微孔板神经元NMDA损伤模型的建立及药物神经保护作用评价

[目的]建立96微孔板神经元N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）损伤模型,并评价NMDA受体拮抗剂氯胺酮和抗炎症药米诺环素（minocycline）对神经元NMDA损伤的保护作用。[方法]用96微孔板原代培养的新生大鼠神经元体外培养至第10天（DIV10）时,用不同浓度的NMDA处理不同时间,以形态学和MTT染色为指标观察神经元的损伤情况,并观察氯胺酮和米诺环素对50μmol／L NMDA处理3h造成的皮层神经元急性损伤的作用。[结果]随着NMDA浓度的增加和作用时间的延长,其神经毒性增加。氯胺酮100、10、1μmol／L和minocycline 135、45μmol／L预处理对50μmol／L NMDA处理3h造成的皮层神经元急性损伤有明显的保护作用（P〈0．01）。[结论]96微孔板培养的原代神经元NMDA损伤模型可以用于评价药物对神经元损伤的保护作用。     

小檗碱诱导大鼠神经元毒性死亡的研究

目的：研究小檗碱对原代培养的大鼠大脑皮质和小脑颗粒神经元的直接作用及Ｂｅｒ与间接胆红素的相互作用。方法；采用二乙酸荧光素（ＦＤＡ）和Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ＤＮＡ染色法，观察神经元的存活率及形态学特征；用琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪分析Ｂｅｒ诱导神经元死亡的生化学特征。结果：Ｂｅｒ呈剂量（０￣２０μｍｏｌ／Ｌ）依赖性诱导原代培养的大鼠大脑皮质和小脑颗粒神经元死亡。其死亡的机制呈现坏死的特征：包括神     

盐酸小檗碱对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的 研究小檗碱对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其相关机制.方法 实验采用腹腔注射链脲佐菌素65mg/kg复制糖尿病大鼠模型,实验共分5组,糖尿病大鼠假手术组;糖尿病大鼠模型组;小檗碱5、10、20mg/kg 3个剂量组.用BL-420生物采集系统记录各组大鼠心率、左室收缩压、左室舒张末压、左室压力变化速率;...     

体外原代培养胎鼠大脑皮层神经元NMDAR1亚基表达的发育性变化

目的 探讨体外原代培养胎鼠大脑皮层神经元NMDAR1（NR1）亚基表达的发育性变化。 方法 利用体外原代培养Wistar孕14～15d胎鼠大脑皮层神经元,采用免疫荧光法鉴定神经元的纯度和NR1亚基在神经元上的定位,采用流式细胞术和免疫印迹法（Western  blot）检测不同培养时间神经元NR1亚基的表达情况 结果 体外原代培养的胎鼠大脑皮层神经元纯度均达到90%以上,免疫荧光标记显示NR1亚基主要分布在神经元胞膜及树突干膜上,流式细胞仪检测培养1、2、3、4、6、9、12d神经元NR1亚基平均荧光强度分别为4.57±0.99、8.18±1.22、13.67±1.99、20.33±1.03、26.30±2.88、31.71±2.47、28.63±1.40,Western blot显示细胞膜蛋白中NR1亚基在1～2d表达微弱,3～6d表达逐渐增高,6d以后保持稳定。  结论 体外原代培养的胎鼠大脑皮层神经元NR1亚基有发育性变化,这种变化与神经元的成熟度有关。     

新生大鼠大脑皮层神经元原代培养与鉴定

目的:建立一种较理想的新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法。方法:新生大鼠大脑皮层通过胰酶消化获取单细胞悬液,用台盼蓝染色鉴定活性后种板培养;培养第3~4天加入阿糖胞苷纯化神经元;最后用甲苯胺蓝染色检测尼氏体进行鉴定。结果:实验获取细胞存活率高;在体外培养条件下细胞生长旺盛,培养第6~7天,细胞胞体较大,突起粗,分支多,突起交织成网,并能形成典型的神经细胞网络;培养第10~14天,检查有尼氏体细胞占90%以上。结论:该培养技术是大鼠皮层神经元体外培养的一种较理想的方法。     

小檗碱对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的观察小檗碱对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法结扎大鼠冠状动脉左前降支30min,再灌90min后复制出大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,观察小檗碱对大鼠心肌梗死范围及心肌酶学的影响,采用原位标记法检测各组凋亡细胞及指数。结果小檗碱能减少心肌梗死范围,减少心肌细胞磷酸肌酸激酶（CPK）和乳酸脱氢酶（LDH）的释放。与假手术组比较,模型组和小檗碱预处理组凋亡指数均显著增高,但小檗碱预处理组凋亡指数明显低于模型组。结论小檗碱对大鼠心肌缺血再灌注损伤有明显保护作用,其机制可能与抑制心肌细胞凋亡有关。     

小檗碱对Aβ25-35损伤大鼠皮层神经元的保护作用

目的 考察小檗碱对Aβ_25-35损伤的神经元的保护作用，并初步探讨其机制。方法 40 μg/mL Aβ_25-35作用原代培养大鼠脑皮层神经元36 h，复制阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）细胞模型，同时加入小檗碱进行干预，实验分为对照组、模型组、0.5 μmol/L小檗碱组，2 μmol/L小檗碱组。通过Hoechst33258染色观察神经元凋亡形态；Annexin V-FITC/PI双标流式细胞术检测早期凋亡情况；Western blotting检测活化的Caspase-3蛋白表达，实时荧光定量RT-PCR检测型雷帕霉素靶（target of rapamycin，mTOR）相关基因表达。结果 与对照组比较，AD细胞模型神经元凋亡明显增加。2 μmol/L小檗碱能显著减少Aβ损伤神经元早期凋亡（P＜0.05），0.5、2 μmol/L小檗碱均能抑制异常活化的Caspase-3蛋白表达。0.5、2 μmol/L小檗碱显著下调了AD模型异常活化的mTOR mRNA和下游底物核糖体S6蛋白激酶（S6kinase，S6K）P70S6K mRNA的表达（P＜0.05、0.01），同时显著上调了AD细胞模型真核细胞始动因子4E结合蛋白1（4E binding protein，4EBP1）mRNA的表达（P＜0.01）。结论 小檗碱对Aβ_25-35损伤的原代培养大鼠皮层神经元具有一定神经保护作用，其保护作用可能是通过抑制mTOR途径实现的。     

四氢小檗碱对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的：研究四氢小檗碱（ＴＨＢ）对大鼠全脑缺血再灌注损伤的作用。方法：采用改良的４血管结扎法制作大鼠全脑缺血再灌注损伤模型，比较ＴＨＢ组和对照组的脑组织超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性和丙二醛（ＭＤＡ）含量及细胞形态学改变。结果：ＴＨＢ（缺血前后分次ｉｐ４０、４０、２０ｍｇ／ｋｇ）能提高全脑缺血３０ｍｉｎ再灌注３０ｍｉｎ大鼠大脑皮质和海马ＳＯＤ活性，并降低ＭＤＡ含量。延长再灌注时间至７２ｈ，大鼠大脑皮质、纹状体和海马神经元形态学受损较重，ＴＨＢ（ｉＰ４０ｍｇ／ｋｇ·ｄ×４ｄ）有明显保护大脑皮质和纹状体神经元的作用，但对海马组织无保护作用。结论：ＴＨＢ对短暂全脑缺血损伤有一定的保护作用。     

大鼠皮质神经元的体外培养和纯化

目的：探讨大鼠皮质神经元分离纯化的有效方法。方法：取胎鼠大脑皮质细胞，分别在不同的培养液中进行原代培养，利用相差显微镜对培养的细胞进行动态观察；并以免疫细胞化学技术对神经元进行染色。结果：在相差显微镜下可见加用N2添加剂和胎牛血清培养的神经元生长良好，胞体形态多样，突起数目多，长度长，与邻近神经元的胞体或突起形成接触，而胶质细胞则大量死亡，神经元纯化率达94％以上，未加用N2添加剂培养的神经元胶质细胞大量存在，神经元纯化率达50％左右。结论：N2添加剂和胎牛血清联合应用可使大鼠皮质神经元得到良好的生长和有效纯化。     

小檗碱诱导大鼠神经元毒性死亡的研究

目的：研究小檗碱（Ｂｅｒ）对原代培养的大鼠大脑皮质和小脑颗粒神经元的直接作用及Ｂｅｒ与间接胆红素的相互作用。方法：采用二乙酸荧光素（ＦＤＡ）和Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８ＤＮＡ染色法，观察神经元的存活率及形态学特征；用琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪分析Ｂｅｒ诱导神经元死亡的生化学特征。结果：Ｂｅｒ呈剂量（０～２０μｍｏｌ／Ｌ）依赖性地诱导原代培养的大鼠大脑皮质和小脑颗粒神经元死亡。其死亡的机制呈现坏死的特征：包括神经元胞体肿大、无明显核染色质浓缩、ＤＮＡ随机断裂而在凝胶电泳图上呈弥散样改变、流式细胞仪分析未见凋亡峰。用蛋白质合成抑制剂预处理神经元，不能阻断Ｂｅｒ的神经毒性作用。无毒性剂量下的Ｂｅｒ（１μｍｏｌ／Ｌ）与无毒性剂量下的胆红素相加，可产生神经元的毒性。结论：Ｂｅｒ诱导原代培养的大鼠大脑皮质和小脑颗粒神经元坏死，并增强胆红素的神经毒性作用。     

阿魏酸对NMDA诱导的体外培养神经细胞损伤的保护作用

目的应用培养的胎鼠皮层神经细胞观察阿魏酸对N-甲基-D-天门冬氨酸(30μmol／L)诱导的皮层神经元损伤的保护作用；方法取17-18d胎龄大鼠皮层神经元进行分离培养。通过光镜观察细胞形态变化并测定乳酸脱氢酶(LDH)的漏出量来观察阿魏酸的保护作用；结果阿魏酸可以使细胞损伤减轻，使LDH在培养液中漏出量显著降低，并呈剂量依赖性；结论阿魏酸对NMDA损伤的神经元有保护作用。     

全脑缺血大鼠原癌基因c-fos表达及小檗碱的影响

采用结扎大鼠双侧颈总动脉合并低血压后再恢复供血造成大鼠脑缺血再灌注模型，运用斑点杂交技术，观察大鼠全脑缺血再灌注中海马ｃ－ｆｏｓｍＲＮＡ表达变化，并观察小檗碱的作用。     

高碘对原代培养的大鼠皮层神经元细胞凋亡影响的实验研究

目的研究高碘对原代培养的大鼠皮层神经元细胞凋亡的影响,并对其机制作初步探讨。方法采用体外新生大鼠皮层神经细胞培养法观察不同浓度的碘化钾对神经细胞凋亡及其一氧化氮（NO）含量及一氧化氮合酶（NOS）活性的影响。结果高碘可以诱发原代培养的大鼠皮层神经元细胞发生凋亡,细胞凋亡率随碘化物浓度的升高而升高,实验组细胞的NO含量及NOS活性较正常对照组增高。结论高碘可以诱导原代培养的大鼠皮层神经元细胞发生凋亡,并呈剂量依赖关系,其机制可能与NOS活性及NO含量增高有关。     

吡那地尔对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞缺氧缺糖损伤的保护作用

目的 :探讨ATP敏感性K+ 通道 (KATP)开放剂吡那地尔 (pinacidil,Pin)对缺氧缺糖再复氧损伤大鼠大脑皮层神经细胞的保护作用。方法 :体外培养大鼠大脑皮层神经细胞 ,细胞培养至 10d ,建立神经细胞缺氧缺糖损伤模型 ,观察Pin及KATP阻断剂格列苯脲对缺氧缺糖不同时间 ,再复氧 2 4h后细胞死亡率、丙二醛 (MDA)含量、超氧化物歧化酶 (SOD)活力的影响。结果 :缺氧缺糖、再复氧后大鼠的神经细胞死亡率均显著升高、MDA生成增多、SOD的活力下降 ,Pin干预后 ,细胞死亡率下降、MDA生成减少、SOD的活力升高 ;格列苯脲能拮抗Pin这种保护作用。结论 :Pin对缺氧缺糖损伤神经细胞具有保护作用 ,并与拮抗氧自由基有关     

参麦注射液对培养鼠大脑皮层神经细胞缺氧损伤的保护作用

目的探讨参麦注射液对培养鼠大脑皮层神经细胞缺氧损伤的保护作用。方法将培养8d后生长良好的神经细胞随机分为正常组、模型组、参麦组和尼莫地平组;每组设3个培养瓶,正常组不作任何处理,其余3组均分别在缺氧后30min、1h、3h、6h和12h5个时间点造成神经细胞缺氧损伤模型。参麦注射液(1∶50)和尼莫地平(20μg/mL),分别在缺氧前24h及缺氧后加入,相差显微镜下观察神经细胞形态学的变化,测定DNA裂解率。结果参麦组和尼莫地平组的神经细胞在缺氧损伤后的形态学改变明显比模型组轻,DNA裂解率与模型组相比亦有显著性差异(P<0.05)。结论参麦注射液可能通过抑制细胞凋亡而对缺氧损伤的鼠大脑皮层神经细胞具有保护作用。     

预吸氧对大鼠脑皮质神经元损伤的影响

目的：观察不同浓度预吸氧、缺氧和复氧对大鼠脑皮质神经元损伤的影响。方法：72只成年雄性Wistar大鼠随机分为A、B、C 3组,每组又分为4个亚组。AⅠ-AⅣ（预吸氧）亚组分别吸入21%、50%、75%和95%氧30min;BⅠ-BⅣ（预吸氧-缺氧）亚组按A组方法处理后再吸入5%氧20min;CⅠ-CⅣ（预吸氧-缺氧-复氧）亚组按B组方法处理后,再吸入98%氧20min。取各组大鼠大脑皮质,测定乳酸（LA）、丙二醛（MDA）、氧自由基（OFR）、总抗氧化能力（T-AOC）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和氨基酸的含量或活力。用免疫组化法检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。在光镜下观察神经元形态学改变。结果：AⅠ、AⅡ亚组神经元无明显改变,AⅢ、AⅣ亚组神经元轻度肿胀。B组神经元肿胀明显,以BⅢ、BⅣ亚组较为严重。C组神经元胞核固缩,核仁缩小、消失,其中以CⅡ亚组最轻,CⅢ、CⅣ亚组最重,甚至可见核裂解、消失、只残余细胞轮廓的鬼影细胞。与AⅠ亚组相比,AⅢ-AⅣ亚组OFR、iNOS和LA增加（P〈0.05）,提示这三种损伤因子参与了脑损伤;T-AOC增加（P〈0.05）,可能是由于损伤因子引起了某些抗氧化因子的反馈性增加;T-SOD降低（P〈0.05）,可能与其消耗增加有关。CⅠ-CⅢ亚组的OFR和CⅠ、CⅣ亚组的iNOS以及CⅡ、CⅣ亚组的LA高于A组中各对应亚组（P〈0.05）,提示复氧性脑损伤可能与这三种因子的增加有关。结论：75%以上浓度预吸氧可引起大鼠轻微脑损伤,并使随后发生的缺氧复氧性脑损伤加重。50%浓度预吸氧不引起大鼠脑损伤,并可使随后发生的缺氧复氧性脑损伤减轻。     

神经生长因子对CoCl2诱导原代培养神经元缺氧损伤的保护作用

目的：研究神经生长因子（nerve growth factor,NGF）对氯化钴（CoCl2）诱导原代培养神经元缺氧损伤的保护作用.方法：利用CoCl2（125 μmol/L）诱导的原代培养小鼠大脑皮层神经元,观察系列实验指标：光镜观察NGF（终浓度为100 ng/ml）对细胞形态的影响,MTT比色法观察NGF对细胞活力的影响,检测细胞外液LDH释放量观察NGF对细胞膜稳定性的影响.结果：NGF能明显提高CoCl2诱导的神经细胞的活力,降低其LDH释放量,稳定细胞膜.结论：NGF对CoCl2诱导神经元缺氧损伤有明显的保护作用.     

知母皂苷B对体外培养的大鼠皮层神经元树突发育的影响

目的探讨知母皂苷B（Saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge,SAaB）对体外培养大鼠乳鼠大脑皮层神经元树突发育的促进作用。方法选用出生0～24h的Sprague—Dawley（SD）大鼠乳鼠,取皮层神经元进行体外细胞培养,培养4d的神经元用于实验。应用倒置相差显微镜测量培养神经元树突分支总长度（TDBL）、一级树突数目（PDN）、最大分支级数（MBO）和神经元胞体面积。Western印迹法观察神经元突触素蛋白表达的改变。结果形态学观察结果显示SAaB（10、30、100μmol／L）可明显促进树突发育,表现为树突分支总长度增加、一级树突数目增多、最大分支级数增大及胞体面积增大。并呈明显浓度依赖。Western印迹结果显示SAaB（10、30、100μmol／L）也可明显增加突触素蛋白表达水平,并呈明显浓度依赖。结论SAaB对体外培养皮层神经元树突的发育有促进作用。     

全脑缺血再灌模型大鼠皮层神经元GluR2表达的变化

目的:采用免疫组化技术,研究全脑缺血后再灌不同时点大鼠皮层神经元AMPA受体亚单位GluR2表达的变化,探讨GluR2在缺血性神经元损伤中的作用。方法:将36只SD大鼠随机分为6组,即正常组、缺血再灌注后2h、12h、24h、48h、72h 5个时间点组。参照改良的Pulsinelli四血管闭塞法制备全脑缺血大鼠模型,缺血再灌后的大鼠分别在存活2h、12h、24h、48h及72h后采用免疫组化法测定皮层神经元GluR2的表达量。结果:模型再灌5个时点之间SD大鼠皮层神经元GluR2表达量没有统计学差异(P>0.05),但与正常组相比,各组的的表达量明显降低(P<0.05)。结论:脑缺血再灌后皮层神经元AMPA受体亚单位GluR2表达减少,介导胞外Ca2+内流,引起神经细胞死亡。