人晶状体上皮细胞的体外培养

目的建立一种简单可行的人晶状体上皮细胞体外培养的方法.方法利用组织块贴片法,对人晶状体的前囊膜和赤道部囊膜进行培养.对培养的细胞进行形态学观察和鉴定.结果组织块贴壁48～72h后可见人晶状体上皮细胞从组织块边缘长出,具有上皮细胞的形态特点,10～15 d后融合.在体外细胞可传五代,但第三代以后细胞表型向成纤维细胞转化.SABC法染色结果细胞胞浆内α-晶状体蛋白染色阳性.结论成功地建立起人晶状体上皮细胞体外培养模型,可用于后囊膜混浊发病机理和药物试验研究.     

免疫载药毫微粒对晶状体上皮细胞的体外抑制作用

目的制备免疫载药毫微粒HILE6-PLA(5-Fu)-NP,体外评价其表征、免疫学特性及对晶状体上皮细胞(LECs)增殖的抑制作用。方法将抗人LECs膜单克隆抗体HILE6与5-Fu聚乳酸毫微粒采用碳二亚胺法相连接制备免疫毫微粒。扫描电镜观察微粒形态;间接免疫荧光法评价其免疫特异性;建立LECs、角膜基质细胞培养模型,体外检测不同质量浓度免疫微粒和单纯载药微粒对细胞作用2h后的杀伤作用。结果免疫毫微粒保持对LECs的免疫特异性,对LECs具有很强的杀伤作用,明显高于同质量浓度毫微粒,62·5μg/ml作用2h抑制率可达到92·3%,撤药后观察时间延长到7d时的抑制作用高于或不低于3d时的效果。使用药物质量浓度<12·5μg/ml对角膜细胞相对较安全。结论该免疫毫微粒可有选择性的,长时间杀伤LECs,预防后囊混浊。     

高糖对人晶状体上皮细胞凋亡的作用

目的:研究不同浓度的高糖(HG)对人晶状体上皮细胞凋亡的作用。方法:用不同浓度的HG诱导人晶状体上皮细胞凋亡,处理组:DMEM+HG;对照组:DMEM。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测人晶状体上皮细胞的生长活性;原位末端核苷标记(TUNEL)法检测细胞凋亡的凋亡指数(AI),并在电镜下观察TUNEL染色阳性细胞的形态及分布。结果:HG可抑制人晶状体上皮细胞生长,诱导细胞的凋亡,并呈剂量及时间依赖性,HG诱导组细胞凋亡率明显高于正常组(P<0.01)。TUNEL染色法在电镜下观察到HG诱导24h后,TUNEL染色阳性细胞核固缩或碎裂呈棕黄色,细胞大小不一;而TUNEL染色阴性细胞着色均匀,大小均一。结论:高糖具有促使人晶状体上皮细胞凋亡形成的作用,尤其是在120~150mmol/L浓度范围内。     

肝细胞生长因子对培养的人晶状体上皮细胞增生及移行作用的研究

目的研究肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对体外培养的人晶状体上皮细胞(hu-man lens epithelial cells,HLECs)增生及移行的作用。方法在无血清培养液培养的HLECs中分别加入不同浓度的HGF(2.5、5、10、20、40、50、100μg/L),MTT法测定促细胞增生的情况;流式细胞仪分析细胞周期;HLECs损伤愈合模型,观察不同浓度HGF(10、20、50μg/L)处理24h后HLECs的移行情况。结果HGF浓度处于10、20、40、50μg/L时对HLECs具有促增生作用(P<0.05或P<0.01),增生率分别为10.5%、30.2%、28.3%和11.1%;当浓度为20μg/L作用24h能达到最大促增生效果(P<0.01),增生率为29.6%;HGF通过促进细胞G0向G1的转化来促进细胞的增生;HGF可明显促进HLECs的移行,其移行能力分别为22.1%(10μg/L)、57.7%(20μg/L)和208.6%(50μg/L)。结论HGF可促进HLECs的增生和移行,是HLECs的有丝分裂原和强有力的促移行因子。     

5-Fu纳米毫微粒的制备及体外对晶状体上皮细胞增生的抑制作用

目的制备5氟尿嘧啶(5fluorouracil,5Fu)聚乳酸纳米毫微粒并观察其表征及体外对兔晶状体上皮细胞的抑制作用。方法采用复乳法制备5Fu聚乳酸纳米毫微粒,观察毫微粒的大小、表面形态和结构,毫微粒载药率和体外药物释放曲线。取传3代晶状体上皮细胞进行对比试验,设5Fu纳米毫微粒、5Fu原药、空载纳米毫微粒组、空白对照组。设0.5～62.5mg·L-14个剂量组,作用24h、72h、120h、168h后光镜下观察细胞性状,MTT法检测抑制作用。结果(1)制备的5Fu纳米毫微粒平均粒径(191.000±0.202)nm;载药率为8.1%;首日药物突释率为38.3%,缓释时间20d;(2)5Fu纳米毫微粒和5Fu原药对兔晶状体上皮细胞均有抑制作用,并随时间和剂量的增加而增加。空载聚乳酸纳米毫微粒对细胞无抑制作用;(3)作用初期各剂量组5Fu纳米毫微粒的抑制作用低于或等于原药,随时间延长分别在不同时间点超过原药,差异有显著性。结论5Fu聚乳酸纳米毫微粒性状稳定,可长期释放药物,有效抑制兔晶状体上皮细胞的增生,随时间延长作用明显高于原药,可以作为靶向缓释药物载体。     

体外培养人晶状体上皮细胞整合素的表达

目的:研究体外培养人晶状体上皮细胞整合素的表达。方法:对人晶状体上皮细胞株SRA01/04进行培养并传代,经间接免疫荧光标记法处理细胞后上流式细胞仪检测各整合素的阳性表达率。结果:整合素α2,α3,α5,β1,β2在SRA01/04的阳性表达率分别为85.3%,97.6%,74.0%,97.7%,3.65%。整合素α3与β1之间无统计学差异(P>0.05),其余两两间比较均有显著统计学差异(P<0.01)。结论:人晶状体上皮细胞株SRA01/04整合素呈阳性表达。     

荷载Zebularine的聚合物胶束复合体纳米颗粒对体外培养的晶状体上皮细胞增殖和黏附的影响

目的：：研究荷载 Zebularine ( Zeb )的聚合物胶束复合体( MePEG-PCL)纳米颗粒( NPs)对体外培养的晶状体上皮细胞( LECs)活性、黏附性和凋亡的影响。方法：体外培养胎儿晶状体组织HLE B-3永生细胞,分为6个组,分别给予游离Zeb 50μmol/L ( ZebF1组)、100μmol/L ( ZebF2组)、荷载 Zeb 的 MePEG-PCL NPs 50μmol/L (ZebNP1组)、100μmol/L(ZebNP2组)、MePEG-PCL空载颗粒( NPs组)、空白培养基( C 组),分别采用 MTT 比色法、改良MTT 比色法观察细胞活性、黏附性,采用 DNA ladder法研究细胞凋亡。结果：MTT比色法显示：游离Zeb和荷载Zeb的MePEG-PCL NPs对细胞活性有抑制作用,均呈时间-剂量依赖性增强( P<0.05),与游离组相比,相同剂量荷载Zeb的MePEG-PCL NPs组在给药12 h时细胞活性无差异,而给药24,48,96 h后载体组细胞活性降低( P<0.05)。改良MTT比色法显示：所有Zeb给药组细胞黏附率均降低,与游离组相比相同剂量荷载Zeb的MePEG-PCL NPs组黏附率降低( P<0.05)。 DNA ladder显示：给药后96h C组、NPs组,ZebF1组未出现DNA碎片表达, ZebF2, ZebNP1, ZebNP2组出现DNA碎片表达,其表达强度依次为 ZebNP2> ZebNP1>ZebF2( P<0.05)。结论：荷载Zeb的MePEG-PCL NPs可有效地抑制体外培养的LECs活性、黏附性,造成细胞的凋亡,其效果优于同剂量的游离药物。     

TiO2纳米薄膜影响晶状体上皮细胞和巨噬细胞生长的体外研究

目的:观察经长波紫外线UVA(365nm)激发处理,TiO2纳米薄膜对体外培养的牛晶状体上皮细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的抑制效应,研究该薄膜影响表面细胞生长的特性。方法:在玻片上涂覆TiO2纳米薄膜,并以未镀膜玻片为对照。将两种玻片在不同强度(0.102和0.825mW/cm2)的UVA下,照射0,10,20,30,40min,观察玻片表面的晶状体上皮细胞和巨噬细胞生长的数量和状态。实验用MTT比色法评估晶状体上皮细胞量,并以AO-EB染色法观察其形态;用瑞氏染色后计数法测定巨噬细胞量,并以扫描电镜观察其形态。结果:镀TiO2纳米薄膜玻片在0.102mW/cm2的UVA激发40min或0.825mW/cm2的UVA激发30min时,表面存活的细胞量比未镀膜玻片显著减少(P<0.01),且晶状体上皮细胞出现AO-EB染色的凋亡和坏死特征,巨噬细胞出现质膜破裂、细胞崩解的扫描电镜表现。激发时间越长,TiO2纳米薄膜上的细胞量越少,且0.825mW/cm2的光源较0.102mW/cm2的光源更能激发TiO2的杀伤作用。结论:TiO2纳米薄膜在UVA的激发照射后,能使其表面的晶状体上皮细胞和巨噬细胞发生凋亡或坏死。与照射时间呈时效关系。     

地塞米松对人晶状体上皮细胞中波形蛋白表达的影响

目的 探讨地塞米松(dexamethasone,Dex)对人晶状体上皮细胞系(human lens epithelial cells,HLEC)中波形蛋白表达的影响以及波形蛋白表达变化在糖皮质激素性白内障形成中的作用.方法 对HLEC进行传代培养,应用DMEM和DMEM+1μmol·L-1Dex作用于HLEC 7 d,采用实时PCR和Western-blot从基因水平和蛋白水平检测波形蛋白的表达变化,采用免疫荧光染色法检测波形蛋白在细胞中的分布及表达变化.结果 实时PCR结果显示,Dex组较对照组波形蛋白mRNA表达减少,组间差异有统计学意义(P＜0.05).Western-blot检测结果显示,Dex组较对照组波形蛋白含量减少,组间差异有统计学意义(P＜0.05),提示Dex可降低波形蛋白的表达.免疫荧光染色结果显示Dex组较对照组波形蛋白表达减少,与Western-blot检测结果一致.结论 Dex可诱导HLEC中波形蛋白表达减少,从而引起HLEC异常的增殖和分化,最终导致糖皮质激素性白内障的形成.     

水通道蛋白-1在高糖培养人晶状体上皮细胞中的表达

目的研究水通道蛋白-1（AQP-1）在糖尿病性白内障发病机制中的作用。方法从健康的供体眼中分离出人晶状体囊膜,用组织块培养法将人晶状体囊膜分别置于1g/L葡萄糖＋体积分数15%胎牛血清的DMEM培养液中（对照组）或4.5g/L葡萄糖＋15%胎牛血清的DMEM培养液中进行培养（高糖组）。培养3d、28d后观察2组人晶状体上皮细胞（LECs）的生长状态。采用免疫荧光技术和流式细胞术检测AQP-1在人LECs中表达的平均荧光强度,应用流式细胞术检测2组人LECs的凋亡和坏死情况,并进行比较。结果培养第3天2组LECs的生长形态近似,但培养28d高糖组坏死细胞增加。培养3d后高糖组人LECs的AQP-1免疫荧光表达较对照组明显增强,2组间平均荧光强度的差异有统计学意义（t=3.934,P=0.004）,但2组间LECs的凋亡率和坏死率差异均无统计学意义（t=1.681,P=0.131;t=1.064,P=0.318）。培养28d后高糖组人LECs的AQP-1免疫荧光表达较对照组弱,差异有统计学意义（t=3.069,P=0.015）,LECs凋亡率、坏死率较对照组升高,差异均有统计学意义（t=11.213,P〈0.01;t=15.778,P〈0.01）。结论 AQP-1的异常表达在糖尿病性白内障的发生发展中起重要作用。     

紫外线诱导晶状体上皮细胞凋亡的实验研究

目的 探讨紫外线对体外培养的牛眼晶状体上皮细胞凋亡作用。方法 以TUNEL技术和DNA片段分析法研究紫外线照射牛晶状体后不同时间晶状体上皮细胞发生凋亡的情况。结果 经紫外线照射后,TUNEL法显示,照射组晶状体上皮细胞中有凋亡细胞,对照组晶状体上皮细胞中无明显的凋亡细胞;DNA片段分析发现照射组晶状体上皮细胞有DNA“梯状”图谱,而对照组晶状体上皮细胞未见DNA断裂现象。结论 紫外线可诱导牛晶状体上皮细胞发生凋亡。     

Effect of intraoperative trypan blue on lens epithelial cells – Histomorphological analysis

Introduction

Trypan Blue is an acid azo dye commonly used as a stain to distinguish viable from non-viable cells. It is a vital stain used intra operatively during cataract surgery to stain the external surface of the anterior lens capsule for better visualization.

巨噬细胞对体外培养兔晶状体上皮细胞增殖的影响

目的探讨白内障术后后囊混浊的发病机制。方法观察巨噬细胞对兔晶状体上皮细胞（rabbitlensepithelialcells，RLEC）增生的影响。结果实验组加有巨噬细胞，BLEC增殖活跃。巨噬细胞上清液48及72小时能明显促进BLEC的生长。结论巨噬细胞促进晶体上皮细胞的增生，可能是引起白内障术后后囊混浊的原因之一。     

过氧化氢对人晶状体上皮细胞内细胞质膜微囊蛋白的影响

目的探讨过氧化氢（H2O2）对人晶状体上皮细胞的细胞质膜微囊蛋白（CP）及磷酸化CP-1分布与表达的影响。方法给予人晶状体上皮细胞（SRA01／04）不同浓度及不同时间点的H2O2刺激。用激光共聚焦显微镜和免疫荧光显微镜观察CP及磷酸化CP-1的分布。通过免疫印迹试验观察CP表达水平的变化以及磷酸化CP—1的表达。结果通过激光共聚焦显微镜和荧光显微镜,观察到人晶状体上皮细胞的质膜和细胞质内含有丰富的CP;当给予细胞H2O2刺激后,细胞质内CP的分布增多;当刺激时间达到1h,细胞膜被破坏,但仍可观察到CP的分布情况。此外,H2O2的刺激可以使CP-1发生磷酸化。免疫印迹试验发现,随着H2O2作用时间的延长和刺激浓度的升高,细胞质膜和细胞总蛋白质的CP表达水平呈下调趋势。结论H2O2刺激人晶状体上皮细胞后,CP重新分布并可能破坏了细胞质膜微囊（caveolae）的结构,使得细胞的CP表达下调。细胞质膜微囊和CP可能在人晶状体上皮细胞中具有重要作用。     

多西他赛对人晶状体上皮细胞的抑制作用

背景一些已知的抑制人晶状体上皮细胞（LECs）增生的药物由于严重的不良反应限制了其临床应用,寻找高效、安全的抑制LECs增生的药物是防治晶状体后囊膜混浊（PCO）的研究热点。目的探讨多西他赛对LECs增生的影响,并与盐酸表柔比星、盐酸吡柔比星和雷替曲塞的作用进行比较。方法对永生系人LECs细胞株SRAOI／04进行培养及传代,将不同浓度的多西他赛、盐酸表柔比星、盐酸吡柔比星和雷替曲塞加入LECs中分别作用24、48、72h,以MTT法评价不同浓度的多两他赛对人LECs增牛的抑制作用并与其他药物进行比较。用流式细胞术分析不同浓度的多西他赛作用48h后对LECs细胞周期的影响,采片jAnnexinV-FITC／PI标记法和蛋白印迹分析法评估不同浓度的多西他赛作用48h后LECs细胞bcl-2蛋白的表达和凋亡情况。结果8～519pmol／L多西他赛组LECs的增生率为100％,LECs形态正常,而66nmol／L多西他赛组干预48h和72h后LECs的增生率分别为34．7％和27．4％,LECs形态出现异常。23．22～523．56μmol／L雷替曲塞对人LECs的增生无明显抑制作用。多西他赛作用48h和72h时,半数抑制量（IC50）明显低于盐酸吡柔比星和盐酸表柔比星。多西他赛作用LECs48h后,随着多西他赛浓度的增高,处于G2／M期的LECs百分数明显增加,各组的总体差异有统计学意义（F=2633．05,P〈0．01）;8．3nmol／L和266nmol／L多西他赛浓度组干预48h后,LECs的凋亡率分别为22．4％和27．9％,较细胞对照组升高,差异均有统计学意义（χ2=20．00,P〈0．01;χ2=42．68,P〈0．01）。Westernblot检测表明不同浓度多西他赛干预后bcl-2蛋白在LECs中的表达条带均较对照组淡,8．3nmol／L多西他赛组bcl-2蛋白表达降低更为明显。结论多西他赛、盐酸表柔比星和盐酸吡柔比星均可抑制人LECs的增生,而雷替曲塞对人LECs的增生无明显的抑制作用。多西他赛对LECs增生的抑制作用强于其他药物,其作用强度呈浓度和时间依赖性。     

维生素E琥珀酸酯对人晶状体上皮细胞增殖的影响

目的研究维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate,VES)对体外培养的人晶状体上皮细胞(HLECs)增殖的影响。方法人晶状体上皮细胞株HLECs-B3以VES刺激24h、48h、72h、96h,VES浓度为5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml,用MTT比色法测定VES对细胞增殖的抑制作用;以流式细胞仪分析细胞周期。结果VES对人晶状体上皮细胞的增殖具有显著的抑制作用,表现为时间和剂量依赖关系。并且将细胞周期阻滞于G0/G1期。结论VES对体外培养的人晶状体上皮细胞的增殖具有抑制作用,为临床筛选防治后发性白内障的药物提供依据。     

Growth characteristics of human lens epithelial cells in culture

The effect of different concentrations of fetal calf serum (FCS) on the proliferative capacity of human and bovine lens epithelial cells in culture was evaluated. The effect of donor age on the maximum number of passages achieved using thirty eight individual cultures was also studied. The donor ages ranged from 1–88 years. Fifteen percent FCS was found to be the optimum concentration for both human and bovine cells. The two cell types demonstrated very similar responses across the spectrum of concentrations used. Correlation analysis revealed a significant (p < 0.05) negative correlation between donor age and maximum number of cell passages achieved.     

RGDRGD肽对人晶状体上皮细胞黏附与增生作用的影响

背景RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的小分子多肽,其在抑制肿瘤细胞黏附、转移和肿瘤新生血管的生成中起重要作用。研究证实RGD肽能够抑制晶状体上皮细胞（LECs）的黏附和增生,RGDRGD肽串联起来作用增强。目的研究RGDRGD肽对体外培养的人LECs黏附与增生的影响,并与RGD肽的作用进行比较。方法将在体外分离培养的LECs中分别加入250、500、1000mg／L的RGDRGD肽和RGD肽作为实验组,仅加入细胞培养液作为对照组。将LECs以2×10。／ml密度接种到含有纤维连接蛋白（FN）和I型胶原蛋白预孵化的96孔培养板中,培养1h后用MTT比色法检测RGDRGD肽与RGD肽对细胞黏附率的影响。将LECs接种于培养板,分别加入250、500、1000、2000mg／L的RGDRGD肽和RGD肽培养24、48、72h,检测RGDRGD肽和RGD肽对LECs增生的影响。结果RGDRGD肽对人LECs黏附率的抑制呈明显的剂量依赖性,随着其质量浓度的增加,对细胞黏附的抑制作用越强,500mg／L的RGDRGD肽比RGD肽抑制人LECs黏附的作用更强（P〈0．01）。RGDRGD肽对人LECs增生的抑制呈明显的时间剂量依赖性,1000mg／L的RGDRGD肽作用48h比RGD肽对人LECs增生的抑制作用更强（P〈0．01）。结论RGDRGD肽抑制LECs黏附与增生的作用强于RGD肽,为进一步临床应用提供了理论依据。     

白喉毒素氨基端389个氨基酸-人碱性成纤维细胞生长因子靶向毒素的克隆表达及对人晶状体上皮细胞毒性研究

目的 为阻止白内障术后囊膜混浊寻找物质基础.方法 提取灭活的白喉杆菌DNA和12周胎脑皮质RNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术分别扩增出编码白喉毒素氨基端389个氨基酸(DT389)的基因片段及编码18kd人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的基因全序列,将两基因先后插入表达载体中,构建含有DT389-hbFGF融合基因的表达质粒,测序后,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,纯化鉴定表达产物,噻唑蓝(MTT)试验检测其对体外培养人晶状体上皮细胞(HLECs)的毒性作用,流式细胞术鉴定不同剂量融合毒素所致HLECs成活率及细胞死亡形式.结果 扩增得到DT389基因片段及hbFGF全基因序列;构建了DT389-hbFGF融合基因的原核表达载体并成功表达;表达的融合蛋白对HLECs有明显的毒性作用并在一定范围内呈明显剂量依赖性,半数致死量为3.8×10-11mol/L,所致细胞死亡方式主要以凋亡为主.结论 DT389-hbFGF免疫毒素克隆表达的成功为药物促晶状体上皮细胞的凋亡、抑制后发障的研究奠定了物质基础.     

无防腐剂的1%利多卡因对兔晶状体上皮细胞影响的组织病理学研究

目的探讨无防腐剂的1％利多卡因对兔晶状体上皮细胞（LECs）的影响,为寻求白内障术中清除上皮,预防囊膜混浊的有效药物提供实验依据。方法采集29只兔（58只眼）晶状体前囊膜及赤道部囊膜标本,分为3组,对照组囊膜不加药物处理、BSS组囊膜用BSS浸泡1min、利多卡因组囊膜用利多卡因浸泡1min,后行锥虫蓝-茜素红染色,显微镜照相,观察LECs活性同时对死亡细胞进行计数;并通过HE染色及透射电镜观察兔LECs的组织病理学改变。锥虫蓝．茜素红染色及死亡细胞计数15只兔（30只眼）：其中对照组5只兔（10只眼）,BSS组5只兔（10只眼）,利多卡因组5只兔（10只眼）;HE染色9只兔（18只眼）：其中对照组1只兔（2只眼）,BSS组4只兔（8只眼）,利多卡因组4只兔（8只眼）;透射电镜5只兔（10只眼）：其中对照组1只兔（2只眼）,BSS组2只兔（4只眼）,利多卡因组2只兔（4只眼）。结果对照组兔晶状体前囊膜上皮细胞死亡率（1．51±0．39）％,赤道部囊膜上皮细胞死亡率（1．52±0．32）％;BSS组兔晶状体前囊膜上皮细胞死亡率（1．78±0．50）％,赤道部囊膜上皮细胞死亡率（1．77±0．47）％;利多卡因组兔晶状体前囊膜上皮细胞死亡率（13．01±4．67）％,赤道部囊膜上皮细胞死亡率（9．59±3．35）％。经嵌套试验的方差分析,利多卡因组细胞死亡率明显高于对照组与BSS组（P〈0．05）。HE染色显示对照组与BSS组兔LECs仍贴附于囊膜上,未见明显病理改变。利多卡因组部分细胞与囊膜间产生空隙,并从囊膜上脱落,细胞空泡变性。透射电镜观察下对照组与BSS组细胞间及细胞与囊膜间连接完整。利多卡因组部分细胞间及细胞与囊膜间的连接被破坏,细胞脱落较多,排列松散。细胞膜塌陷,胞质内有大量的空泡形成,细胞结构被破坏。结论无防腐剂的1％利多卡因能松解兔LECs间及细胞与晶状体囊膜间的连接,并可导致LECs变性、死亡。