pET21b-HPV16E4重组质粒的构建及鉴定

目的 构建HPV16 E4重组表达质粒,以获得HPV16 E4活性蛋白,为进一步研究打基础.方法 从宫颈癌组织中提取DNA,用PCR方法扩增HPV16E4 DNA片段,定向克隆到原核表达载体pET21b质粒中,利用菌液PCR方法筛选重组阳性菌株.提取重组质粒,利用酶切图谱分析方法和核酸序列测定验证重组质粒pET21b-HPV16E4构建的正确性.结果 用PCR方法从宫颈癌组织中扩增出HPV16 E4片段,大小为0.3kb.从PCR筛选的重组菌株中提取重组质粒pET21b-HPV16E4,经单酶切得到5.7kb的片断,HindⅢ和BamHⅠ双酶切得到5.4kb和0.3kb两个片段,并且测序结果与已知序列相符,证实了重组质粒构建的正确性.结论 pET21b-HPV16E4重组质粒构建成功.     

Myo5a末端4个小片段重组质粒的构建

目的 构建Myo5a末端4个小片段的重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a. 方法 PCR扩增出Myo5a基因末端4个特异性小片段的蛋白编码序列,用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切,将酶切后小片段分别插入原核表达载体PGEX-4T-3,构建4个重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a,并对其进行鉴定. 结果 扩增出4个大小约100 bp的基因片段,4个片段重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a经鉴定正确. 结论 成功构建4个Myo5a特异性片段的重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a.     

乙型肝炎病毒核心基因克隆及其重组体的构建

【目的】构建含乙型肝炎病毒 (HBV)编码核心蛋白 (HBcAg)的核心 (C)基因的真核表达重组体 ,以进行核酸免疫及相关研究。【方法】以含HBV(ayw亚型 )全基因序列的质粒pHBV1为模板 ,用PCR的方法获得编码HBcAg的C基因片段(nt1889～ 2 45 7) ,该基因片段两端设计了BamHⅠ和EcoRⅠ的限制性内切酶位点 ,以便通过定向克隆将其插入真核表达质粒载体pcDNA3相应的多克隆位点。【结果】经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,以及重组体插入片段的DNA序列测定 ,证实成功地构建了含C基因的真核表达重组体pcDNA3 HBc。【结论】pcDNA3 HBc的构建成功为研究其表达及进行动物免疫研究提供了物质基础。     

人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的: 构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体. 方法: 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0 6.4 kb两条带. 反义重组质粒为1.0 2.5 3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性. 结论: 成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.     

一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

目的 建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法.方法 制备包含单一限制性内切酶Cta Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段(Cla Ⅰ位点两侧碱基序列不互补).与BamH Ⅰ和Hind Ⅲ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含Cla Ⅰ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ.用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含Cla Ⅰ识别序列)做连接反应.构建GFP shRNA表达质粒.提取阳性克隆质粒DNA,行Cla Ⅰ单酶切鉴定,对未被Cla Ⅰ线性化的质粒行DNA测序鉴定.结果 DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,以pSilencer-4.1-Cla Ⅰ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被Cla Ⅰ线性化的均为GFP shRNA表达质粒.结论 构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,所引入的单一的Cla Ⅰ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒.     

HBVS基因、PreS2/S基因真核重组载体的构建与鉴定

[目的]构建包含人乙型肝炎病毒(HBV)S基因与PreS2/S基因的重组载体.[方法]设计合成2对寡核苷酸引物,以adr亚型HBV质粒pHBVDNA为模板,采用PCR法分别扩增HBVS基因、PreS2/S基因片段;用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后,分别连接到质粒pcDNA3.1相应酶切位点,转化宿主菌JM109,分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒.[结果]酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符.测序结果与文献报道序列及预计结果一致.[结论]成功构建了S基因与PreS2/S基因的重组载体.     

携带IRES的hBDNF绿色荧光蛋白表达载体的构建和鉴定

目的构建表达人脑源性神经生长因子(hBDNF)基因的真核细胞表达载体,并且观察重组质粒在真核细胞中的表达情况。方法采用PCR方法从健康人基因组中扩增出该基因,将hBDNF的PCR产物用XhoⅠ和SalⅠ双酶切后克隆到用XhoⅠ和SalⅠ双酶切的带有EGFP和内部核糖体转入位点(IRES)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中。对重组质粒进行双酶切和质粒测序鉴定后,采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组的质粒转染至真核细胞中,用RT-PCR和荧光显微镜检测基因在细胞中表达的情况。结果双酶切和质粒测序结果证明hBDNF已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,质粒能在细胞中正常表达。结论成功构建了EGFP/hBDNF表达载体,为应用hBDNF治疗中枢神经系统疾病奠定坚实的基础。     

丙型肝炎病毒C，E2，NS3区基因嵌合重组载体的构建

目的：构建包含丙型肝炎病毒（HCV）C区、E2区及NS3区的嵌合重组载体。方法：设计合成3对寡核苷酸引物，用PCR法从HCV重组质粒pHCVc、pBE2和pGMXNS3-5中特异扩增出编码HCV C区、E2和NS3区抗原的部分基因片段（501、603和900bp)，分别用HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，逐个定向连接到质粒pcDNA3中，转化宿主菌XL1－Blue，分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果：酶切鉴定示所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道序列及预计结果一致，证实符合表达框架。结论成功构建了HCV嵌合重组质粒pcDNA3-C-E2-NS3.