腺病毒及脂质体法介导脐静脉内皮细胞转染的实验研究

目的:利用腺病毒载体和脂质体转染脐静脉内皮细胞探讨转染脐静脉内皮细胞的理想条件.方法:分别使用腺病毒载体和Lipofectamine 2000脂质体介导VEGF165基因转染脐静脉内皮细胞.转染后通过倒置荧光显微镜检测转染效率,对比探讨转染脐静脉内皮细胞的理想方法.结果:采用脂质体法转染脐静脉内皮细胞效果不理想,转染率约11.60%.采用腺病毒载体转染率明显高于脂质体法,且随感染复数增加而增加.结论:采用腺病毒介导VEGF165转染脐静脉内皮细胞较脂质体法转染效率高,当M0I=50时可作为转染安全有效的条件.这为细胞转染技术在脐静脉内皮细胞的研究提供实验基础.     

小分子聚乙烯亚胺与腺病毒结合增强基因转染效率的研究

目的 提高重组腺病毒在细胞中,特别是缺乏柯萨奇腺病毒受体的细胞中的转染效率.方法 将阳离子材料聚乙烯亚胺PEI与重组腺病毒通过电荷作用形成复合物,用激光粒度仪及电位分析仪测定其粒径和电位;以表达β半乳糖苷酶的重组腺病毒作为模型病毒,研究其在富含(A549)或者缺乏(MDCK、LLC)柯萨奇腺病毒受体细胞中的转染效率和毒性,并用荧光标记复合物,观察其进入细胞的能力.结果 与聚乙烯亚胺结合形成复合物可明显促进腺病毒进入细胞的能力,从而提高腺病毒在各种细胞中的转染效率,同时发现小分子的PEI-2 kD由于其较好的生物相容性,对腺病毒进入细胞后的传递影响较小,所以最终的基因传递效率要显著优于PEI-25 kD;PEI-2 kD在本复合物中表现出的细胞毒性要小于PEI-25 kD.结论 PEI-2 kD可以用于病毒载体和非病毒载体结合的基因传递研究.     

阴离子脂质体－阳离子脂质体复合物介导的基因转染

目的评价阴离子脂质体-阳离子脂质体复合物介导质粒转移至HepG2肝癌细胞中及其毒副作用。方法制备携载表达绿色荧光蛋白质粒的阳离子脂质体,与阴离子脂质体形成复合物。测定脂质体复合物的zeta电位,凝胶阻滞实验考察质粒包封情况,流式细胞仪测量各阴离子脂质体-阳离子脂质体复合物的转染效率,MTT法检测细胞毒性。结果复合物能完全包裹质粒,其zeta电位低于阳离子脂质体zeta电位;脂质体复合物介导的转染效率略低于阳离子脂质体,其细胞生存率高于阳离子脂质体。结论阴离子脂质体-阳离子脂质体复合物在降低细胞毒性的同时,可实现对HepG2细胞较高的转染效率。     

脂质体介导C-erbB-2反义寡核苷酸转染小鼠乳腺癌TM40D细胞的效率及毒性

目的 探讨阳离子脂质体为载体的反义寡核苷酸（ODNs）转染小鼠乳腺癌TM40D细胞的最佳转染效率及对细胞的毒性作用。方法 分别将有／无脂质体介导的反义ODNs转染小鼠乳腺癌TM40D细胞,应用流式细胞仪观察不同时间的反义ODNs的转染效率,荧光显微镜观察反义ODNs在细胞内的分布,全自动生化分析仪检测转染培养上清液的乳酸脱氢酶（LDH）浓度。结果 无脂质体介导的反义ODNs转染细胞效率随着时间的延长增加,6h达到63．00％。脂质体介导的反义ODNs转染细胞4h时转染效率达到高峰为72．23％。细胞内荧光强度与细胞转染效率相关。无脂质体介导的FAM标记的反义ODNs分布在细胞浆,脂质体介导的反义ODNs在细胞浆及细胞核内均有分布。各组LDH浓度无统计学差异。结论 脂质体介导组反义ODNs转染效率高于无脂质体组,同时转染高峰提前出现。脂质体促进反义ODNs进入细胞核内。短时间内阳离子脂质体及反义ODNS对细胞的毒性不明显。     

脂质体Geneshuttle20对STAT6反义核酸转染小鼠脾淋巴细胞影响的研究

目的探讨阳离子脂质体Geneshuttle20对STAT6反义核酸在小鼠脾淋巴细胞摄入、分布的影响作用。方法采用阳离子脂质体介导STAT6反义核酸转染小鼠脾淋巴细胞,应用流式细胞仪、荧光显微镜分别观察反义核酸的细胞摄入和胞内分布。结果反义核苷酸与脂质体(W/W)为2∶4时,细胞摄入率可以达到67.7%,较单独加入反义核酸提高转染效率6倍,细胞内平均荧光强度最强,细胞核染色较深。结论Geneshuttle20提高了细胞对反义寡核苷酸的摄取,促使其进入细胞核内发挥作用。     

转染内皮祖细胞的脂质体与腺病毒载体的比较

目的:比较脂质体和腺病毒作为肝细胞生长因子(HGF)基因转染内皮祖细胞载体的效力.方法:分离培养大鼠骨髓血管内皮祖细胞,并通过摄取DiL-acLDL、结合FITC-UEA-1及流式细胞术检测表面抗原CD133+进行鉴定.脂质体介导细胞转染,将细胞分为HGF质粒转染组(转染pIRES2-EGFP-HGF质粒)、空载质粒转染组(转染plRES2-EGFP质粒)和空白对照组.病毒介导细胞转染,细胞分HGF病毒转染组(pAdxsi-GFP-HGF重组腺病毒转染)、空载病毒转染组(导入pAdxsi-GFP腺病毒)和空白对照组.荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,ELISA法检测HGF的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖能力.结果:脂质体和腺病毒载体均可成功将绿色荧光蛋白标记的HGF基因转入内皮祖细胞,其中腺病毒转染效率更高,最高可达80％以上,其表达HGF水平以及细胞增殖能力都明显强于脂质体转染.空载病毒转染组细胞增殖与空白对照组差异无统计学意义(P＞0.05),而空载质粒转染组细胞增殖明显少于空白对照组(P＜0.05).结论:腺病毒作为HGF基因转染内皮祖细胞的载体相对于脂质体载体具有更高效、低毒、高表达目的基因的优点.     

星点设计优化非病毒载体前阳离子脂质体的制备工艺

目的 采用星点设计优化前阳离子脂质体的制备工艺并考察前阳离子脂质体的有关性质.方法 以薄膜分散膜挤压法制备前阳离子脂质体,以平均粒径、转染效率为指标,考察鱼精蛋白(Protamine)与质粒DNA的比例、脂质体骨架材料CHETA浓度、CHETA与质粒DNA的比例3个因素对制备条件的影响,将实验结果用数学方法处理并进行方程模型拟合,根据拟合方程及反应曲面图确定指标的最优值和各因素相对应的最佳取值范围.以LacZ为报告基因转染肝癌细胞HepG2,定量测定β-半乳糖苷酶活性和总蛋白含量,并计算转染效率.结果 影响平均粒径、转染效率的3个主要因子的最佳取值分别为:Protamine/DNA (2.5:1);CHETA (45%);CHETA/DNA (4:1).所制前阳离子脂质体形态近似于球体,平均粒径228.9±8 nm,多分散指数为0.122±0.02,Zeta电位为–25.08±2.5 mV,载基因前阳离子脂质体转染HepG2肝癌细胞转染效率为24.26±2.6 mU · mg-1.结论 星点设计应用简便、预测性好,制备的前阳离子脂质体符合设计要求.     

Ad-VEGF121和Ad-VEGF165重组腺病毒的构建和制备

目的:以pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统为载体构建用于实验动物模型基因治疗的Ad-VEGF121和Ad-VEGF165重组腺病毒。方法:采用RT-PCR方法从人心肌组织中扩增获得VEGF121、VEGF165cDNA片段,分别插入pUCm-T载体构成pUC-VEGFs;限制性内切酶SalⅠ、KpnⅠ切下目的基因片段,插入pAdTrack-CMV载体相应的多克隆位点构成pAdTrack-CMV-VEGFs。电转法将被PmeⅠ切成线性的pAdTrack-CMV-VEGFs转入E coli BJ5183,与其中的pAdEasy-1同源重组成pAdEasy-VEGFs。阳离子脂质体法将被PacⅠ线性化的重组子转染293T细胞进行腺病毒包装。转染后7～11d可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白(GFP)呈彗星状,收集细胞反复冻融获得含重组腺病毒的上清液。感染293T细胞3～4次,待细胞出现细胞病变效应(CPE)时收获腺病毒(Ad-VEGFs),并用CsCl密度梯度超速离心进行纯化。结果:重组腺病毒在电镜下呈多面体,形态完整;Ad-VEGF121和Ad-VEGF165病毒滴度分别达到1.155×1012和1.281 5×1012 V.P/mL。结论:利用pAdEasy-1缺陷性腺病毒系统构建携带目的基因的重组腺病毒方法较简便,易掌握。获得的重组腺病毒纯度高、滴度高,适用于实验动物模型和体外培养细胞的基因治疗。     

共表达人PUMA和HGF／NK4基因的重组腺病毒的制备及在胰腺癌细胞中的表达

目的制备同步表达HGF／NK4基因和PUMA基因的重组腺病毒,感染胰腺癌细胞后检测基因的有效表达。方法将PUMA基因和HGF／NK4基因以串联方式依次克隆至腺病毒穿梭载体,构建重组穿梭载体pAdTrack-PUMA-NK4,转化大肠杆菌BJ5183并在细菌内与腺病毒载体同源重组制备重组腺病毒载体pAd-PUMA-NK4。PacⅠ酶切后转染至HEK293细胞包装得到重组腺病毒。一定滴度的腺病毒感染人胰腺癌细胞株,荧光定量RT-PCR检测细胞中NK4和PUMA基因mRNA表达水平。结果双酶切重组pad-PUMA-NK4穿梭载体鉴定证实目的基因PUMA和HGF／NK4正确克隆;重组腺病毒载体经PacⅠ酶切得到特异的酶切产物转染HEK293细胞后成功包装出重组腺病毒;病毒感染胰腺癌细胞后3-9d内PUMA和NK4基因的表达水平较高,整体持续表达可维持2w。结论成功构建了同时表达NK4和PUMA基因的重组腺病毒载体并包装出相应的重组腺病毒颗粒,该腺病毒能有效感染胰腺癌细胞并高表达NK4和PUMA基因,这为进一步确定NK4和PUMA基因的功能及指导双基因联合治疗胰腺癌提供了理论依据和必要的材料。     

阳离子膜融合脂质体介导反义寡核苷酸在Hela细胞中的转染实验研究

目的研究阳离子膜融合脂质体(CFL)介导反义寡核苷酸(ASON)的细胞转染效率及影响因素。方法 逆相蒸发法制备3种不同阳离子含量的脂质体(CL),在CL上引入仙台病毒形成CFL,将制得的阳离子膜融合脂质体与反义寡核苷酸混合得到复合物,考察形态学及载药量,用MTT法考察该载体的细胞毒性,流式细胞仪测定阳性细胞百分率和平均荧光强度。结果制得的CFL形态均匀,粒径为(168±65) nm。载药量随着磷脂/ASON(+/-)电荷比增加而增加。CFL细胞毒性明显低于相同电荷比的CL,细胞转染效率是随阳离子含量、磷脂/ASON(+/-)电荷比增加而增加,血清和低温均对CFL的细胞转染有影响。结论阳离子膜融合脂质体作为载体在低电荷比条件下可降低细胞毒性并可提高细胞转染效率,可作为该ASON的给药系统而进一步研究。     

重组adv5.oriP.HRP腺病毒载体构建及对EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞株的靶向表达

目的:构建腺病毒载体adv5.oriP.HRP,观察其对EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞株的靶向表达。方法:采用p△EIsp1A穿梭质粒系统,酶切、定向克隆方法构建含HRP自杀基因的p△EIsp1A/oriP-HRP重组质粒,在293细胞中进行重组腺病毒adv5.oriP.HRP包装、扩增、纯化与病毒滴度测定,体外转染EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞株与EBV阴性鼻咽癌CNE-2Z细胞株,RT-PCR法检测不同细胞系中adv5.oriP.HRP的表达,Western blot法检测经不同浓度adv5.oriP.HRP转染后细胞中HRP蛋白的表达。结果:p△EIsp1A/oriP-HRP在293细胞中包装扩增后的病毒滴度为528@1012TCID50/L;体外转染鼻咽癌C666-1细胞株与CNE-2Z细胞株后,RT-PCR检测到C666-1细胞系1229bp处得明亮条带,而CNE-2Z细胞几乎未检测到重组基因mRNA的表达,Western blot可见随着MOI的增加C666-1细胞中HRP蛋白表达逐渐增多,而在CNE-2细胞中HRP蛋白的表达几乎呈阴性,两组间差别有统计学意义(P<0.05)。结论:重组腺病毒adv5.oriP.HRP能在EBV阳性的鼻咽癌C666-1细胞株内靶向性转染和表达。     

人可溶性sTNFR1及胞膜外区Ig融合基因重组腺病毒的真核表达及功能活性鉴定

目的构建携带人sTNFR1与IgGFc片段融合基因的重组腺病毒,稳定表达并初步鉴定其功能活性在妊娠哮喘炎症机制中的作用。方法将PCR扩增的sTNFR1及IgGFc基因片段先后连接到穿梭质粒pAdTrack-CMV多克隆位点上,酶切线性化后在BJ5183细菌内与骨架质粒pAdEasy-1同源重组,产生获得的AdE-EGFP-sTNFR1-Ig以脂质体法转染AD293细胞进行病毒包装,以绿色荧光蛋白(GFP)监测病毒滴度及感染效率。RT-PCR、Western blot实验鉴定细胞内重组腺病毒转录及融合基因与蛋白表达;流式细胞术、ELISA实验分析混合培养上清中转染肥大细胞(MC)激活、调节同基因来源T细胞表达Th2/Treg水平及细胞因子分泌效果;MTT评估转染细胞上清中sTNFR1-Ig对TNF-α介导细胞毒效应的拮抗作用。结果成功构建编码sTNFR1-Ig基因的重组腺病毒载体经酶切和测序鉴定正确,制备的腺病毒在转染细胞中的GFP表达以及CPE效应明显,扩增后的滴度为3.7×1010～4.8×1010pfu/ml,体外感染效率可达90%以上;sTNFR1-Ig基因在mRNA及蛋白水平获得的清晰条带均证实腺病毒包装与扩增成功。表达sTNFR1-Ig的MC诱导T细胞转化为CD4+CD25+Foxp3+T细胞水平以及IL-12含量均明显升高,CD4+IL-4+Th2细胞水平下调(P<0.05),Th2/Treg所占CD4+T细胞比值下降(P<0.05)。sTNFR1-Ig封闭TNF-α对MC免疫毒性作用的浓度效应明显,而EGFP-MCs与对照细胞上清对TNF-α毒性效应的中和阻断能力不足(P<0.05)。结论携sTNFR1-Ig基因重组腺病毒参与的免疫调控与妊娠期哮喘发生发展密切相关。sTNFR1及IgG-Fc亚基胞膜外区结合的表达和引起免疫耐受的作用研究,为妊娠哮喘发病机制在理论上的新突破,为以sTNFRI-Ig为靶点的妊娠哮喘干预治疗奠定基础。     

Recombinant adenovirus-mediated cytotoxic gene therapy and lymphoproliferative disorders: analysis based on pharmacodynamics

The literature has seen an incredible booming of publications related to the use of adenovirus-mediated gene therapy in cancer over the past decade. The use of recombinant adenoviruses as a therapeutic tool for lymphoproliferative disorders has also been evaluated in this context. Several approaches of adenovirus-mediated gene expression have been used to transfect cell lines that are derived from lymphoid tumors and would have otherwise been refractory to other transfection methods. The identification of high affinity receptor for human adenoviruses serotype 2 and 5, the coxsackie-adenovirus receptor (CAR), has raised the question about its relevance for the efficacy of recombinant adenovirus-mediated gene therapy. We have reviewed the published studies that have examined the use of recombinant adenovirus vectors expressing cytotoxic genes for gene therapy in lymphomas, chronic lymphocytic leukemia and multiple myeloma. Based on the concept that a recombinant adenovirus particle behaves like a drug, we address the issue of adenovirus-mediated gene therapy in terms of classic pharmacodynamics. We have analyzed the use of recombinant adenovirus-mediated cytotoxicity by assessing the importance of the biochemical and physiological signaling pathways interacting with these particular drugs and their mechanisms of action. The case of anaplastic large cell lymphoma is discussed as an example that better illustrates the concept of pharmacodynamics of recombinant adenoviral-mediated expression of cytotoxic genes. Ultimately, the issues derived from the use of such a modality of therapy that require further evaluation, are discussed in this review.     

Introduction of the conventional method of DNA transfection by adenovirus vector

DNA transfection techniques are necessary to perform the high throughput screening (HTS) for drug discovery. Among many transfection techniques, we will recommend the adenovirus vector for HTS as a particularly useful method. The adenovirus vector has attracted a great deal of attention as a vector for gene therapy and is also useful for studying gene functions in differentiated cells such as neurons and muscle cells. An efficient method of constructing recombinant adenoviruses has been established. In this article, we will introduce the method to produce the desired recombinant adenoviruses and show our findings using these adenoviruses.     

表达生存素相关microRNA-494基因腺病毒载体的构建

目的构建表达生存素(survivin)相关microRNA-494基因的重组腺病毒载体。方法应用生物学软件Targetscan 5.2对microRNA-494基因与survivin mRNA作相关性分析。RT-PCR调取目的基因,将其连接线性化后的穿梭质粒载体,联合骨架质粒转染入293细胞后同源重组产生重组腺病毒载体。PCR及测序验证重组质粒,荧光显微镜下观察腺病毒荧光蛋白表达。结果重组腺病毒载体构建成功。结论成功构建了重组腺病毒载体,可用于研究其在前列腺癌PC-3细胞中对survivin基因表达的影响。     

Approaches and methods in gene therapy for kidney disease

Renal gene therapy may offer new strategies to treat diseases of native and transplanted kidneys. Several experimental techniques have been developed and employed using nonviral, viral, and cellular vectors. The most efficient vector for in vivo transfection appears to be adenovirus. Glomeruli, blood vessels, interstitial cells, and pyelum can be transfected with high efficiency. In addition, electroporation and microbubbles with ultrasound, both being enhanced naked plasmid techniques, offer good opportunities. Trapping of mesangial cells into the glomeruli as well as natural targeting of monocytes or macrophages to inflamed kidneys are elegant methods for site-specific delivery of genes. For gene therapy in kidney transplantation, hemagglutinating virus of Japan liposomes are efficient vectors for tubular transfection, whereas enhanced naked plasmid techniques are suitable for glomerular transfection. However, adenovirus offers the best opportunities in a renal transplantation setup because varying parameters of graft perfusion allows targeting of different cell types. In renal grafts, lymphocytes can be used for selective targeting to sites of inflammation. In conclusion, for both in vivo and ex vivo renal transfection, enhanced naked plasmids and adenovirus offer the best perspectives for effective clinical application. Moreover, the development of safer, nonimmunogenic vectors and the large-scale production could make clinical renal gene therapy a realistic possibility for the near future.     

串联表达Fas shRNA腺病毒载体的构建

目的利用串联表达质粒pEGFP6-1-siFas1+siFas2和BDAdeno-X系统构建腺病毒表达Fas-shRNA载体。方法双酶切pEGFP6-1-siFas1+siFas2串联表达质粒和pShuttle2质粒,T4DNA连接酶连接胶回收片段,转化感受态Escherichiacoli(E.coli)DH5α菌株,挑取单克隆菌落LB(Luria-Bertani)培养基中扩增培养;小量质粒试剂盒提取pShuttle2-siFas1+siFas2质粒,酶切鉴定;双酶切pShuttle2-siFas1+siFas2质粒,T4DNA连接酶连接酶切产物和腺病毒BDAdeno-XViralDNA。回收连接产物,SwaI酶切去除未重组的腺病毒质粒,再回收酶切产物,转化感受态E.coliDH5α;聚合酶链反应(PCR)筛选鉴定阳性克隆;提取pAdeno-siFas1+siFas2质粒,进一步酶切鉴定;重组腺病毒pAdeno-siFas1+siFas2质粒线性化,经脂质体转染HEK293A细胞;收细胞进行裂解收病毒。结果构建表达2个Fas-shRNA的串联重组腺病毒载体pAdeno-siFas1+siFas2,经酶切鉴定和PCR分析,重组腺病毒质粒构建正确;经HEK293A细胞包装成功。结论成功构建表达2个Fas-shRNA的串联重组腺病毒载体pAdeno-siFas1+siFas2,为进一步转染细胞和感染小鼠抑制Fas基因表达奠定了基础。     

人胰岛素样生长因子-1重组腺病毒转染C17.2神经干细胞增殖及分化的影响

目的观察人胰岛素样生长因子-1重组腺病毒(Ad-IGF-1)转染对C17.2神经干细胞体外增殖和分化的影响。方法体外培养及鉴定C17.2神经干细胞,Ad-IGF-转染C17.2神经干细胞;Western-blotting法检测IGF-1蛋白的表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IGF-1蛋白的表达曲线;MTT检测C17.2神经干细胞增殖,NSE及MBP免疫组化观察C17.2神经干细胞体外分化。结果转染AdIGF-1的C17.2神经干细胞成功表达IGF-1蛋白;IGF-1蛋白在病毒转染5～7d达高峰,13d仍高于转染前,Ad-IGF-1转染后各时间C17.2神经干细胞的增殖与对照组相比有显著差异,Ad-IGF-1转染对c17.2神经干细胞向神经元细胞及神经胶质细胞的分化与对照组相比有显著差异。结论Ad-IGF-1转染c17.2神经干细胞可稳定表达IGF-1,Ad-IGF-1转染促进C17.2神经干细胞的增殖及向神经元细胞和少突胶质细胞的分化。     

整合素靶向性病毒载体对肿瘤细胞基因转导的促进作用

在进行基因导入研究及临床试验中，目前采用的载体通常包括了病毒及非病毒两大类。对于非病毒载体用于基因转染有许多报道。而腺病毒作为基因载体，因其具有的高效转导能力及对分裂或非分裂细胞均能转导等优点而被广泛应用于针对疾病的基因治疗中。对腺病毒进入细胞机制进行的深入研究结果发现，腺病毒与细胞结合的第一步是与细胞表面的柯萨奇腺病毒受体（coxsackie adenovirus receptor，CAR）结合，第二步是利用其在五角体基（pentonbase）中的RGD序列和细胞表面的整合素结合，     

Anti-tumor responses induced by chemokine CCL19 transfected into an ovarian carcinoma model via fiber-mutant adenovirus vector

Considerable attention has recently been paid to the application of chemokines to cancer immunotherapy because of their chemotactic affinity for a variety of immune cells and because several chemokines are strongly angiostatic. In the present study, the recombinant adenovirus vectors encoding chemokine CCL19 or XCL1 in an E1 cassette (AdRGD-mCCL19 and AdRGD-mXCL1) were developed. The constructed fiber-mutant adenovirus vector, which contained the integrin-targeting Arg-Gly-Asp (RGD) sequence in the fiber knob, notably enhanced the transfection efficiency to OV-HM ovarian carcinoma cells compared to that induced by conventional adenovirus vector. The results of an in vitro chemotaxis assay for chemokine-encoding vector demonstrated that both AdRGD-mCCL19 and AdRGD-mXCL1 could induce the migration of cells expressing specific chemokine receptors. Of the two chemokine-encoding vectors evaluated in vivo, AdRGD-mCCL19 showed significant tumor-suppressive activity in B6C3F1 mice via transduction into OV-HM cells, whereas XCL1 did not exhibit any notable anti-tumor effects, suggesting that CCL19 may be a candidate for cancer immunotherapy.