重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3不同剂量对免疫保护性的影响

目的 观察不同剂量重组日本血吸虫（中国大陆株）信号蛋白14-3-3（rSj14-3-3）的免疫保护性,以探讨最佳的免疫剂量。方法 以逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）扩增Sj14-3-3基因,并将其亚克隆人原核表达载体pET28a,然后转化大肠埃希菌进行诱导表达;用十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、电洗脱和透析的方法制备纯化的rSj14-3-3蛋白,分5组（第1、2、3组为捌14-3-3蛋白50μg、100μg和300μg实验组,第4、5组分别为福氏佐剂和生理盐水对照组）免疫BALB／c小鼠并进行攻击感染实验。在尾蚴攻击感染6周后,剖杀小鼠计算各组的减虫率和减卵率。并在试验过程中留取不同时期小鼠血清,检测抗Sj14-3-3特异性IgG抗体。结果 成功表达出喝14—3-3蛋白,纯化蛋白免疫小鼠行攻击感染后各实验组的减虫率为第1组28．20％、第2组43．10％、第3组40．00％;各组的减卵率分别为（按以上组序）41．80％、57．50％、55．70％。各实验组与对照组比较,差异有统计学意义（减虫率：第1组t=6．8、第2组t=8．7、第3组t=7．3,各组P值均〈0．01;减卵率：第1组t=11．23、第2组t=11．54、第3组t=7．99,各组P值均〈0．01）;各实验组间两两比较,第1组与第2组间（减虫率：x^2=8．96,P〈0．05;减卵率：x^2=15．69,P〈0．05）、第1组与第3组间（减虫率：x^2=6．52,P〈0．05;减卵率：x^2=12．52,P〈0．05）差异有统计学意义;第2、3两组间差异无统计学意义（减虫率：x^2=1．20,P〉0．05;减卵率：x^2=0．93,P〉0．05）。各实验组的抗Sj14-3-3特异性总IgG水平都有显著升高,所测的4个亚型中以IgG1和IgG2a亚型升高为主,IgG2b和IgG3亚型升高不明显。结论 重组Sj14-3-3的免疫保护性与免疫剂量有一定关系,以100μg抗原量免疫小鼠获得的保护性最好。     

日本血吸虫乳酸脱氢酶原核表达、纯化及鉴定

目的原核表达日本血吸虫乳酸脱氢酶（SjLDH）,对表达产物进行纯化及生物活性鉴定。方法将SjLDH编码序列克隆入pET-28a原核表达载体并转染大肠埃希菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后亲和层析法对表达产物进行纯化,并用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白印迹（Western blot）、酶联免疫吸附实验（ELISA）、酶活性染色及活性测定进行鉴定。结果成功构建pET28a-SjLDH重组质粒并在大肠埃希菌中获得可溶性表达,亲和层析纯化表达产物。SDS-PAGE及Western Blot结果显示,表达及纯化产物分子量约36kDa,与SjLDH理论分子量相符。ELISA结果表明,重组蛋白具有良好的免疫活性,酶活性染色表明重组蛋白具有乳酸脱氢酶活性,活性单位为379U/mg。结论成功进行SjLDH的原核表达并获得纯化的重组蛋白,重组蛋白具有良好的免疫原性及酶活性,为研究SjLDH的功能奠定了基础。     

日本血吸虫31／32KDa蛋白质基因扩增及克隆

目的 克隆日本血吸虫３１／３２ＫＤａ蛋白质的编码基因，用于血吸虫病免疫诊断和预防，方法 以日本血吸虫成虫ＲＮＡ为模板逆转录合成ｃＤＮＡ链，参照Ｓ．ｍ３１／３２编码序列设计合成引物，用ＰＣＲ法扩增３１／３２ＫＤａ蛋白质基因编码序列，将其克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体。并用双酶切和以质粒为模板的ＰＣＲ进行鉴定。结果 ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一条约１２７０ｂｐ大小的特异性条带，重组质粒的双酶切和以质粒为模板的ＰＣＲ均     

日本血吸虫成虫性别差异蛋白的筛选及鉴定

目的 筛选和鉴定日本血吸虫成虫性别差异蛋白.方法 自日本血吸虫(Schistosomajaponicum,S.japonicum)尾蚴感染的2只家兔颈动脉灌注生理盐水冲虫,分别收集雌雄成虫各约200条.提取雌、雄成虫的水溶性和脂溶性蛋白各300μg,采用双向凝胶电泳技术分别进行分离.银染后扫描成像,用ImageMaster Platinum 2D 5.0软件进行分析,筛选差异蛋白,并予质谱鉴定.结果 雌虫和雄虫的水溶性蛋白分别检出(255±10)、(224±12)个蛋白点,疏水蛋白分别检出(200±11)、(132±8)个蛋白点;鉴定的6个差异蛋白质中,5个雌性表达上调的差异蛋白为硫氧还蛋白,铁蛋白-1重链,泛素结合酶样蛋白Mms2-泛素复合体可溶性结构B链,热休克蛋白10和胞浆脂肪酸结合蛋白突变体H,1个雄性表达上调的差异蛋白为48 kDa组胺受体亚基肽4.结论 获得了日本血吸虫成虫性别差异蛋白质.     

日本血吸虫尾蚴及童虫可溶性抗原蛋白质组研究

应用免疫蛋白质组研究方法筛选、鉴定日本血吸虫尾蚴、童虫可溶性抗原蛋白质。方法日本血吸虫尾蚴可溶性粗抗原(SCAP)、童虫可溶性粗抗原(SLAP)分别用双向凝胶电泳(2-DE)分离蛋白质,每样本同时制3块胶,1块胶进行银染,2块胶通过电转印后再分别用感染兔和正常兔血清作Western印迹分析,确定特异性阳性反应点,再从相...     

日本血吸虫未知功能基因SJFCE3549的克隆及生物信息学分析

目的克隆与日本血吸虫未知功能的新基因SJFCE3549,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其功能。方法应用PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增SJFCE3549基因全长ORF,将其亚克隆到真核表达载体pCMV-Tag2A中,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定。应用生物信息学初步分析其细胞定位、蛋白序列、结构域及功能。结果获得日本血吸虫未知功能基因的克隆SJFCE3549,序列分析结果提示该cDNA序列含有一个453 bp的完整阅读框序列,编码150个氨基酸,其编码蛋白的理论分子量为16.67 kDa,等电点为6.28。二级结构分析预测提示其具有一定抗原性。结论成功地克隆了日本血吸虫基因SJFCE3549全长ORF,构建了其pCMV-Tag2A真核表达载体,为进一步研究其结构与功能创造了条件。     

日本血吸虫p 50亲免素基因克隆、表达及纯化

目的扩增、原核克隆和表达日本血吸虫（Sj）p50亲免素基因全长cDNA，并进行表达产物的纯化。方法从成虫RNA中RT-PCR扩增Sjp50亲免素基因完整的编码阅读框后，将其克隆入pET 30a（＋）原核表达载体中，异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导高表达后用亲和层析柱对表达产物进行纯化。结果将Sjp50亲免素基因成功克隆入pET 30a（＋）表达载体中；诱导表达并成功纯化出重组Sjp50亲免素蛋白。结论成功克隆sjp50亲免素基因，并表达和纯化得到了p50亲免素蛋白，为研究Sip50亲免素的功能及其进行疫苗等研究奠定了基础。     

日本血吸虫重组GST抗原对水牛的保护性研究

在日本血吸虫病非流行区，选无疫水接触史，８个月龄左右的水牛，用日本血吸虫重组ＧＳＴ抗原进行免疫观察对水牛的保护性。结果显示，攻击感染血吸虫尾蚴后，实验组比对照组平均虫荷减少２２．３％，粪卵ＥＰＧ差异有显著意义，毛蚴孵出率降低近４０％，肝、肠组织血吸虫卵沉积量减少４７．９４％～５６．８３％。     

聚合酶链反应及基因芯片技术检测日本血吸虫的研究

目的 探索研制检测日本血吸虫的基因芯片。方法 依据日本血吸虫高度保守的编码免疫原性毛蚴抗原的5D基因,筛选、设计聚合酶链反应(PCR)的引物和基因探针,制成日本血吸虫基因芯片。检测时首先抽提尾蚴、成虫、虫卵、感染性钉螺的DNA,同时利用对照华支睾吸虫、姜片虫、卫氏并殖吸虫的DNA分别进行PCR扩增及不对称PCR荧光标记,然后用荧光标记后的靶序列与制备的检测芯片进行杂交,杂交结果用ScanArray 3000扫描仪扫描。结果 研制的基因芯片能有效地检测出单个尾蚴、虫卵、阳性钉螺或极微量成虫组织DNA,而常见的华支睾吸虫、姜片虫、卫氏并殖吸虫等未见阳性结果。结论 成功制备了检测日本血吸虫的基因芯片,并具有快速、灵敏、特异等特点。     

日本血吸虫微管蛋白基因的分离和cDNA序列分析

目的 分离和鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)新基因，为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行测序，对部分序列进行引物步移法测序，获取其全长cDNA序列；采用生物信息学等技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白质二级结构的初步预测。结果获得了1个日本血吸虫新基因—微管蛋白基因，全长1439bp，编码443个氨基酸，与肝片形吸虫微管蛋白基因具有79％的同源性。编码蛋白的理论分子量为7．2198KDa，等电点为9．12；抗原表位可能位于cDNA序列373～396处。结论 获得了日本血吸虫微管蛋白基因的全长cDNA序列，为该基因功能的实验性鉴定工作奠定基础。     

重组缩短的葡萄球菌类肠毒素X蛋白克隆表达及催吐活性评价

目的 分析缩短的葡萄球菌类肠毒素X(truncated Staphylococcal enterotoxin-like toxin X,tSElX)氨基酸多态性,对其进行克隆表达纯化并对催吐活性进行评价。方法 将tselx序列与本课题组前期完成测序的145株CC398菌株基因组序列及NCBI数据库进行比对分析。设计引物扩增tselx目的基因,将该片段重组于pMD18-T载体中并进行测序鉴定。经限制性内切酶BamHⅠ和EcoR Ⅰ双酶切后将目的片段构建于质粒pGEX-6P-1及pET-28a(+)中,重组质粒鉴定后,IPTG诱导蛋白表达。将以包涵体形式表达的蛋白进行变性和复性,用亲和层析法和超滤法对表达产物进行纯化。将纯化的tSElX蛋白以250 μg/kg喂饲普通狨猴,观察呕吐反应。结果 tselx基因在我国不同来源(患者、健康人群和动物)的145株CC398菌株均存在。我国菌株编码蛋白的氨基酸序列同源性为100.0%,与4株美国菌株的同源性分别为97.8%(1株)和98.9%(3株)。通过两套表达系统及不同诱导条件,tSElX均以包涵体形式表达。通过变性及复性,获得高纯度的可溶性重组蛋白tSElX。在250 μg/kg剂量下tSElX蛋白不能引起普通狨猴的呕吐反应。结论 tSElX氨基酸序列在CC398菌株中普遍存在,且具有一定保守性。高纯度的可溶性tSElX重组蛋白在250 μg/kg剂量下不具有普通狨猴催吐活性。     

东方田鼠感染日本血吸虫前后血清IL-4水平的检测

〔目的〕 检测东方田鼠感染日本血吸虫前后血清白细胞介素－４（ＩＬ－４）的水平。〔方法〕 ＥＬＩＳＡ法比较检测室内繁殖东方田鼠和昆明系小鼠未感染（ＢＭＦ０、ＡＭ０）与感染日本血吸虫第９天（ＢＭＦｉ９、ＡＭｉ９）、１６天（ＢＭＦｉ１６、ＡＭｉ１６）血清ＩＬ－４的水平。〔结果〕 ＢＭＦｉ９血清ＩＬ－４水平（１３１．９４ｐｇ／ｍｌ）显著高于ＢＭＦ０（５２．５９ｐｇ／ｍｌ）和ＢＭＦｉ１６（５８．１６ｐｇ／ｍｌ）;与昆明系小鼠相比较,ＢＭＦ０是ＡＭ０（１２．４３ｐｇ／ｍｌ）的４．２倍,ＢＭＦｉ９是ＡＭｉ９（４４．５３ｇｐ／ｍｌ）的３．０倍。〔结论〕 ＢＭＦ血清ＩＬ－４水平显著高于ＡＭ,且于感染早期显著升高,表明ＩＬ－４在东方田鼠抗日本血吸虫感染中可能具有重要作用。     

东方田鼠感染血吸虫前后血清补体C3 C4水平的动态

目的 检测东方田鼠感染血吸虫前后血清补体C3、C4水平,阐明其动态规律,为东方田鼠抗血吸虫感染的免疫机理提供证据。方法 免疫比浊法检测血清补体C3、C4水平。结果 未感染血吸虫的东方田鼠血清补体C3、C4平均含量显著高于昆明系小鼠,东方田鼠感染后血清中C3、C4平均水平在第11d以前较低,第21d升高,第26d较前显著升高,昆明系小鼠感染后C3、C4平均水平逐渐上升,直至第26d非常显著地高于第21d之前者。结论 东方田鼠血清补体水平较高,在抗血吸虫感染免疫中可能具有重要意义。     

重组结核分枝杆菌特异性分泌抗原融合蛋白的活性鉴定及初步应用

目的：融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10，研究其免疫学特性，为结核病的血清学诊断提供物质基础。方法：将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c（＋）中，构建pET32c（＋）-linker。PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因。将CFP10克隆入改建的载体pET32e（＋）的linker前，ESAT-6克隆入linker后，构建CFP10-ESAT-6融合基因；或将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c（＋）的linker前，CFP10克隆入linker后，构建ESAT-6-CFP10融合基因，分别转化大肠杆菌XL1-blue，抽提质粒，酶切鉴定；在大肠杆菌B121中表达，通过Western blot分析其抗原性。结果：两个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c（＋）的linker前或后。重组质粒pET32c（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。融合蛋白在B121菌中高效表达。Western blot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。结论：成功地构建了多抗原基因DNA质粒；pET32e（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10质粒在B121菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白，该蛋白兼具CFP10和ESAT-6两种蛋白的抗原性。本研究为rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白在结核病血清学诊断中应用奠定了基础。     

Efficacy and immunogenicity of recombinant swinepox virus expressing the A epitope of the TGEV S protein

To explore the possibility of developing a vaccine against transmissible gastroenteritis virus (TGEV) infection, a recombinant swinepox virus (rSPV-SA) expressing a TGEV protective antigen has been constructed. Immune responses and protection efficacy of the vaccination vector were assessed in both mice and pig models. An indirect ELISA assay suggested that when mice were vaccinated with rSPV-SA, the level of IgG against TGEV was enhanced dramatically. The cytokine assays were employed and the results indicated that both the Th1-type and Th2-type cytokine levels raised after vaccination with rSPV-SA in mice models. Results from the passive immunity protection test of new born piglets demonstrated that the recombinant live-vector vaccine, rSPV-SA, could 100% protect piglets from the SPV infection, and there was no significant clinical symptom in the rSPV-SA treatment group during this experiment. The data suggest that the novel recombinant swinepox virus is a potential vaccine against TGEV infection.     

Cloning and expression of protease ClpP from Streptococcus pneumoniae in Escherichia coli: study of the influence of kanamycin and IPTG concentration on cell growth, recombinant protein production and plasmid stability

Infections caused by Streptococcus pneumoniae are one of the main causes of death around the world. In order to address this problem, investigations are being made into the development of a protein-based vaccine. The aims of this study were to clone and express ClpP, a protein from S. pneumoniae serotype 14 in Escherichia coli, to optimize protein expression by using experimental design and to study plasmid segregation in the system. ClpP was cloned into the pET28b vector and expressed in E. coli BL21 Star (DE3). Protein expression was optimized by using central composite design, varying the inducer (IPTG) and kanamycin concentration, with a subsequent analysis being made of the concentration of heterologous protein, cell growth and the fraction of plasmid-bearing cells. In all the experiments, approximately the same concentration of ClpP was expressed in its soluble form, with a mean of 240.4 mg/L at the center point. Neither the IPTG concentration nor the kanamycin concentration was found to have any statistically significant influence on protein expression. Also, higher IPTG concentrations were found to have a negative effect on cell growth and plasmid stability. Plasmid segregation was identified in the system under all the concentrations studied. Using statistical analysis, it was possible to ascertain that the procedures for determining plasmid stability (serial dilution and colony counting) were reproducible. It was concluded that the inducer concentration could be reduced tenfold and the antibiotic eliminated from the system without significantly affecting expression levels and with the positive effect of reducing costs.