验组在转染后6 d细胞数量仅增加(1.1±0.2)倍,HBsAg阳性细胞35.4%±6.7%,细胞凋亡占15.2%±4.3%.基因差异表达谱分析显示与细胞生长和凋亡相关的部分基因如CASP3(2.7981)、CASP7(2.2643)、3-Apr(3.5013)、CDC2(0.4380)、MAPK6(0.4447)和MAP3K2(0.2785)等表达水平发生显著改变.结论 高水平的HBV复制明显抑制QSG-7701细胞生长,并诱导部分细胞发生凋亡.     

HBV preS2-S DNA免疫诱导小鼠体液免疫应答

目的:构建HBV表面抗原preS2-S基因表达质粒,并探讨其在小鼠体内的表达及诱导体液免疫应答的能力.方法:采用PCR方法,以PBR322-HBV2.0(adr亚型)质粒DNA为模板获得HBV preS2-S基因,并将其重组进入pcDNA3.0表达载体中,转染7721细胞系进行稳定表达;以此重组质粒免疫小鼠,ELISA方法检测免疫小鼠抗HBs抗体浓度.结果:构建了HBV preS2-S基因的表达质粒pcDNAS2-S,该表达质粒可在7721细胞中稳定高效表达;免疫接种小鼠2周后抗HBs抗体浓度明显升高,接种后第4周布比卡因处理组小鼠抗HBs抗体的浓度达到峰值161.4 mIU/ml,布比卡因非处理组第5周抗HBs抗体的浓度可达133.7 mIU/ml.结论:所构建的pcDNAS2-S表达质粒能有效表达并诱导小鼠体液免疫应答.     

1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达

目的 构建1.3倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,并观察其在Bewo细胞中的表达.方法 以质粒pMD18T-HBV上的HBV DNA序列为模板,构建1.3倍HBV全基因序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg蛋白的表达及HBV DNA水平.结果 通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建1.3倍HBV全基因表达载体,该载体可以在Bewo细胞系中表达和分泌HBsAg与HBeAg,并可检测到高水平的HBV DNA.结论 成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,为研究胞内HBV宫内感染奠定了基础.     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

人乳头瘤病毒11型的DNA分子克隆

以E coli C300为受体菌,利用人乳头瘤病毒11型DNA与pBR322的重组质粒(pBR322-HPV11DNA),成功地进行了HPV11DNA的转化,经筛选获得61株重组子,随机对15株转化子以碱变性法及清亮裂解法抽提了pBR322-HPV11DNA的重组质粒,纯化后经BamHI酶切及琼脂糖凝胶电泳,以λDNA/HindⅢ作参考分子量测定,初步结果证实存在有分子量为5.5×10~6(约8.1kb)的HPV11DNA。这为HPV11DNA的分子扩增,基因探针的制备及HPV11型量鳞癌的研究提供了方便。     

HBV在HK-2细胞内的表达及对其转分化的影响

目的   研究乙型肝炎病毒（HBV）在人近端肾小管上皮细胞（HK-2）的表达及对其转分化的影响。方法   体外培养HK-2细胞,分为HK-2组、HK-2-PHY106组（空质粒PHY106转染组）、HK-2-PHY106-HBV组（PHY106-HBV质粒转染组）。用脂质体lipofectamineTM2000转染HK 2细胞。用ELISA法检测各组细胞培养上清液中HBsAg与HBeAg的含量。免疫细胞化学染色及Western blot印迹检测转染72h后E-钙黏素（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。RT-PCR法检测转染72h后转化生长因子-1（TGF-β1）的mRNA。结果   HK-2-PHY106-HBV组细胞培养上清液中可检测到HBsAg和HBeAg的高表达;免疫细胞化学染色及Western blot印迹检测均显示HK-2-PHY106-HBV组E-cadherin表达显著下调（P＜0.05）,而α-SMA表达与其他两组相比明显上调（P＜0.05）;RT-PCR显示HK-2-PHY106-HBV组TGF-β1的mRNA表达上调（P＜0.05）。结论   HBV可在HK-2细胞内高效复制,并能够导致HK-2转分化,其机制可能是通过上调TGF-β1来实现的。     

白细胞介素－32对 HepG22．15细胞 HBV表达的影响

目的：探讨白细胞介素－32（IL－32）对HepG22．15细胞HBV表达的影响。方法不同浓度的IL－32（0～0．8μg／mL）蛋白质加入HepG22．15细胞（插入HBV全基因组,持续表达）培养液共培养,48 h后收集培养上清液。用实时荧光定量PCR检测HBV DNA载量,用ELISA检测HBsAg、HBeAg表达水平。结果 IL－32抑制HepG22．15细胞HBV的复制,抑制HBsAg、HBeAg表达,且其抑制呈剂量依赖性增强。结论 IL－32可以抑制HepG22．15细胞HBV的表达,IL－32具有抗HBV的作用。     

白细胞介素-12和白细胞介素-18质粒对HBcAgDNA疫苗诱导小鼠(H-2d)体液免疫应答的影响

目的：观察编码白细胞介素（IL）－12和IL－18的真核表达载体[pcDNA3.1/IL-12(以下简称IL－12质粒）和pcDNA3.1/IL-18(以下简称IL－18质粒）]对HBcAg DNA疫苗（pJW4303/HBc)诱导BalB/c(H-2^d)小鼠免疫应答的影响。方法：肌肉注射接种IL－12质粒、IL－18质粒和HBcAg DNA疫苗，ELISA法检测小鼠血清抗HBc IgG亚类（IgGl,IgG2a)水平。结果：免疫6周后，联合注射IL－12、IL－18和IL－12＋IL－18组小鼠血清的抗HBc终点滴度均明显高于单纯注射HBcAg DNA疫苗组小鼠（P＜0．05），抗HBc IgG亚类以IgG2a占优。结论：IL－12、IL－18以及IL－12＋IL－18联合HBcAg DNA疫苗注射能够提高小鼠血清中抗HBc水平。     

人乳头状瘤病毒16型E2基因的克隆表达

采用分子克隆技术在大肠杆菌中表达HPV16 E2 ORF。用Cfol和BamHI将含有E2基因的3.2kb片段从HPV16基因组中切出来,用S1核酸酶修平末端;同时,表达性载体pBD2 DNA用HindⅢ切开后也用S1核酸酶修平末端.两者连接后转化E coli BMH71—18.用原位杂交技术筛选出阳性重组子,进行DNA酶切分析和蛋白质SDS-PAGB分析及免疫学鉴定.我们认为表达的蛋白质为β-gal与E2的融合多肽。     

应用分子杂交技术检验白细胞内HBV DNA

本研究应用斑点分子杂交技术检测了157例慢性HBV感染者及80例一般人群(含20例献血员)的血清和白细胞内HBV DNA的状况。在157例慢性HBV感染者中血清HBV DNA阳性率为39%,白细胞内HBV DNA为36%,两者同时阳性者为18%。而在60例血清HBV DNA阳性者中白细胞内HBV DNA同时阳性者为48%,血清HBV DNA阴性的93例中仍有30%的病例白细胞内HBV DNA为阳性。说明在血清HBV DNA阴性的慢性HBV感染者中仍有1/3的病例的白细胞内存在HBVDNA。80例一般人群经RIA法筛选发现:单纯HBsAg阳性6例,其中3例白细胞内HBV DNA阳性。HBsAg与HBeAg同时阳性者4例,其白细胞内HBV DNA均为阳性。单纯抗-HBs阳性的24例中仅1例白细胞内存在HBV DNA。单纯抗-HBc阳性者为12例,白细胞内HBV DNA无1例阳性。值得注意的是,在血清HBV标志全阴性的34例中也发现了2例白细胞内HBV DNA阳性。由于HBV可以感染人的白细胞,而且影响白细胞的免疫功能,其在形成HBV感染的慢性化上可能起着重要的作用,因而在肝炎的转归、流行病学的意义及发病机制等问题上它的作用尚需进一步探讨。