RNA干扰抑制Hep-2细胞人端粒酶逆转录酶基因表达对放射敏感性的影响

目的构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因特异性短发夹样RNA(shRNA)真核表达载体,观察其联合射线对人喉癌Hep-2细胞端粒酶活性和细胞存活的影响,研究hTERT基因在放射增敏中的作用。方法根据hTERT mRNA编码序列设计RNA干扰(RNAi)靶点,构建重组表达质粒pshRNA-hTERT,构建成功后,转染Hep-2细胞并作射线处理,用端粒重复序列扩增方法(TRAP-PCR- EHSA)检测端粒酶活性的动态变化,采用克隆形成分析方法观察质粒pshRNA-hTERT对Hep-2细胞放射敏感性的影响,计算放射增敏比SER_(SF2)。结果转染质粒pshRNA-hTERT后,Hep-2细胞的hTERT mRNA表达抑制率为60.8%,质粒pshRNA-hTERT不仅能够抑制Hep-2细胞的端粒酶活性(P<0.05),而且还可以抑制辐射诱导的端粒酶活性上升(P<0.05)。照射前经pshRNA-hTERT处理24h,明显降低了2Gy照射后Hep-2细胞的存活分数(85.7%),与单纯放射组(67.7%)相比,差异有统计学意义(P<0.05),pshRNA-hTERT的放射增敏比SER~(SF2)为1.27。结论RNAi显著抑制了靶基因hTERT的表达,质粒pshRNA-hTERT能明显抑制2Gy照射诱导的Hep-2细胞端粒酶活性升高,并显著提高其体外放射敏感性;质粒pshRNA-hTERT的放射增敏作用可能与端粒酶活性受抑制有关。     

褪黑素通过促凋亡协同增强顺铂对人喉癌细胞增殖的抑制作用

目的:研究褪黑素(melatonin,MT)对人喉癌细胞增殖与凋亡的影响及MT增强人喉癌细胞对顺铂(cisplatin,DDP)治疗的敏感性.方法:采用不同质量浓度MT和DDP单独或联合处理Hep-2细胞;通过CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,采用两药相互作用指数(co-efficient of drug interaction,CDI)评估MT是否影响Hep-2细胞对DDP的敏感性.结果:CCK-8检测结果显示,单用MT或DDP可浓度依赖性抑制Hep-2细胞的增殖,MT可协同增强DDP对Hep-2细胞的增殖抑制作用(CDI＜1).流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期结果显示,MT可促进Hep-2细胞凋亡以及增加亚G1期细胞比例(P＜0.01),MT可协同DDP促进Hep-2细胞凋亡[0.5 mmol/L MT联合20μg/ml DDP组的细胞凋亡率显著高于20 μg/ml DDP组,(40.9±3.0)％vs(11.0±0.9)％,P＜0.01]以及亚G1期细胞比例[0.5 mmol/L MT联合20 μg/mlDDP组的亚G1期细胞比例显著高于20 μg/ml DDP组,(73.0±2.4)％vs(40.4±3.0)％,P＜0.01].加入Caspase抑制剂Z-VAD-fmk可逆转MT和/或DDP对Hep-2细胞的增殖抑制作用和凋亡诱导作用(均P＜0.01).结论:MT能以Caspase依赖的方式诱导人喉癌细胞Hep-2的凋亡,从而协同增强DDP对细胞的增殖抑制作用.     

重组人血管内皮抑制素联合电子线照射对肺腺癌A549移植瘤的实验研究

背景与目的:有研究表明放疗能够上调和强化肿瘤血管的生成过程,导致放疗耐受;重组入血管内皮抑制素(recombinant human endostatin,rh-endostatin)可抑制肿瘤血管生成,改善由放疗引起的耐受性.本研究旨在探讨rh-endostatin与顺铂(cisplatin,DDP)分别联合电子线照射对肺腺癌A549移植瘤的抑制作用.方法:建立A549肺腺癌移植瘤模型,待瘤径达1.0 cm时,将实验鼠随机分成4组(每组6只):对照组、照射组、照射+DDP组和照射+rh-endostatin组.定期测量肿瘤最长径和最大垂直径,第16天时处死裸鼠,取出肿瘤组织,检测肿瘤细胞凋亡率,RT-PCR检测bFGF mRNA表达水平,免疫组织化学法检测VEGF表达水平.结果:对照组、照射组、照射+DDP组和照射+rh-endostatin组肿瘤的生长速率分别为(162±6)%、(131±8)%、(104±7)%和(108±11)%(P<0.05);照射+rh-endostatin组与照射组相比以及照射+DDP组与照射组相比,差异均具有统计学意义(P<0.01);照射+rh-endostatin组与照射+DDP组相比,差异无统计学意义(P>0.05).肿瘤细胞凋亡率,对照组、照射组、照射+DDP组和照射+rh-endostatin组分别为(12.2±1.1)%、(16.5±0.8)%、(24.4±1.5)%和(20.5±1.9)%,各组间差异具有统计学意义(P<0.05).照射组bFGF mRNA和VEGF表达水平高于对照组,照射+rh-endostatin组bFGF mRNA和VEGF表达水平明显低于对照组、照射组、照射+DDP组(P<0.05).结论:rh-endostatin明显提高了照射对A549n肺腺癌移植瘤的抑制情况;rh-endostatin联合照射肺腺痛A549移植瘤可取得与DDP联合放疗相似的结果.     

反义Ki-67肽核酸对裸鼠人肾癌细胞移植瘤的治疗作用

目的:探讨Ki-67基因反义肽核酸(AS-PNAs)在体内对小鼠人肾癌移植瘤Ki-67表达和肿瘤生长的影响.方法:建立人肾癌移植瘤裸鼠模型,瘤体内注射反义肽核酸(AS-PNAs),定期测量肿瘤体积,处死小鼠后采用免疫组化、Western blot检测肿瘤Ki-67抗原表达,原位末端标记法(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡,并与反义寡核苷酸(AS-ODN)处理组对照.结果:AS-PNAs处理组肿瘤生长受押(513.2±64.2)mm3,Ki-67表达下降(23.0±2.4)%、(59.7±2.3)%,细胞凋亡增加(31.1±2.0)%,与AS-ODN处理组(868.9±128.2)mm3、(33.6±2.6)%、(85.7±4.4)%、(18.3±2.3)%比较差异有显著性(P＜0.01).结论:反义Ki-67肽核酸能抑制小鼠人肾癌移植瘤Ki-67基因的表达,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长,且优于反义寡核苷酸.     

Ki67基因干扰对裸鼠人肾癌细胞移植瘤的抑制作用

目的:探讨靶向Ki67基因干扰腺病毒(Ad-Ki67)对裸鼠人肾癌移植瘤Ki-67基因表达和肿瘤生长的影响.方法:建立人肾癌移植瘤模型,瘤体内注射Ad-Ki67,定期测量肿瘤体积,激光共聚焦显微镜观察移植瘤组织Ki-67抗原表达,原位末端标记法(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡.结果:Ad-Ki67能将Ki67基因有效沉默.Ad-Ki67组和Ad-EGFP组Ketr-3细胞Ki-67抗原表达水平分别为对照组的(78.7±6.5)%、(95.4±8.6)%:与对照组细胞凋亡阳性率(10.7±2.4)%比较,Ad-Ki67、Ad-EGFP组分别为(43.7±3.6)%和(21.8±2.5)%,表明Ad-Ki67能有效诱导肿瘤细胞凋亡;Ad-Ki67能显著抑制肿瘤的生长,接种5周后Ad-Ki67组肿瘤体积为(469.5±41.6)mm,.Ad-EGFP组为(664.3.5±47.8)mm3,PBS组为(884.9±52.5)mm3.结论:靶向Ki67基因的干扰腺病毒Ad-Ki67对裸鼠肾癌移植瘤有显著的治疗效果,为治疗肾癌提供新的平台.     

MiR-125a靶向调节P53表达对人喉癌细胞增殖、凋亡以及放射治疗敏感性的影响

摘 要：［目的］ 探究miR-125a通过靶向调节p53的表达对人喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡以及放射治疗敏感性的影响。［方法］ 培养人喉癌Hep-2细胞系,利用慢病毒分别转染miR-125a与空白质粒,RT-PCR法检测转染后各组细胞中miR-125a水平,采用MTT法检测细胞增殖情况。X线照射各组细胞后,行克隆形成实验、微核检测和流式细胞检测法检测转染细胞凋亡水平及放射敏感性,通过在线软件预测p53基因为miR-125a直接调控的靶基因,Western blot检测凋亡相关蛋白水平并进一步验证miR-125a与p53的关系,及在喉癌细胞放射治疗中的作用。［结果］ MTT实验结果示,转染miR-125a后Hep-2细胞增殖能力明显下降（P<0.05）。克隆形成实验与微核检测结果表明高表达miR-125a可使Hep-2细胞放射敏感性显著提高。流式细胞仪检测结果0Gy下Hep-2-miR-125a、Hep-2-con220组,10Gy下Hep-2-miR-125a、Hep-2-con220组凋亡率分别为(6.30%±0.11%),(0.09%±0.02%),(18.15%±2.49%),(1.95%±0.08%)(P<0.01)。TargetScan软件预测TRIAP1（TP53 regulated inhibitor of apoptosis 1）为miR-125a的直接调控的靶基因,Western blot实验结果显示高表达miR-125a可正向调控p53的表达,从而增强Hep-2细胞对X线的放射敏感性。［结论］ MiR-125a表达上调后可能通过上调p53的表达使Hep-2细胞增殖受到抑制,诱使其发生凋亡,并提高放射敏感性。     

bFGF单抗联合放疗对小鼠B16移植瘤的协同抑制作用

目的:探讨碱性成纤维细胞因子单克隆抗体(basic fibroblast growth factor monoclonal antibody,bFGF-mAb)联合放疗对小鼠B16移植瘤的抑制效应。方法:制备并提纯小鼠bFGF-mAb,建立荷B16黑素瘤小鼠模型并随机分为对照组、放疗组、bFGF-mAb组及联合治疗组。各组经相应治疗后,测量移植瘤体积;治疗20 d后处死小鼠,取移植瘤称瘤质量,计算抑瘤率。TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡率,免疫组化检测移植瘤组织bFGF、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达率及肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)。结果:bFGF-mAb治疗、放疗、联合治疗的抑瘤率分别为30.49%、12.17%和48.76%,联合治疗组的抑瘤率明显高于其他组(P<0.05);与放疗组比较,联合治疗组的放射增敏率为2.37。联合治疗组移植瘤细胞凋亡较放疗组、bFGF-mAb组及对照组明显增多[(58.56±6.47)%vs(17.21±2.86)%,(28.45±5.47)%,(10.62±1.73)%;P<0.05或P<0.01],其bFGF、VEGF表达水平下降,MVD明显减少(P<0.05)。结论:bFGF-mAb联合放疗对B16移植瘤具有协同抑瘤效应,通过降低肿瘤组织bFGF和VEGF表达、抑制血管新生、促进瘤细胞凋亡提高放疗敏感性。     

射线联合嵌合启动子介导的自杀基因对肿瘤细胞的靶向杀伤作用

目的 探讨放射线联合新型嵌合启动子介导辣根过氧化物酶/吲哚乙酸(HRP/IAA)自杀基因系统特异高效的抗肿瘤作用.方法 构建含有4个串联放射反应元件CArG、含或不含巨细胞病毒(CMV)启动子的人端粒酶逆转录酶嵌合启动子,筛选肿瘤特异性及放射诱导性强的嵌合启动子,下游连接自杀基因辣根过氧化物酶(HRP),检测放射线联合基因治疗对肿瘤细胞HeLa、A549和MHCC97增殖及凋亡的影响.结果 人胚肺成纤维细胞MRC-5中C4-hTC嵌合启动子的活性(0.1±0.0)明显低于肿瘤细胞株HeLa、A549和MHCC97(0.6±0.0、1.1±0.1和1.0±0.1,P＜0.01),经过6 Gy射线诱导后,这种差异更加显著(活性分别为0.2±0.1、1.7±0.2、2.3±0.2和2.3±0.1,P＜0.01).在肿瘤细胞株HeLa、A549和MHCC97中,嵌合启动子C4-hTC-HRP携带的自杀基因系统SER值分别为2.64、2.75和2.82,显著高于单纯hTERT启动子.在肿瘤细胞中,除阴性对照质粒pGL3-control-Luc外,自杀基因与放射治疗相联合对肿瘤细胞的生长抑制明显高于单一治疗方法,而联合组中pC4-hTC-HRP/IAA系统与放射联合的生长抑制作用最显著,对HeLa、A549和MHCC97细胞的生长抑制率分别为67.3%、69.0%和64.6%.在肿瘤细胞中,除阴性对照质粒pGL3-control-Luc外,联合组诱导的早期凋亡率明显高于单一治疗方法组,其中pC4-hTC-HRP/IAA系统与放射联合诱导的凋亡率最高,HeLa、A549和MHCC97细胞凋亡率分别为39.6%、33.0%和33.2%.结论 新型嵌合启动子C4-hTC具有良好的肿瘤特异性及放射诱导性,放射线联合基因治疗对肿瘤细胞具有特异高效的杀伤作用,在肿瘤的基因放疗中具有较强的应用潜力.

Abstract：

Objective To explore the synergistic anti-tumor effect of radiotherapy and horseradish peroxidase/prodrug indole-3-acetic acid (HRP/IAA) gene therapy system using chimeric hTERT promoter responsive to ionizing radiation.Methods The synthetic hTERT promoters containing four tandem-repeat copies of radio-inducible CArG elements, and the chimeric promoter containing cytomegalovirus (CMV)early promoter were both constructed.The activities of the chimeric promoters in cancer cell lines ( HeLa,A549, and MHCC97 ) and normal cell line ( MRC-5 ) were detected using luciferase reporter gene expression analysis after a 60 Co γ-irradiation treatment at a series of doses (a single dose of 0 to 10 Gy).The anti-tumor effect of combining irradiation with HRP/IAA gene-directed enzyme prodrug therapy system controlled by the chimeric promoter was tested by colony formation assay, cell counting and apoptosis analysis.Results The chimeric promoters were ineffective in normal human cells, even after irradiation, but the expression of luciferase gene in tumor cells was significantly higher.The activity of the chimeric promoter in MRC-5 cells was 22.3%, 12.9% and 13.6% of that in HeLa, A549 and MHCC97 cells, respectively.After irradiation,the ratios were 11.7%, 8.7% and 8.8%, respectively.Furthermore, the chimeric promoters could successfully induce the expression of luciferase gene following different doses of radiation, with maximal inducible activity seen after 6 Gy irradiation.The chimeric promoter containing four tandem-repeat copies of radio-inducible CArG elements and CMV early promoter showed the highest activity with 6 Gy irradiation.The relative luciferase activities in HeLa, A549 and MHCC97 cells were 1.7 ± 0.2, 2.3 ± 0.2 and 2.3±0.1, respectively.The chimeric promoter mediated suicide gene therapy system could increase radiosensitivity in different cancer cells.Compared with the control system, it plus irradiation showed stronger cell proliferation inhibition, 67.3% vs.26.1% in HeLa, 69.0% vs.28.3% in A549, 64.6% vs.20.8% in MHCC97 cells, and also higher apoptosis-inducing effect, 39.6% vs.14.2% in HeLa, 33.0% vs.12.4%in A549, and 33.2% vs.14.2% in MHCC97 cells.Conclusions Chimeric promoter containing hTERT promoter, CArG elements and CMV promoter preserve the tumor-specificity in telomerase-positive tumor cells, and irradiation-responsive to low dose of radiation.The suicide gene therapy using this promoter plus radiotherapy show a strong anti-tumor effect in vitro.It is expected to have a good potential for future application in gene radiotherapy.     

喉癌组织Tob基因表达及其与5-FU化疗敏感相关性的初步探讨

目的:探讨Tob基因与喉癌的相关性及其表达增高对喉癌细胞凋亡、增殖能力和对化疗药物5-FU敏感性的影响.方法:荧光定量PCR检测74例喉癌及相应癌旁正常组织中Tob基因的表达;真核表达载体pcDNA3.1-Tob转染Hep2细胞;蛋白质印迹检测转染后Tob基因的表达;MTT法测定细胞生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡;联合应用5-FU后检测细胞的凋亡和增殖情况.结果:Tob基因在喉癌组织中表达较癌旁正常组织明显下调(t=28.915,P=0.001);转染后Tob基因表达增强明显,细胞抑制率由(2.436±0.062)%增加至(14.921±0.027)%(t=-202.868,P=0.000),凋亡率由2.90%增加至4.98%(t=36.945,P=0.001);联合应用1、5和10μg/mL 5-FU后,细胞抑制率也由(12.090±0.053)%、(14.230±0.037)%和(19.460±0.072)%分别增加至(19.850±0.104)%、(23.700±0.080)%和(34.280±0.122)%,凋亡率由10.7%、16.8%和19.22%分别增加至25.63%、34.07%和40.35%,差异均有统计学意义,P＜0.05.结论:Tob基因的表达异常与喉癌的发生相关,是喉癌潜在的肿瘤抑制基因,其表达增高能够抑制肿瘤细胞的增殖并促进细胞凋亡,并能够在一定程度上增强肿瘤细胞对化疗药物5-FU的敏感性.     

白细胞介素-8沉默对喉鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

目的探讨白细胞介素-8(IL-8)沉默对喉鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响及相关机制。方法将IL-8小干扰RNA(siRNA)和Lipofectamine 2000转染试剂转染至喉鳞状细胞癌Hep-2细胞作为实验组和NC组仅转染Lipofectamine 2000转染试剂的细胞作为,未做处理的细胞作为空白组。采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,蛋白质印迹法(Western blot)检测IL-8、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、cleaved caspase 3、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(B AX)的相对表达量。结果实验组喉鳞状细胞癌Hep-2细胞中IL-8蛋白的相对表达量明显低于NC组和空白组细胞,OD值明显低于NC组和空白组细胞(P<0.01)。实验组喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的凋亡率明显高于空白组和NC组细胞(P<0.01)。实验组Hep-2细胞中p-AKT和抑制凋亡蛋白Bcl-2的相对表达量均低于空白组和NC组细胞,而促凋亡蛋白B AX和cleaved caspase 3的相对表达量均高于空白组和NC组细胞(P<0.05)。3组Hep-2细胞AKT蛋白的相对表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论IL-8可通过对磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT相关信号通路的调控,抑制喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的增殖能力,并促进其凋亡,为喉鳞状细胞癌的诊断和治疗提供了新的靶点及可能的治疗策略。     

人喉癌5-氟尿嘧啶耐药细胞株的建立及其生物学特性

目的:建立人喉癌5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)耐药细胞系,为喉癌的耐药机制研究提供模型。方法:以高剂量浓度递增间歇给药的方法诱导筛选人喉癌Hep-2的多药耐药细胞株Hep-2/5-FU,比较两组细胞的形态和倍增时间;MTT法确定细胞的IC50及其耐药指数;流式细胞仪检测两组细胞的细胞周期分布以及细胞内的罗丹明聚集;实时定量PCR法检测MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测相应MDR1-P蛋白的表达。结果:建成性能稳定的Hep-2/5-FU耐药细胞株,并与顺铂及长春新碱有不同程度的交叉耐药性,且Hep-2/5-FU细胞倍增时间较Hep-2细胞延长[(31.25±4.37)h vs(25.62±3.53)h,P<0.05]。Hep-2/5-FU细胞G0/G1期比例升高[(45.6±3.4)%vs(30.5±1.2)%,P<0.05],而S期比例明显降低[(32.1±4.2)%vs(52.4±3.6)%,P<0.05];Hep-2细胞内的罗丹明较Hep-2/5-FU细胞明显升高[(89.83±0.52)%vs(14.38±0.48)%,P<0.01];Hep-2/5-FU细胞MDR1 mRNA[(13.69±1.12)vs(17.82±0.61),P<0.05]及其编码的MDR1-P蛋白水平高于Hep-2细胞。结论:Hep-2/5-FU细胞株具有明确及稳定的多药耐药性,为喉癌的耐药机制提供了研究的模型。     

mTOR siRNA对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生物学行为的影响

目的观察mTOR siRNA对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖能力的影响。方法选取45例喉鳞状细胞癌组织和45例正常喉黏膜组织,采用免疫组织化学法检测mTOR蛋白的表达;将喉鳞状细胞癌Hep-2细胞分为空白对照组、空载体组和mTOR siRNA组,及正常对照组、溶剂对照组和雷帕霉素组,分别利用mTOR siRNA和雷帕霉素进行治疗,采用Western bloting法检测不同浓度的mTOR siRNA和雷帕霉素分别处理细胞后对mTOR蛋白表达的影响,并采用CCK-8试剂盒分析mTOR蛋白表达下调对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖能力的影响。结果 mTOR蛋白在喉鳞状细胞癌组织中表达的阳性率显著高于正常喉黏膜组织(P<0.05)。3种不同浓度mTOR siRNA分别转染Hep-2细胞24、48、72 h,各组与空白对照组、空载体组相比,mTOR蛋白表达均有所降低(P<0.05),且mTOR蛋白表达随mTOR siRNA浓度的增加、作用时间的延长而降低(P<0.05)。3种不同浓度雷帕霉素处理Hep-2细胞24、48、72 h,各组与溶剂对照组及正常对照组相比,mTOR蛋白表达量均有所降低(P<0.05);且mTOR蛋白表达随雷帕霉素浓度的增加、处理时间的延长而降低(P<0.05)。与空白对照组、空载体组相比,各mTOR siRNA组的Hep-2细胞增殖在转染后24、48、72 h均受到明显抑制(P<0.05)。结论 mTOR siRNA均能降低喉鳞状细胞癌Hep-2细胞中mTOR蛋白的表达,有效抑制细胞的生长,为喉鳞状细胞癌的分子治疗提供了理论依据。     

miRNA-106b下调后抑制人喉鳞状细胞癌Hep-2和TU212细胞侵袭能力的机制研究

目的探讨miRNA-106b(miR-106b)对人喉鳞状细胞癌Hep-2和TU212细胞的作用及其机制。方法将Hep-2和TU212细胞分为转染miR-106b抑制序列组(实验组)、转染miR-106b竞争性阴性序列组(阴性对照组)、未进行任何干预组(空白组)。采用反转录定量聚合酶链反应(qRT-PCR)验证miR-106b抑制序列对细胞miR-106b表达的抑制效应。应用生物信息学及荧光素酶报告载体分析磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)是否为miR-106b的靶基因。利用PTEN小干扰RNA(siRNA)抑制Hep-2和TU212细胞中PTEN的表达。Transwell实验和蛋白质印迹法分别检测miR-106b沉默后和(或)PTEN干扰后Hep-2和TU212细胞侵袭能力的变化及PTEN、上皮性钙黏蛋白和波形蛋白表达变化。结果实验组Hep-2和TU212细胞miR-106b相对表达量分别为0.110±0.037、0.074±0.009,较阴性对照组(1.013±0.059、1.035±0.062)均降低(均P<0.05)。Transwell实验中,实验组Hep-2和TU212细胞较阴性对照组每个视野侵袭细胞数少[(37.09±4.02)个比(95.65±4.77)个,(29.16±2.49)个比(103.19±6.08)个,均P<0.05]。生物信息学分析显示PTEN mRNA的3'-UTR区与miR-106b的3'-UTR区域互补;双荧光素酶报告系统分析显示,转染miR-106b的野生型PTEN基因的荧光素酶报告子的活性降低至(22.84±2.68)%,转染miR-106b的突变型PTEN基因的荧光素酶报告子的活性几乎未改变[(92.08±3.44)%],二者差异有统计学意义(P<0.001)。实验组Hep-2和TU212细胞PTEN蛋白表达水平较阴性对照组高。Transwell实验检测显示,抑制PTEN表达的实验组Hep-2和TU212细胞比未抑制PTEN表达的实验组每个视野侵袭细胞数增加[(65.08±3.57)个比(26.72±2.58)个,(57.38±4.96)个比(31.81±2.97)个,均P<0.05]。蛋白质印迹实验显示,抑制PTEN表达的实验组Hep-2和TU212细胞上皮性钙黏蛋白表达水平上调,波形蛋白表达水平下调。结论人喉鳞状细胞癌Hep-2和TU212细胞中miR-106b可能通过靶向调节PTEN的表达,影响PTEN下游侵袭相关蛋白,而改变细胞侵袭能力。     

miRNA let-7a 调控HMGA2表达抑制喉癌细胞增殖并促进其凋亡的作用机制

目的:探讨在喉癌细胞株Hep-2中上调miRNA let-7a的表达对高迁移率族蛋白（high mobility group A,HMGA2）的作用机制以及对喉癌细胞增殖的影响。方法:合成miRNA let-7a 模拟体（let-7a mimics）并采用阳离子脂质体法转染入Hep-2内;分别用流式细胞术和MTT法检测let-7a高表达对细胞凋亡和增殖的影响;实时荧光PCR（Real-time qPCR）和Western blot检测上调let-7a后对HMGA2表达的影响。结果:本实验将let-7a mimics成功转染入Hep-2内,流式细胞术及MTT法检测显示Hep-2内let-7a的表达上调会抑制喉癌细胞的增殖,促进喉癌细胞的凋亡。RT-qPCR检测显示:let-7a mRNA在空白组和阴性对照组（NC组）的表达水平明显低于实验组（P<0.05）;HMGA2 mRNA在空白组、NC组的表达水平明显高于实验组（P<0.01）。Western blot检测细胞中HMGA2蛋白的表达显示:实验组HMGA2蛋白的表达量明显低于空白组和NC组（P<0.01）。上述实验中空白组与NC组之间比较均无统计学差异（P>0.05）。结论:let-7a能够显著下调HMGA2基因和蛋白的表达,抑制喉癌细胞的增殖,促进其凋亡,为喉癌基因靶向治疗提供坚实的理论基础。     

CrkⅡ表达水平对喉癌细胞Hep-2增殖、迁移及侵袭的影响

目的探讨CrkⅡ表达水平对喉癌细胞Hep-2增殖、迁移及侵袭的影响。方法采用免疫组化法检测CrkⅡ在108例喉癌患者喉癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,分析不同临床特征喉癌患者喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达情况。构建并验证CrkⅡRNA干扰质粒,将培养后的Hep-2细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阴性对照组(转染阴性对照质粒)和实验组(转染CrkⅡ干扰质粒),细胞转染后行实时聚合酶链反应(PCR)扩增。采用蛋白质印迹法(Western blot)检测转染后Hep-2细胞中CrkⅡ的表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖情况,Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力,细胞划痕实验检测细胞的迁移情况。结果喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达率明显高于癌旁正常组织(P﹤0.01)。临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、组织分化程度为中低分化、有淋巴结转移喉癌患者喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达率均高于临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、组织分化程度为高分化、无淋巴结转移的喉癌患者(P﹤0.05)。实验组喉癌细胞Hep-2中CrkⅡmRNA和蛋白的相对表达量均低于阴性对照组、空白对照组(P﹤0.05)。实验组穿过基质膜至下室的细胞数目低于阴性对照组和空白对照组(P﹤0.05)。转染48 h时,实验组细胞的迁移率低于阴性对照组、空白对照组(P﹤0.05)。细胞培养24、48、72 h时,实验组Hep-2细胞的光密度(OD)值均低于空白对照组和阴性对照组(P﹤0.05)。结论喉癌细胞Hep-2中CrkⅡ的表达下调可降低细胞的增殖、迁移和侵袭能力,CrkⅡ有可能成为喉癌临床治疗的新靶点。     

癌相关成纤维细胞对喉癌细胞系Hep-2生物学行为影响的体外研究

目的 探讨癌相关成纤维细胞(CAFs)在体外的分泌功能及对喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响.方法 提取江西省肿瘤医院2016-09-09 1例喉鳞状细胞癌手术患者的癌组织及癌旁组织,进行喉癌CAFs及正常成纤维细胞(NFs)的原代培养.ELISA试剂盒测定CAFs和NFs培养上清液中MMP-2、MMP-9的浓度.制备...     

Regulatory Effects of WRAP53 on Radiosensitivity of Laryngeal Squamous Cell Carcinoma Cells

Background: Telomere length is closely associated with cellular radiosensitivity and WRAP53 is required fortelomere addition by telomerase. In this research we assessed radiosensitivity of laryngeal squamous cell carcinomaHep-2 cell lines after WRAP53 inhibition, and analyzed the molecular mechanisms. Materials and Methods:phWRAP53-siRNA and pNeg-siRNA were constructed and transfected into Hep-2 cells with lipofectamine.Expression of WRAP53 was analyzed by RT-PCR and Western-blottin, radiosensitivity of Hep-2 cells wasassessed colony formation assay, and the relative length of telomeres was measured by QPCR. Results: The datarevealed that the plasmid of phWRAP53-siRNA was constructed successfully, and the mRNA and protein levelsof WRAP53 were both obviously reduced in the Hep-2 cell line transfected with phWRAP53-siRNA. After Hep-2cells were irradiated with X-rays, the D0 and SF2 were 2.481 and 0.472, respectively, in the phWRAP53-siRNAgroup, much lower than in the control group (D0 and SF2 of 3.213 and 0.592) (P<0.01). The relative telomerelength in the phWRAP53-siRNA group was 0.185±0.01, much lower than in the untreated group (0.523±0.06)and the control group (0.435±0.01). Conclusions: Decreasing the expression of WRAP53 using RNA interferencetechnique can enhance the radiosensitivity of Hep-2 cell lines by influencing the telomere length. WRAP53 isexpected to be a new target to regulate the radiosensitization of tumor cells.