Kv1.5对大鼠低氧高二氧化碳性PASMCs增殖、凋亡的影响及与MAPK通路的关系

 目的：探讨电压依赖性钾离子通道Kv1.5对大鼠低氧高二氧化碳性肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖、凋亡的影响及其与丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路的关系。方法：体外培养大鼠PASMCs,复制低氧高二氧化碳模型,随机分组如下：常氧组（N组）;低氧高二氧化碳组（HH组）;低氧高二氧化碳+溶剂DMSO对照组（HD组）;低氧高二氧化碳+ERK1/2通路抑制剂U0126组（HU组）;低氧高二氧化碳+p38 MAPK通路抑制剂SB203580组（HS组）;低氧高二氧化碳+MAPK通路激动剂茴香霉素（anisomycin）组（HA组）。采用CCK-8法检测细胞活性,蛋白免疫印迹法检测Kv1.5、增殖细胞核抗原（PCNA）及Bax蛋白的表达水平。结果：与N组相比,HH组和HD组细胞活性增加（P<0.01）,PCNA蛋白表达上调,Kv1.5及Bax蛋白表达均明显降低（P<0.01）,HH组和HD组间各指标变化均无显著差异（均P>0.05）;较之HD组,HU组、HS组及HA组细胞活性降低（P<0.05或P<0.01）,PCNA蛋白表达下调,Kv1.5及Bax蛋白表达均明显增加,差异均显著（P<0.01）,其中以HA组各指标变化最明显。结论：钾离子通道Kv1.5对低氧高二氧化碳性大鼠PASMCs增殖、凋亡的调节可能与MAPK通路的激活有关。     

人Gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建人Gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-Gax质粒中扩增出人Gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定后通过梭华-Sofast转染试剂介导重组质粒转染至兔血管平滑肌细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达和RT-PCR扩增转染细胞的cDNA来鉴定Gax在兔血管平滑肌细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物人Gax基因片段约915bp,与预期分子量相符;酶切分析和测序鉴定证明人Gax真核表达载体pEGFP-N1-Gax连接正确;荧光显微镜观察到重组质粒转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,及RT-PCR证明转染细胞有人GaxmRNA表达。结论:成功构建人Gax基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-Gax,并证实在兔血管平滑肌细胞中表达,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

三七总皂苷对低氧状态下大鼠PASMCs增殖、凋亡及Notch3通路的影响

目的：探讨在低氧(hypoxia, Hypo)条件下三七总皂苷(Panax notoginseng saponins, PNS)对大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)增殖和凋亡及其Notch3通路的影响。方法：以大鼠PASMCs为研究对象,饥饿24 h后将细胞分为6组：正常对照(control, Con)组、Hypo组、Hypo+PNS组、Hypo+DAPT{N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester; Notch3通路抑制剂}组、Hypo+过表达Notch3(Hypo+Notch3)组和Hypo+Notch3+PNS组。Con组置于常氧环境(21%O₂、5%CO₂、74%N₂)下培养48 h,其余5组预先进行相对应的干预后置于低氧条件(5%O₂、6%CO₂、89%N₂)下培养48 ...     

人Gax基因转染对血管平滑肌细胞增殖、迁移和细胞周期的影响

目的: 探讨腺病毒介导人生长终止特异性同源异型盒基因(hGax基因)转染对血清刺激后兔血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移和细胞周期的影响,为静脉桥再狭窄基因治疗新策略提供帮助。方法: 构建含 hGax 的重组腺病毒载体并感染兔VSMCs;应用RT-PCR、免疫荧光染色检测hGax mRNA和蛋白的表达; MTT法观察hGax基因过表达对血清刺激后VSMCs增殖的影响;划痕法测定细胞迁移;流式分析细胞周期。结果: 成功构建Ad5-hGax重组腺病毒载体。转染48 h后 RT-PCR和免疫荧光染色法示转染 hGax 基因的VSMCs中存在目的基因特异性片段(174 bp)和目的蛋白表达;MTT法示hGax蛋白显著抑制血清刺激后VSMCs增殖;划痕法示hGax基因过表达明显抑制血清刺激后VSMCs迁移;流式结果示血清刺激72 h后,Ad5-hGax转染组G₀/G₁期细胞比例明显增加,G₂/M+S期细胞减少。结论: 含hGax的重组腺病毒载体构建成功,并在细胞中过表达。hGax基因过表达能有效抑制血清刺激后兔VSMCs的增殖和迁移,并使细胞停滞于G₀/G₁期。     

低氧对小鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及经典型蛋白激酶C表达的影响

目的:原代培养小鼠远端肺动脉平滑肌细胞（PASMC）,探讨低氧对PASMC增殖及经典型蛋白激酶C（cPKC）各亚型表达的影响。方法:原代培养小鼠远端PASMC,实验用4~8代传代细胞。采用免疫印迹、免疫荧光技术检测PASMC中cPKC各亚型的表达情况。将PASMC分为常氧组和低氧组,分别置于普通培养箱（5% CO ...     

转染Kv1.5基因抑制人气道平滑肌细胞的增殖

 目的：转染Kv1.5基因对人气道平滑肌细胞(HASMCs)增殖及凋亡的影响。方法:通过脂质体介导瞬时转染Kv1.5基因于培养的HASMCs中，以转染空载体pRc/CMV的细胞及未转染质粒的细胞为对照；用Western blotting 检测平滑肌细胞Kv1.5蛋白表达；用荧光光度法检测HASMCs胞内钙浓度；用流式细胞术观察细胞周期；用MTT法检测HASMCs 增殖及DNA 末端转移酶介导的原位缺口末端标记技术(TUNEL)检测细胞的凋亡。 结果: (1) 转染质粒组Kv1.5蛋白质的表达明显高于未转染组及空载体转染组(P<0.01); (2) 转染质粒组细胞胞内钙浓度明显低于未转染组及空载体转染组(P<0.05)，且其细胞周期中的G₀/G₁期细胞比例明显高于、细胞增殖率显著低于未转染组及空载体转染组(P<0.01)；同时，转染质粒组细胞的凋亡率明显高于未转染组及空载体转染组 (P<0.01)。 结论: 转染Kv1.5基因能抑制HASMCs的增殖、促进其凋亡，为进一步探讨哮喘气道重塑的机制及其治疗提供实验依据。     

SOCS3基因对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞原癌基因c-myc mRNA表达及细胞增殖的影响

目的：探讨SOCS3基因对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）原癌基因c-myc mRNA表达及细胞增殖的影响。 方法： 以脂质体为载体将pEFSOCS3和pSV2neo共转染至体外培养的PASMCs，G418筛选阳性克隆，应用免疫细胞化学法测定转染前后细胞中SOCS3蛋白表达；缺氧处理转染组和对照组PASMCs，采用半定量RT-PCR检测转染前后常氧组、缺氧培养2 h、6 h、12 h、16 h、24 h细胞c-myc mRNA表达水平变化；［3H］-TdR掺入法检测转染前后上述各时点细胞增殖情况。 结果： 免疫细胞化学法证实转染后细胞中有SOCS3稳定表达；半定量RT-PCR结果显示，SOCS3基因转染组细胞c-myc mRNA表达水平在缺氧各时点均显著低于同时点对照组细胞（P<0.01）；SOCS3基因转染组细胞在常氧和缺氧各时点［3H］-TdR掺入量显著低于对照组细胞（P<0.01）。 结论： SOCS3蛋白可能通过下调c-myc基因表达从而抑制缺氧诱导的PASMCs增殖。     

转染TFPI基因对人前列腺平滑肌细胞增殖的影响

目的良性前列腺增生（BPH）是严重危害老年男性健康的常见疾病,本研究旨在研究组织因子途径抑制因子（TFPI）基因对前列腺平滑肌细胞生长的影响,为良性前列腺增生的基因治疗提供参考依据。方法取前列腺增生患者手术切除的前列腺组织,采用酶消化法分离前列腺平滑肌细胞;免疫组化方法进行细胞鉴定;pIRES—TFPI基因转染前列腺平滑肌细胞,以pIRES基因作为基因转染阴性对照;用细胞计数法和四氮唑蓝MTT法观察细胞增殖情况;采用RT-PCR检测细胞内TFPI基因的表达情况。结果SMA免疫组化染色和MASSON染色显示：经过5次传代后,前列腺平滑肌细胞的纯度达到95％以上;TFPI基因转染后,前列腺平滑肌细胞内的TFPImRNA水平明显提高,是未转染组的7倍、阴性对照基因转染组的3．5倍;基因转染4d后,TFPI基因转染组的前列腺平滑肌细胞数明显低于阴性对照基因转染组。结论提示TFPI基因对前列腺平滑肌细胞的增殖具有调控作用,有必要对其作用机理进行进一步研究。     

低氧及HIF－1α基因转染对HepG2细胞基因表达谱的影响

 目的：应用基因芯片技术,研究缺氧及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)基因转染对HepG2细胞基因表达谱的影响。方法: 以常氧对照腺病毒(Ad-GFP)转染组（CC组）为对照组,常氧HIF-1α腺病毒(Ad-HIF)转染组（CH组）、低氧对照腺病毒(Ad-GFP)转染组（HC组）、低氧(2%O₂, 24 h) HIF-1α腺病毒(Ad-HIF)转染组（HH组）为实验组,提取HepG2细胞的总RNA,反转录成Cy3和Cy5标记的cDNA探针,与定制的包含1 628个能量代谢相关基因的cDNA芯片进行杂交,筛选出实验组与对照组差异表达基因并进行分析。结果: 与常氧对照腺病毒转染组相比较,常氧HIF-1α腺病毒转染组3个基因表达下调;低氧对照腺病毒转染组10个基因表达上调;低氧HIF-1α腺病毒转染组6个基因表达上调、1个基因表达下调。这些差异表达基因编码蛋白的功能涉及能量代谢、信号转导、细胞凋亡、转录和HIF-1调节、生物转化、酸碱平衡调节、细胞黏附分子等方面。结论: 低氧可以上调HepG2细胞能量代谢相关基因表达,HIF-1的转录调节作用可能是其重要环节。     

siRNA沉默EGLN1基因对低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞生长的影响

 目的:体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),利用小干扰RNA技术转染PASMCs干扰EGLN1基因表达,检测细胞活力变化,从而验证EGLN1在PASMCs活力变化中的作用。方法:采用原代培养PASMCs,构建出特异的EGLN1 siRNA脂质体并转染到PASMCs;分别在常氧和低氧下进行细胞培养,采用Western blot 检测PASMCs的EGLN1蛋白、VEGF蛋白表达水平;用CCK-8法检测细胞活力,探讨低氧条件下沉默EGLN1基因表达后对PASMCs活力的影响。结果:低氧下PASMCs活力变化和VEGF的蛋白水平表达较常氧下增加并呈时间依赖性;EGLN1沉默后,无论低氧和常氧下,PASMCs活力变化和VEGF的蛋白水平表达均受到抑制。结论:EGLN1基因参与调控低氧下大鼠PASMCs的生长,其调节可能是通过VEGF的介导而完成的。     

胍基丁胺抑制低氧培养大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖

目的：观察胍基丁胺对低氧培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响。 方法： 采用组织块贴壁法原代培养大鼠PASMCs，取对数生长期PASMCs分对照组和胍基丁胺组，比色法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活力，液闪计数仪测定［3H］-TdR掺入量，流式细胞仪测定细胞周期，图像分析法测定增殖细胞核抗原含量（PCNA）作为细胞增殖的指标。 结果： 常氧和低氧(2.5% O2)培养时，胍基丁胺组LDH活力与对照组LDH活力均无显著差异（P>0.05）；与单纯低氧组相比，50 μmol/L胍基丁胺可显著减少低氧培养PASMCs的［3H］-TdR掺入量(P<0.01)。随着胍基丁胺浓度从50 μmol/L逐渐增加至500 μmol/L，大鼠PASMCs ［3H］-TdR的掺入量亦随之减少(P<0.01)。与单纯低氧组相比，胍基丁胺可显著减少低氧培养PASMCs的PCNA的含量(P<0.01)，使G0/G1期细胞比例显著增加，G2/M期细胞比例显著减少(P<0.01)。 结论： 胍基丁胺对PASMCs不产生明显的细胞毒性作用；胍基丁胺可抑制低氧培养大鼠PASMCs的增殖，这种抑制作用呈剂量依赖性。     

小鼠肺细小动脉平滑肌细胞原代培养和鉴定以及低氧对其增殖与凋亡的影响

 目的：建立一种方法简单、重复性好、培养周期短的小鼠肺细小动脉平滑肌细胞（PASMCs）原代培养及传代方法,并初步探索低氧下小鼠PASMCs的增殖与凋亡情况。方法：无菌条件显微镜下分离小鼠肺细小动脉,经胶原酶I消化结合血清铺底法培养PASMCs。传代过程中弃除对细胞损伤大的离心步骤。倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学法和免疫荧光染色法进行α-平滑肌肌动蛋白鉴定,CCK-8显法及TUNEL法测定低氧下PASMCs的增殖与凋亡情况。结果：形态学观察、免疫细胞化学法和免疫荧光染色法鉴定均表明培养的细胞为PASMCs。与大鼠传代后的PASMCs典型的“峰-谷”样生长相比,传代后的小鼠PASMCs形态各异,没有此典型“峰-谷”规律。原代培养后5~7 d即传代,依据细胞活性可传3~5代。CCK-8法显示,与常氧组24 h比较,低氧组A值升高（P＜0.05）。TUNEL法结果显示低氧24 h后凋亡率较常氧组下降（P＜0.05）。结论：胶原酶I消化结合血清铺底法培养小鼠PASMCs,方法简单,培养周期短,重复性好,是一种值得推广的小鼠PASMCs体外培养方法。低氧可以促进小鼠PASMCs的增殖,抑制小鼠PASMCs的凋亡。     

红景天甙对缺氧状态下兔肺动脉平滑肌细胞增殖和c-fos、c-myc原癌基因表达的影响

目的:研究红景天甙(salidroside, Sal)对缺氧( 2%～3%)状态下兔肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖、DNA合成、细胞周期和c-fos,c-myc 原癌基因表达的影响.方法:应用细胞培养、四唑盐比色试验(MTT)、[3H] -胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入、细胞周期测定和斑点杂交的方法.结果:发现缺氧24 h可直接刺激PASMC,使MTT之OD值增加95%(P＜0.05),[3H]-T dR的掺入量增加140%(P＜0.01);在缺氧的PASMC培养液中加入Sal(1200 μg/mL)可抑制缺氧的这种促增殖作用,PASMC的MTT之OD值与[3H]-TdR掺入量与缺氧组相比显著下降(P＜0.05);流式细胞分析显示缺氧24 h PASMC G2/M期细胞比例比常氧组明显增多(P＜0.01),G0/G1期细胞比例明显减少(P＜0.05),与缺氧组相比Sal可增多PASMC G0/G1期细胞比例,减少G2/M期细胞比例(P＜0.05);缺氧可促进c-fos,c-myc原癌基因表达,该效应可被Sal所抑制.结论:红景天甙可抑制缺氧所致的PASMC增殖、DNA合成、进入G2/M期的细胞比例和c-fos,c-myc原癌基因表达.     

红景天甙对低氧培养的兔肺动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:研究红景天甙(Salidroside,Sal)对低氧(3%)条件下兔肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖、DNA合成、细胞内钙离子浓度的影响。方法:应用细胞培养、四唑盐比色试验(MTT)、[³H]-胸腺嘧啶核苷([³H]-TdR)掺入试验、Fluo-3和激光扫描共聚焦显微术测定细胞内Ca²⁺浓度等方法。结果:低氧24h可直接刺激PASMC,使MTT的A值增加62%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量增加138%(P＜0.01)。在低氧的PASMC培养液中加入Sal(32×10^-5mol/L)可抑制低氧的这种促增殖作用,与低氧组相比MTT的A值下降29%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量下降37%。在低氧的PASMC培养液中加入钙通道阻滞剂verapamil也可抑制低氧的促增殖作用,与低氧组相比较,MTT的A值下降23%(P＜0.05),[³H][³H]-TdR掺入量下降51%(P＜0.01)。PASMC的低氧培养可使细胞内Ca²⁺浓度明显增加(P＜0.05),Sal可抑制低氧所致的细胞内Ca²⁺浓度的上升。结论:红景天甙可抑制低氧促进PASMC增殖、DNA合成的作用,其机制可能与抑制低氧时细胞内Ca²⁺浓度增加有关。     

腺病毒介导Gax基因对血清刺激后兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的:通过腺病毒介导人生长终止特异性同源异形盒基因(Gax)转染体外兔血管平滑肌细胞(VSMCs),观察人Gax基因过表达对血清刺激后兔VSMCs增殖和凋亡的影响,为Gax基因成为理想的静脉桥再狭窄基因治疗的候选基因提供实验基础。方法:Ad5-hGax重组腺病毒载体转染兔VSMCs后,采用Western blot检测不同时间细胞中hGax蛋白的表达;MTT法检测Ad5-hGax对血清刺激后兔VSMCs的体外增殖抑制情况;转染72 h后流式细胞术检测Ad5-hGax诱导血清刺激后VSMCs的凋亡率。结果:转染后1 d、3 d、5 d,Ad5-hGax组细胞中的hGax蛋白均有明显表达;MTT法检测显示hGax基因过表达能明显抑制血清刺激后兔VSMCs的增殖;流式细胞术检测显示转染72 h后,hGax过表达能显著诱导血清刺激后兔VSMCs的凋亡。结论:hGax基因过表达能有效抑制血清刺激后VSMCs的增殖,并促进其凋亡,为腺病毒介导Gax基因治疗静脉桥再狭窄提供重要的实验基础。     

低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞血红素加氧酶-1 mRNA 表达及细胞增殖的影响

探讨血红素加氧酶－1（HO－1）mRNA在低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC0的表达及HO－1／一氧化碳（HO－1／CO）体系对PASMC增殖的影响。应用荧光定量RT－PCR法测定HO－1mRNA表达。用双波长法检测碳氧血红蛋白（HbCO)吸光值。应用免疫细胞化学方法检测细胞增殖核抗原（PCNA）及核转录因子－κB（NF-κB）的表达。发现HO－1 mRNA在常氧大鼠PASMC有低水平的表达，低氧12h HO-1mRNA水平是常氧时的1．5倍，且HbCO产量随之显著增高（P＜0．01）；低氧24h HO-1 mRNA表达呈回落趋势，HbCO产量亦有所减少，但两者仍高于常氧水平。低氧12h及24h PASMC PCNA核阳性反应颗粒表达较常氧时增强（P＜0．01，P＜0．001），使用HO抑制剂ZnPP-9，其PCNA该阳性反应颗粒表达较单纯低氧时增加更多（P＜0．001，P＜0．01）。低氧组核NF－κB阳性染色较常氧组增强（P＜0．001），使用ZnPP-9，其表达则比低氧时更多（P＜0．01）。低氧通过诱导大鼠PASMC的HO－1 mRNA基因表达，上调HO／CO体系活性，使内源性CO含量增高，抑制PASMC增殖；NF－κB参与了PASMC增殖的调控机制。     

抑制肌球蛋白轻链激酶活性对内皮素-1诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及凋亡失衡的影响

目的:观察抑制肌球蛋白轻链激酶(MLCK)对内皮素-1(ET-1)诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)增殖与凋亡失衡的影响。方法:细胞分成3组:对照组;内皮素-1组;内皮素-1+肌球蛋白轻链激酶抑制剂组(ET-1+M组)。干预72 h后,免疫印迹法测定细胞内MLCK表达水平;甘油凝胶电泳和免疫印迹法检测肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化水平,MTT比色法及[3H]-TdR掺入法检测PASMCs的增殖情况,流式细胞仪检测PASMCs的细胞周期变化及凋亡率。结果:同对照组比较,ET-1刺激后肺动脉平滑肌细胞MLCK蛋白表达显著增强、MLC磷酸化上调、增殖增多、凋亡率明显降低(均P0.05);加入MLCK抑制剂干预后,MLCK表达明显下降(P0.05)、MLC去磷酸化显著增强、逆转了ET-1对PASMCs增殖及凋亡的影响。结论:抑制MLCK能显著逆转内皮素-1诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的失衡。