人胃癌抑制消减cDNA文库的构建及文库质量分析

目的 :构建人胃癌抑制消减cDNA文库 ,为进一步大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定基础。方法 :从胃癌和癌旁正常组织分离poly(A) +RNA ,经反转录后 ,利用抑制消减杂交(SSH)方法 ,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果与结论 :挑取 80 0个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段 ,结果显示其中 750个克隆有插入片段 ,片段大小范围为 2 50～ 70 0bp。为进一步大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定了基础。     

+Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库的构建

目的：应用抑制性消减杂交技术构建 Gz重复暴露大鼠脑和正常大鼠脑差异表达的cDNA消减文库，为筛选 Gz暴露大鼠脑差异表达基因，探讨 Gz引起脑损伤的分子机制奠定基础。方法：Wister大鼠随机分成对照组和 Gz重复暴露组，对照组大鼠G值为 1Gz，实验组大鼠在动物离心机上经历了3次 10Gz/min（两次间间隔30min）作用，于暴露后6h处死取脑。分别从 Gz重复暴露组和对照组大鼠脑中提取poly(A) RNA，依次合成单链及双链cDNA，用RsaI酶切成大小不等的片段。将 Gz重复暴露组cDNA分为两组，分别与两种不同的接头连接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将PCR产物与T/A载体连接构建 Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库。结果：成功构建具有高消减效率的 Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库，非特异性cDNA片段被有效地消减，特异表达的cDNA得到富集。结论： Gz暴露大鼠脑cDNA消减文库的建立为进一步筛选、克隆 Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交技术筛选膦甲酸钠免疫调节基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建膦甲酸钠(PFA)处理的人T淋巴细胞Jurkat差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆PFA免疫调节相关基因,阐明PFA免疫调节的分子生物学机制。方法 以PFA处理Jurkat细胞,同时以生理盐水处理的相同细胞作为对照;24h后制备细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa1酶切后,将实验组cDNA分成两组．分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性多聚酶链反应(PCR)扩增,将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建了PFA处理淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到46个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的14个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得11种已知基因序列和3个未知基因。结论 应用SSH技术成功构建了PFA处理的淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库,为进一步阐明PFA的免疫调节机制及深入了解PFA防治病毒性肝炎的药理作用机制提供了依据。     

+10 Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因cDNA文库的构建

目的构建＋10Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因的消减cDNA文库。方法本实验用SD大鼠，分别提取暴露组与对照组的总RNA，并分离纯化mRNA，应用抑制性消减杂交技术分离＋10GI重复暴露大鼠脑差异表达基因eDNA片段并建立消减eDNA文库；利用PCR对随机挑选的75个白色菌落进行插入片段的验证，对其中70个克隆进行eDNA斑点杂交验证。结果所构建的eDNA文库扩增后包含约400个白色克隆和100个兰色克隆，随机挑选75个白色克隆入质粒载体后共获得70个阳性克隆。结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了＋10Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因消减eDNA文库，为进一步筛选和克隆脑损伤相关基因奠定了基础。     

SSH方法分离大剂量照射后小鼠骨髓差异表达EST序列

目的 为探讨骨髓辐射损伤的分子机理，研究了整体照射条件下，辐射前后骨髓基因表达的变化。方法 小鼠7Gyγ射线照射后4h提取骨髓总RNA为实验方(tester)，对照组动物骨髓总RNA为驱动方(driver)；实验方、驱动方总RNA由SMART cDNA合成方法合成双链cDNA，进而由抑制消减杂交(SSH)方法获得消减杂交产物．消减杂交产物克隆到T载体建立消减文库；对部分克隆进行杂交筛选及序列比对。结果 消减杂交文库挑取800个克隆进行PCR扩增，阳性率约为86％；部分克隆经两轮杂交筛选获得14个差异片段；7个差异片段与鼠EST库已有序列高度相似，其余7个差异片段可能是新的EST序列。结论 大剂量照射后小鼠骨髓cDNA消减文库的建立以及部分差异表达EST的验证为进一步研究辐射相关差异表达基因奠定基础。     

应用抑制性消减杂交技术研究甘草甜素免疫调节靶基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建甘草甜素刺激的人T淋巴细胞Jurkat差异表达基因的cDNA消减文库，筛选并克隆甘草甜素免疫调节靶基因，阐明甘草甜素免疫调节的分子生物学机制。方法以甘草甜素刺激Jurkat细胞，同时以生理盐水刺激的相同细胞作为对照；24h后提取mRNA并逆转录为cDNA，进行抑制性消减杂交分析并构建cDNA消减文库，随机挑选文库克隆，PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到28个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的22个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得11种已知蛋白基因编码序列。主要包括IL-12、IL-18、胸腺素等免疫调节基因。结论应用SSH技术成功构建了甘草甜素处理的淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库。为进一步阐明甘草甜素的免疫调节机制及深入了解甘草甜素用于防治病毒性肝炎的药理作用机制提供了依据。     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因

应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒pcDNA3.1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果显示,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到233个白色克隆,进行菌落PCR分析,其中213个均得到100～1000bp插入片段。挑取63个插入片段测序分析,其中6个cDNA片段为未知序列,通过生物信息学分析获得其全长序列,已被GenBank收录。提示6个新的cDNA全长序列,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A（HCV NS5A）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因。以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(－）-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(－）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到121个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到115个200－1000bp的插入片段，对其中的90个片段测序，并进行同源性分析，显示31种在基因编码蛋白和15种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示，成功构建了HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。     

抑制差减杂交筛选辐射致癌差异表达基因

目的筛选研究辐射诱发小鼠肿瘤相关差异表达基因。方法以^60Coγ射线照射诱发的小鼠白血病动物模型为研究对象，采用抑制差减杂交技术构建辐射致癌差异表达基因cDNA文库，鉴定后挑取阳性克隆测序，并与GeneBank数据库进行同源性比对分析。结果抑制差减杂交筛选得到102个阳性克隆，随机挑选30个克隆进行菌液PCR，扩增得到28个特异性插入片段，DNA测序结果经与GeneBank数据库比对发现代表了24个已知基因，其中3个为重复检出基因，暂未发现有未知序列基因。结论成功建立辐射致癌差异表达基因cDNA文库，初步筛选获得24条表达上调的差异片段，该结果将有助于充实完善辐射致癌的分子机制。     

肝细胞内人类次要组织相容性抗原-HA8蛋白反式激活基因的筛选

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选肝细胞内人类次要组织相容性抗原-HA8(HLA-HA8)的反式激活基因。方法以HLA-HA8基因表达质粒pcDNA3.1(-)-HLA-HA8和空载体pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞,提取mRNA并反转录合成双链cDNA(dscDNA),分别标记为Tester和Driver;经RsaI酶切后,将Tester cDNA分成两组,分别与两种不同的接头adapter 1和adapter 2衔接,再与Driver cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将产物与pGEM-T easy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建HLA-HA8反式激活基因差异表达cDNA消减文库。扩增后得到101个阳性克隆,菌落PCR分析均得到200~1000bp的插入片段。随机挑选其中28个阳性片段测序,同源分析结果显示,共获得16种编码基因,其中4个功能未知。结论 HLA-HA8基因反式调节基因与细胞结构和生长、物质及能量代谢、物质转运和信号转导密切相关,为HLA-HA8的功能以及HBV感染慢性化机制研究提供了新的思路。     

三氧化二砷体外诱导人HepG2细胞铁蛋白基因表达的研究

目的 了解低剂量三氧化二砷诱导的HepG2细胞的差异表达基因，揭示慢性砷中毒对肝细胞损伤的作用机制。方法 在体外用三氧化二砷(Sμmol／L)处理HepG细胞，同时以PBS处理的相同细胞系作为对照；24h后制备细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成2组，分别与2种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR)，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌JM109进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建三氧化二砷处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到：109个白色克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的36个克隆进行测序，通过生物信息学分析发现铁蛋白重链和轻链在三氧化二砷诱导的肝HepG2细胞正向消减cDNA文库中显著上调，共有8个阳性克隆子。结论 低剂量三氧化二砷刺激细胞后可诱导铁蛋白的表达上调，暗示铁蛋白在砷诱导的肝细胞损伤中起作用。     

氡染毒小鼠骨髓细胞差异表达cDNA文库的构建和初步鉴定

目的 构建氡染毒小鼠骨髓细胞差异表达基因的cDNA文库。方法 采用HD-3型多功能氡室对雄性BALB/c小鼠动态吸入染毒,建立实验动物模型。按照实验动物吸入氡及其子体的累积剂量分为实验组(105 WLM)和对照组(室内本底浓度,1 WLM)。取骨髓细胞提取总RNA,采用SMART和抑制性消减杂交技术,构建正、反向消减cDNA文库,消减cDNA片段插入pMD18-T载体转化大肠杆菌,以含差异表达cDNA片段的菌液为模板进行巢式PCR扩增。结果 获得了完整无降解的总RNA,得到高效率的消减cDNA文库;克隆了244个有插入片段和长度在100～1100bp之间的单克隆。结论 成功构建了氡暴露小鼠骨髓细胞差异表达的正、反向cDNA消减文库。     

应用抑制性消减杂交技术筛选XTP3的反式激活基因

目的应用抑制性消减杂交技术构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减库,克隆XTP3反式激活相关基因。方法以XTP3表达质粒pcDNA3．1(-)XTP转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减库,并转染大肠杆菌进行库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果库扩增后得到30个白色克隆,经菌落PCR分析,得到23个200～1000bp插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,共得到20种已知基因序列和2种未知功能基因序列,可能是XTP3反式激活靶基因。结论成功构建了乙型肝炎病毒xTP3反式激活基因差异表达的cDNA消减库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定了基础。     

快速老化小鼠海马抑制消减cDNA文库的构建

目的：构建快速老化小鼠(senescence-accelerated mouse，SAM)海马抑制消减cDNA文库。方法：以SAM快速老化亚系SAM-prone/8(SAMP8)海马作为实验组，抗快速老化小鼠亚系SAM—resistance/1(SAMR1)海马作为对照组，应用抑制消减杂交(SSH)技术，构建海马特异表达cDNA抑制消减文库；用蓝白斑筛选，以鉴定文库质量。结果：构建文库的阳性克隆率为96.18％，克隆中cDNA片段介于250-2000bp之间。结论：成功构建了SAMP8海马抑制消减文库。     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBeAg结合蛋白1反式激活基因

目的筛选与克隆HBeAg结合蛋白1(HBEBP1)新基因的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索。方法应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆HBEBP1反式激活的新型靶基因。以HBEBP1表达质粒pcDNA3．1(-)-HBEBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减库,并转染大肠杆菌进行库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HBEBP1反式激活基因差异表达的cDNA消减库。库扩增后得到85个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。对26个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因,包括14种已知基因和1种未知基因。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBEBP1可能存在的调控机制的线索。     

抑制性消减杂交技术筛选XTP4蛋白反式调节基因

目的 筛选、克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg）反式激活基因XTP4转染肝癌细胞后的反式调节基因,探索XTP4基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法 常规的分子生物学技术构建真核表达载体peDNA3．1(-)-XTP4,应用抑制性消减杂交(SSH)技术对重组表达质粒peDNA3.1(-)-XTP4转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究,将富集的二次PCR产物与T／A载体连接,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 消减文库扩增后得到21个阳性克隆,PCR分析显示其中16个克隆含有200～1000bp的插入片段。对插入片段进行测序及生物信息学分析,结果共获得9种蛋白编码基因。这些差异表达的基因与肝细胞纤维化形成、肿瘤发生、线粒体氧化还原代谢、细胞生长调节密切相关。结论 应用SSH技术成功筛选了XTP4对肝癌细胞的反式调节基因,为进一步阐明HBxAg对肝细胞蛋白的反式调节作用提供了理论依据。     

内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因消减文库的构建

目的 建立人脐静脉内皮细胞内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因的消减cDNA文库。方法：提取培养人脐静脉内皮细胞内毒素刺激6h后mRNAs，反转录合成cDNA，与对照组间进行抑制消减杂交交富集差异表达基因，经T载体转化感受态大肠杆菌。结果：建立了内皮细胞内毒素刺激后差异表达基因消减cDNA文库。结论：经抑制消减杂交建立的消减cDNA文库富集并均一化了内毒素刺激后不同丰度的差异表达基因，为今后进一步筛选内毒素相关基因打下基础。     

氡染毒小鼠外周血细胞差异表达基因的筛选与鉴定

目的 在建立氡染毒小鼠模型的基础上,筛选和鉴定氡染毒小鼠外周血细胞差异表达基因。方法 采用HD-3型多功能氡室对BALB/c小鼠动态吸入染毒,建立实验动物模型。按照小鼠吸入氡及其子体的累积剂量分为实验组(累积剂量105 WLM)和对照组(室内本底浓度,1 WLM)。采用RNA转录物5'末端启动机制技术(SMART)和抑制性消减杂交技术(SSH)构建正、反向消减cDNA文库,选取含有插入cDNA片段的克隆进行反向Northern杂交筛选上调或下调的阳性克隆。克隆的测序结果进行同源性检索和生物信息学分析。结果 在成功构建了消减cDNA文库基础上,挑取白斑390个,获得312个含有插入片段的单克隆,进行反向Northern杂交,分析基因的上调或下调水平。选取差异表达克隆41个进行测序及生物信息学分析,最终获得10条已知功能或有注释的差异基因片段和3条未知的表达序列标签(EST)。筛选出的差异表达基因涉及氧化损伤、细胞增殖和肿瘤发生等多方面的功能。结论 氡染毒可引起一系列基因表达的上调或下调,利用SSH技术可以筛选到氡染毒的差异表达基因,为探讨氡损伤机制提供参考。     

人源性大肠癌cDNA噬菌体库的构建及PCR鉴定

为构建人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,从人大肠癌组织中提取总RNA ,纯化mRNA ,用RT PCR反转录合成cDNA第一链 ,用LD PCR合成cDNA第二链 ,除去小于 5 0 0bp的小片段 ,与λTriplEx2噬菌体连接 ,体外包装。转化E .coliXL1 blue大肠杆菌 ,滴定文库的滴度 ,用IPTG和X gal测定重组率。用PCR鉴定插入cDNA片段大小。构建成含 2 .0 7× 10 6 pfu/ml重组子的人大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,重组率为 94.5 % ,插入外源cDNA片段大小从 60 0bp～ 4kb ,平均约 1.4kb。文库合符要求 ,适合于大批量筛选cDNA克隆的大肠癌相关抗原基因     

BEP2D细胞恶性转化不同时期差异表达基因的筛选

目的 筛选并鉴定α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达的基因。方法 抑制消减杂交(SSH)，cDNA芯片。结果 利用SSH构建了BEP2D细胞3个恶性转化不同时期差异表达基因的文库。BEP2D细胞的文库有416个克隆，R15H20细胞的文库有301个克隆，R15H35细胞的文库有586个克隆，经cDNA Microarray验证发现：BEP2D细胞文库来源的芯片与3代细胞探针杂交后的阳性信号率为90．4％、21．6％和19．7％；R15H20细胞文库来源的芯片的阳性信号率为8．6％、93．8％和31．6％：R15H35细胞文库来源的芯片的阳性信号率为23．5％、18．2％和90．7％。结论 联合应用SSH和cDNA Microarray是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速和有效方法；经cDNA Microarray鉴定出的3个文库中差异表达的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化相关的基因。