致敏树突状细胞抗舌癌作用的实验研究

目的 Tca83人舌黏膜鳞状细胞癌细胞冻融抗原致敏DC.观察其对荷瘤裸鼠的押瘤作用,探讨致敏树突状细胞疫苗用于口腔癌患者免疫治疗的可行性.方法 用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)、重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)协同诱导人外周血单核细胞成为成熟DC.Tca83舌癌细胞可溶性抗原体外致敏DC,将同源人T淋巴细胞与之共同培养诱导出抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs),共同接种至荷瘤裸鼠体内行免疫治疗.结果 人外周血单核细胞在细胞因子协同诱导下可获得功能正常的DC,用致敏Dc CTLs免疫治疗的荷瘤裸鼠与对照组相比,实验组肿瘤生长速度减慢,实验结束时(第21天)肿瘤体积明显小于对照组,明显抑制肿瘤生长(P<0.05).结论 采用舌癌细胞冻融抗原体外致教DC,诱导产生肿瘤抗原特异性CTLs具有显著的抑瘤效应,实验证明致敏Dc治疗舌鳞状细胞癌是一种有效的方法.有望成为口腔癌免疫治疗的新疗法.     

低剂量环磷酰胺联合树突状细胞瘤苗对荷舌鳞癌裸鼠的治疗观察

目的：观察低剂量环磷酰胺与树突状细胞瘤苗联合应用对裸鼠体内人舌癌细胞的抑瘤作用。方法：培养人外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC），冻融法制备Tca8113舌癌细胞可溶性抗原并体外致敏DC，将同源人T淋巴细胞与之共同培养诱导出抗原特异性的CTL，联合低剂量环磷酰胺（Cy）共同接种至荷人舌癌的裸鼠。结果：抗原致敏的DC瘤苗与小剂量环磷酰胺联合后能比单用DC瘤苗更有效的治疗荷舌癌的裸鼠，与对照组相比，肿瘤生长明显抑制，生存率有显著提高（P〈0．05）。结论：以冻融抗原致敏的DC激活产生肿瘤特异性的CTL联合小剂量Cy能更有效的促进荷瘤宿主的免疫反应，具有显著的体内抑制舌癌的效果。     

不同方法制备抗原致敏的树突状细胞介导T淋巴细胞对Tca8113细胞杀伤作用的影响

目的探讨树突状细胞（DCs）疫苗治疗舌癌的可行性,并选择较优的抗原负载方式。方法分别采用弱酸洗脱法、反复冻融法制备Tca8113细胞抗原,并分为3组：弱酸洗脱抗原组、反复冻融抗原组、对照组（不加肿瘤抗原）。从外周血单核细胞中诱导DCs,分离出T淋巴细胞。以不同效靶比将DCs和T淋巴细胞混合培养,MTT法测光密度值,计算刺激指数。DCs抗原负载后,与T淋巴细胞混合,以不同效靶比加入预先接种了Tca8113细胞的培养板。MTT法测光密度值,计算杀伤率。结果2种方法体外成功地构建了DCs疫苗,抗原致敏组与对照组比较差异显著,且弱酸洗脱组优于反复冻融组。DCs疫苗可诱导细胞毒性T淋巴细胞有效的杀伤Tca8113细胞,并表现明显的剂量效应。结论DCs疫苗致敏T淋巴细胞能够有效的杀伤Tca8113细胞,酸洗脱抗原冲击致敏的DCs疫苗在舌癌的免疫治疗中优于冻融抗原。     

肿瘤exosome诱导特异性T杀伤细胞的研究

目的检测癌细胞来源的exosome在体外刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异性杀伤癌细胞的能力.方法分离纯化舌鳞癌Tca8113细胞,培养上清液中的exosome,制备癌细胞的冻融抗原(FTA),并把两者负载到从血液分离和培养的树突状细胞(DC)上,测定其诱导的CTL对Tca8113的杀伤活性,以SPCA-1人肺腺癌细胞系和95-D人巨细胞癌为对照组.结果体外FTA和exosome冲击致敏的DC能显著刺激T淋巴细胞增殖,其诱导的CTL对细胞系Tca8113具有显著的杀伤作用,在效靶比为20:1时12 h平均分别为45.19%+4.57%和43.60%+5.66%(P＜0.01);exosome冲击致敏的DC诱导的CTL对SPCA-1人肺腺癌也有明显的杀伤作用(P＜0.05),但FTA冲击致敏的DC诱导的CTL却无此功能.结论肿瘤细胞培养上清液中分离出的exosome,负载到DC上后,可以活化T细胞,使之成为抗原特异性的CTL,具有特异性的杀伤肿瘤细胞的功能,为口腔癌的免疫治疗开拓了新的途径.exosome特异的CTL也可杀死其他肿瘤细胞,说明肿瘤来源的exosome是一种可引起肿瘤消退的共同抗原.     

舌癌血清标记物的蛋白质组学研究

目的通过运用蛋白质组学技术寻找舌癌血清特异性标记物，为舌癌早期诊断、病程监测以及预后判断提供可靠的血清学指标。方法采用舌癌Tca8113细胞系体外培养，并移植于裸鼠。以正常裸鼠血清为对照，采用双向凝胶电泳分离技术分析荷瘤小鼠的血清蛋白表达谱，并通过质谱鉴定差异表达蛋白。结果在荷瘤裸鼠血清中分离和鉴定了5个差异表达蛋白，其中鳞状细胞癌抗原1检索得分最高，为97分，定量分析中变化最大，并与舌癌密切相关。结论荷瘤裸鼠血清中鳞状细胞癌抗原1高表达，有望成为舌癌的特异性血清标记物之一。     

Tca8113细胞exosomes的制备、鉴定及体外抗瘤作用观察

目的:探讨舌癌Tca8113细胞能否分泌exosomes,为口腔肿瘤的免疫治疗寻找新方法。方法:采用超速离心及差异密度梯度离心等方法,从Tca8113细胞中分离并纯化exosomes,透射电镜观察其超微结构,Westernblot分析其表面蛋白成分,最后通过与树突状细胞(dendritic cells,DC)及细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)等介导的细胞毒性实验来观察exosomes体外抗肿瘤效应。结果:从Tca8113细胞中成功分离并纯化出exosomes,其结构及携带蛋白与其他细胞来源的相似,并发现其分泌的exosomes还携带有肿瘤抗原MAGE蛋白。体外抗瘤实验表明:负载exosomes的DC诱导的CTL对Tca8113细胞的杀伤率明显高于未负载exosomes的DC诱导的CTL及加IL-2培养的T细胞,有显著性差异(P<0.01)。结论:舌癌Tca8113细胞能分泌exosomes,exosomes携带各种与肿瘤免疫相关的蛋白,负载DC后,可以诱导T细胞成为抗原特异性CTL,具有特异杀伤肿瘤细胞的功能,为口腔肿瘤的免疫治疗开拓了新的途径。     

Avastin联合抗原致敏的DC-CTL细胞体外抑制口腔鳞癌细胞生长的实验研究

目的:研究贝伐单抗(Bevacizumab,Avastin)与口腔鳞癌抗原致敏的树突状细胞(Dendritic Cell,DC)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic t Lymphocyte,CTL)联合应用,体外研究其对口腔鳞癌细胞生长的抑制作用。方法:CAL27、SCC4肿瘤细胞系的培养,检测VEGF分泌水平;培养人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC);冻融法制备SCC4口腔鳞癌细胞可溶性抗原并致敏DC,检测DC表面标志物变化,刺激同种异体T细胞增殖的能力及IL-12分泌水平;将同源人T淋巴细胞与之共同培养诱导出抗原特异性的CTL细胞,Avastin联合CTL对SCC4细胞进行体外杀伤实验。结果:SCC4较CAL27分泌更高水平的VEGF;经肿瘤抗原致敏后的DC,其表面标志CD83、CD80、CD86、CD40及功能相关分子IL-12表达上调,CD1a的表达下调,可显著刺激异体T淋巴细胞增殖,具有统计学差异;Avastin联合CTL对SCC4的杀伤率达56.1%,显著高于对照组(P<0.05)。结论:Avastin联合DC致敏的CTL能显著抑制口腔癌细胞的生长。     

树突状细胞体外诱导淋巴细胞抑制舌癌细胞生长的实验研究

目的 :探讨树突状细胞 (dendriticcell,DC)通过淋巴细胞介导的免疫反应对舌癌细胞生长的影响。方法 :外周血单核细胞 ,在GM CSF IL 4的诱导下体外培养。其中一组加入TNF α ,另一组不加TNF α ;以不加任何细胞因子作为对照。用Tca8113细胞冻融抗原冲击后 ,加入自体淋巴细胞一起培养。再按 10 0∶1效靶比与Tca8113共培养 ,设未致敏淋巴细胞 Tca8113组 ,单独Tca8113组作对照。行形态学观察 ,免疫细胞化学检测DC的CD1a、CD83、HLA DR表达状况 ,MTT法检测Tca8113的存活率。结果进行统计学分析。结果 :( 1)加入TNF α组更高表达CD83 ,不加入TNF α组经肿瘤抗原刺激后 ,CD83表达急剧增加。 ( 2 )DC激活的淋巴细胞可显著抑制舌癌细胞的生长。结论 :GM CSF IL 4诱导的单核细胞来源的DC ,能体外摄取肿瘤抗原而进一步成熟 ,通过激活淋巴细胞抑制舌癌细胞生长 ;TNF α能促DC成熟 ,诱发更强的抑制作用。     

舌鳞癌患者外周血树突状细胞的体外培养和鉴定

目的：探讨应用GM—CSF、IL-4、TNF—α及肿瘤细胞裂解液体外诱导舌鳞状细胞癌患者外周血来源树突状细胞（DC）的方法。方法：选取10例舌鳞状细胞癌患者和6例健康人，抽取外周血，分离单核细胞，经贴壁获得树突状细胞前体细胞，在体外先后加入GM—CSF、IL-4和肿瘤细胞裂解液、TNF—α诱导培养，获得成熟DC，进行形态学观察，以流式细胞术检测DC标志物表达率。实验中设置舌癌组和健康对照组，肿瘤裂解液诱导组和空白对照组，采用t检验进行统计学分析。结果：经9d诱导培养，细胞数量增加，体积增大，相差显微镜、HE染色和扫描显微镜下均见细胞表面树突状突起，呈典型DC形态。舌癌组DC平均获得率9．9％，与健康组无显著差异（P=0．1287）。舌癌组成熟DC标志物CD83表达率为37．19％，共刺激因子CD40、CD80和MHC分子HLA—DR的表达率分别为51．79％、48．43％和65．82％。与健康组无显著差异（P〉0．05）。肿瘤细胞裂解液诱导组较对照组可获得更高的DC获得率和成熟率，分别为P=0．0186和P=0．0473。结论：舌癌患者外周血来源DC前体细胞经体外诱导培养，可以转变为形态和功能成熟的DC；肿瘤细胞裂解液刺激，有助于提高DC获得率和成熟率。     

人巨噬细胞与Tca8113细胞融合瘤苗的制备及体外抗肿瘤效应

目的 探讨巨噬细胞融合瘤苗在舌癌免疫治疗中的应用。方法 利用人巨噬细胞与Tca8113细胞融合，通过磁微珠筛选出融合细胞(FC)并扩大培养，观察Fc的生物学特性及其体外诱导抗肿瘤特异性免疫的能力。结果 FC瘤苗的生长低于其亲本Tca8113细胞，流式细胞仪检测融合细胞的主要组织相容性抗原(MHC)Ⅰ、Ⅱ类分子的表达高于Tca8113，能有效刺激混合淋巴细胞反应(MLR)，并能在体外诱导淋巴细胞抑制肿瘤细胞Tca8113的生长。结论 融合细胞瘤苗能显著提高亲源舌癌细胞Tca8113的免疫原性，提示融合细胞瘤苗是一种新的抗肿瘤免疫治疗方法，可作为个体化肿瘤疫苗的新方案。     

Effect of dendritic cell vaccine against a tongue squamous cell cancer cell line (Tca8113) in vivo and in vitro

Dendritic cells (DCs), as primary antigen-presenting cells with the capacity to activate naïve T lymphocytes, are considered to be promising adjuvants for immunity against cancer. In this study, the effect of T lymphocyte-mediated immunity induced by a DC vaccine against Tca8113 cells in vivo and in vitro was evaluated. DCs were from human peripheral blood monocytes cultured in the presence of granulocyte–macrophage colony stimulating factor, interleukin 4 and/or tumour necrosis factor α, and stimulated with Tca8113 cell lysate prepared by the freeze–thaw method. The autologous T cells activated by these DCs were used in an in vitro MTT assay to detect their tumouricidal activity and investigated for their anti-tumour effect in vivo by administration to nude mice with implanted tumours (Tca8113). An adequate number of DCs were successfully generated from the monocytes. The T cells activated by the DC-based vaccine killed Tca8113 cells in vitro (P < 0.01), postponed tumour doubling time of the implanted tumours in nude mice (P < 0.01) and inhibited the growth of the tumours (P < 0.05). These results show that DCs from monocytes induce a lymphocyte-mediated immune response against tongue squamous carcinoma, and could be used as a vehicle for tumour antigens.     

Transwell小室环境下小鼠不同器官微环境对人舌癌细胞生长的影响

目的：探讨骨髓和淋巴结微环境对人舌癌细胞SCC-9生长的影响。方法：利用Transwell小室建立微环境与SCC-9共培养体外模型,分为5组：SCC-9单独培养组（对照组）,SCC-9+Balb/c小鼠骨髓共培养组,SCC-9+Balb/c小鼠淋巴结共培养组,SCC-9+Balb/c裸鼠骨髓共培养组,SCC－9+Balb/c裸鼠淋巴结共培养组。采用直接计数法分别于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h检测SCC-9的数量。结果：利用Transwell小室成功构建骨髓、淋巴结微环境与SCC-9共培养体外模型。计数结果显示,SCC-9在Balb/c裸鼠淋巴结共培养组中的增殖程度高于其他4组（P<0.05）;在Balb/c裸鼠骨髓,Balb/c小鼠骨髓和淋巴结共培养组中均低于对照组（P<0.05）,且抑制程度无明显差异（P>0.05）。结论：不同微环境可能通过不同的肿瘤休眠机制,控制肿瘤细胞的增殖与休眠,最终被动形成淋巴转移的靶向性。     

口腔鳞癌VEGF诱导树突状细胞致免疫耐受的机制研究

目的 探讨口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)诱导树突状细胞(dendritic cells, DCs)向免疫耐受型转化的作用及机制。方法 将树突状细胞分为4组：对照组(DC)、VEGF组(DC中加入外源性VEGF)、共培养组(DC与SCC7细胞共培养)及抗VEGF组(DC与SCC7细胞共培养后加入VEGF抗体),采用流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测DC表面标记分子的表达情况;为了检测DC对T细胞增殖的影响,将实验分为5组：空白组(T细胞)、对照组(T细胞+DC)、VEGF组(T细胞+DC+VEGF)、共培养组(T细胞+DC+SCC7细胞上清)及抗VEGF组(T细胞+DC+SCC7上清+VEGF抗体),采用混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)检测;分别应用Western blot、real time PCR及FCM检测各组DC中吲哚胺-2,3-双加氧酶(indole...     

Histopathologic comparison between human oral squamous cell carcinomas and their xenografts in nude mice

Tumor portions were obtained from 11 oral squamous cell carcinomas and used to produce tumors in a xenogeneic gnotobiotic nude mouse model system. The tumors that developed were examined histologically. The cellular features and tumor growth patterns were compared between the original oral squamous cell carcinoma (T0) and the tumor that developed in the xenogeneic host (T1). The T1 tumors were more highly differentiated in comparison with the T0 tumors. The T1 tumors exhibited less cellular pleomorphism and a more uniform pattern of stratification. The cells in the T1 tumors exhibited an increased mitotic index but did not contain abnormal mitoses. The T1 tumors usually exhibited nodular growth patterns rather than the infiltrating pattern exhibited by the parenchyma of the T0 tumors. The desmoplastic reaction was markedly reduced in the T1 tumors. The results indicated that the gnotobiotic nude mouse model system either selects for or induces a more differentiated pattern of tumor growth than that found in the original human oral squamous cell carcinomas.     

外周血DC-CIK对人舌鳞癌细胞系Tca8113的抑瘤作用

目的:探讨体外致敏成熟树突状细胞(DC)与细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)共培养细胞群对人舌鳞癌细胞系Tca8113移植瘤裸鼠的体内抑瘤效果.方法:人舌鳞癌外周血分离培养DC,体外诱导培养CIK细胞,将致敏成熟的DC与CIK体外扩增获得共培养细胞群DC-CIK细胞;于裸鼠单侧腋下接种Tca8113,将实验动物分为对照组A、实验组B和实验组C;接种后24h,A组移植瘤区注射生理盐水,B组于对侧腋下注射DC-CIK,C组同侧腋下注射DC-CIK,饲养4周；观察移植瘤的成瘤时间、成瘤率、生长曲线及组织学观察,采用SAS 6.12软件包对数据进行t检验、方差分析和x2检验.结果:A组平均成瘤时间为7.63d,B组为9.5d,C组为12d,A、C组有显著差异(P=-0.0132);注射后2周,A组成瘤率为100％,B组为87.5％,C组为62.5％,P＞O.05;观察期内,从移植瘤生长曲线观察,A组瘤体增长最快,B组其次,C组最慢,A、B组无显著差异(P＞0.05),A、C组差异显著(P=0.036).结论:致敏DC-CIK共培养细胞对Tca8113移植瘤裸鼠有一定的体内抑瘤效应.     

裸鼠皮下种植性人头颈鳞癌模型的建立

目的：建立稳定的皮下种植性裸鼠人头颈鳞癌模型。方法：取10^9个对数期的PCI-37B细胞,种植于BALB／c裸鼠皮下。待成瘤后,从裸鼠体重、大体形态,肿瘤生长情况,病理学特征等方面进行研究。采用SPSS13．0软件包对数据进行统计学分析。结果：肿瘤形成的潜伏期约15d,实验组14只裸鼠成瘤13只,肿瘤成功率为92．8％。种植肿瘤组裸鼠体重较正常对照裸鼠明显减轻．肿瘤生长迅速．病理学检查有明显的细胞异形性。结论：成功建立了裸鼠皮下种植性头颈鳞癌模型。本模型具有在短期内易建立、稳定、重复性好、成癌率高等特点,为人头颈鳞癌的生物学、治疗学研究提供了良好的动物模型。     

口腔黏膜黑色素瘤人源性移植瘤模型的建立及鉴定

目的 建立和鉴定口腔黏膜黑色素瘤（oral mucosal melanoma,OMM）人源性移植瘤（patient-derived xenograft,PDX）模型。方法 将4例原发性口腔黏膜黑色素瘤组织移植于免疫缺陷裸鼠皮下,观察并记录裸鼠成瘤情况,待移植瘤稳定生长后进行传代;利用H-E染色观察原发瘤和移植瘤的组织病理学特征,应用免疫组织化学染色检测黑色素瘤标志物HMB-45、Melan-A、S-100及Ki-67在两者组织的表达水平。结果 4例口腔黏膜黑色素瘤组织皮下移植成功并序列传代;H-E和免疫组织化学染色显示,移植瘤在组织病理形态和4个标志物表达情况上与原发瘤保持一致。结论 本研究成功建立4例口腔黏膜黑色素瘤人源性移植瘤模型,传代移植瘤保留了原发瘤的组织病理学和分子特征,可为口腔黏膜黑色素瘤研究提供理想的临床前动物模型。