基因重组人血红蛋白的纯化

目的 :探索重组人血红蛋白的纯化方法。方法 :将α、β珠蛋白串联基因克隆进 pBV2 2 0表达载体 ,获得了高效表达 ,表达产物达细菌总蛋白的 2 0 %左右。该表达产物以包涵体形式存在 ,包涵体经洗涤后 ,用 8mol/L尿素溶解 ,先用Q SepharoseFastFlow阴离子交换纯化后 ,又经Sephacryl 10 0凝胶过滤纯化。 结果 :经两步纯化后重组人血红蛋白的纯度达 90 %左右。纯化产物经复性 ,具有与氧结合的能力。结论 :成功地得到人重组血红蛋白的纯化方法     

重组血红蛋白的纯化

在大肠杆菌中用热诱导方式分别进行了人重组血红蛋白的α、β珠蛋白的非融合高效表达,并对表达产物进行阴离子交换、凝胶过滤纯化,使表达产物的纯度达90%左右。此为下一步制备和纯化人血红蛋白多克隆抗体奠定了关键基础。     

发酵液中重组人血清白蛋白的纯化

采用摇瓶培养重组毕赤氏酵母（Pichia pastoris）表达并分泌重组人血清白蛋白（recombinant human se-rum alburmin，rHSA）至胞外，发酵液经（NH4）2SO4沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤分离纯化rHSA，纯化样品经SDS-PAGE检测为单一条带。     

重组人干扰素α2a分离纯化中试工艺研究

目的探索无单克隆抗体亲和层析的重组人干扰素α2a分离纯化工艺。方法用 7mmol·L-1盐酸胍抽提干扰素 ,然后用金属螯合层析、离子交换层析、反相柱层析和凝胶过滤将提取的干扰素纯化。结果目标蛋白纯化了 195 1倍 ,蛋白比活性达 2 4 0× 10 8IU·mg-1,回收率达 30 1%。SDS PAGE检定呈一条带 ,其分子质量约为 19kD ,纯度大于 97%。结论本工艺降低了生产成本 ,易于扩大生产规模 ,适合产业化要求。     

重组人粒细胞刺激因子的纯化方法

目的:建立G-CsF的纯化方法.方法:对包涵体进行有效洗涤,采用疏水层析进行纯化.结果:包涵体纯度大于70%,产品反向纯度大于95%,电泳纯度大T98%.结论:所建立的G-CSF的纯化方法简便可行,适用于工业化生产.     

注射用重组人干扰素β1b的分离纯化及质量研究

目的:研制注射用重组人干扰素β1b(rhIFN-β1b)并对其质量进行鉴定.方法:采用高压匀浆破菌、离心分离包涵体、有机抽提、酸沉淀、Sephacryl S-200、Sephadex G-75等进行分离纯化,通过各种方法对终产品进行鉴定.结果:纯化的rhIFN-β1b比活性平均为2.59×107IU·mg-1,纯度超过99%,复性纯化后平均活性回收率为51.89%,其他各项技术指标均符合质量控制标准.结论:建立了大规模制备rhIFN-β1b的纯化工艺,研制出了符合规程要求的注射用rhIFN-β1b纯品,为临床研究奠定了基础.     

重组人促红细胞生成素纯化工艺

目的:建立适合大规模生产重组人促红细胞生成素(rhEPO)的纯化工艺.方法:采用无血清培养分泌rhEPO工程细胞株,收集培养基上清,经过滤、染料亲和层析,离子交换层析、分子筛层析纯化.结果:所纯化的rhEPO纯度达99%以上,比活(包括体内、体外)为2.0×105IU/mg以上,活性回收率为40%,相对分子量为38000左右,等电点为3.7～4.2.结论:该纯化工艺简便、重复性好、产品质量高,适合大规模生产.     

重组人白细胞介素12的纯化与鉴定

目的探索重组人白细胞介素12(rhIL-12)的纯化与鉴定方法。方法采用Millipore超滤浓缩系统对含rhIL-12的无血清培养上清进行浓缩,用阴离子交换色谱柱,阳离子交换色谱柱和尺寸排阻色谱柱纯化出rhIL-12;并对rhIL-12的纯度、活性及氨基酸序列进行检测。结果纯化后产物经Western blot鉴定(P35、P40)为rhIL-12,毛细管电泳法测得其纯度在98%以上;生物学活性达8.0×106IU/mg,且氨基酸序列与已报道的序列相一致。结论建立了获得高纯度、高生物活性的rhIL-12的纯化与鉴定方法。     

金属螯合亲和层析分离纯化重组人锰超氧化物歧化酶

以金属铜螯合的亲和层析方法分离纯化重组人锰超氧化物歧化酶，采用3种不同的洗脱方法都可以对重组酶进行分离纯化，但是通过鉴别比较，采用方法1即逐步降低洗脱液的pH和固定洗脱液的NH4^ 的浓度可以获得较好的结果，SDS－和丙烯酸胺凝胶电泳得到一条分子质量约为2200u的蛋白条带，证明所得到的为纯度高的重组人锰氧化物歧化酶（rhMn-SOD）。     

采用DOE试验方法优化重组人干扰素α2a纯化工艺

目的 采用DOE试验方法对重组人干扰素α2a纯化工艺参数进行优化,并寻找各参数的操作空间,为实际的产品生产提供指导.方法 利用DOE中的中心符合表面设计(CCF)模型,设置两个响应值目标蛋白纯度和得率,对重组人干扰素α2a纯化工艺的疏水层析精纯进行优化并找出操作空间.选取两个工艺参数,即洗脱液B的(NH4)2SO4浓度(0.60M·L-1~0.70M·L-1)和洗脱液C的(NH4)2SO4浓度(0.30M·L-1~0.40M·L-1).结果 从模型的线性、正确性、有效性和重复性判断,所建立的模型拟合度高,可较为准确的预测实验结果.其中,洗脱液B的(NH4)2SO4浓度、洗脱液C的(NH4)2SO4浓度以及各自的平方对响应值有显著影响.同时,利用sweet spot找出关键层析步骤的操作空间.     

一种新型重组人复合α干扰素的表达、分离纯化及活性测定

为提高重组复合α干扰素的活性和半衰期,在现有复合α干扰素结构基础上进行氨基酸替换,合成了新型干扰素(N-cIFN)基因,将该基因克隆到温控表达质粒pBV220,转化大肠杆菌BL21获得工程菌BL21/pBV220-cIFN,经过诱导表达、包涵体变性、DEAE Sephadex A-25柱层析、Sephadex G-50...     

高质量重组人干扰素α2b的分离纯化研究

重组人干扰素2b作为一种上市药物,被广泛用于治疗慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、恶性黑色素瘤等多种疾病的治疗,产生了良好的临床疗效和经济效益。目前国内厂家生产的重组人干扰素以大肠杆菌基因工程表达为主。大肠杆菌表达的人干扰素2b以包涵体的形式表达,包涵体产物需通过变性复性以及其后的纯化才能获得生物活性。干扰素复性得率低,纯化时需要经过四步色谱处理,工艺繁琐,成本高,而且无法去除未完全复性的中间产物,从而影响产品质量和疗效。建立可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵工艺,并在此基础上,建立其高效、快速和稳定的纯化工艺。通过发酵工艺优化获得可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵,收集菌体后,通过高压破菌、硫酸铵分级沉淀、phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析、Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、Octyl Sepharose Fast Flow疏水层析进行分离纯化,并对纯化产物进行生物活性分析。重组人干扰素α2b工程菌的发酵密度A₆₀₀达到38.5,可溶性重组人干扰素α2b占...     

重组人突变型TNF-α在大肠杆菌中的诱导表达及高效纯化

建立重组人突变型ＴＮＦ－α的纯化工艺,获得ＴＮＦ－α纯品,为下游规模生产打基础。方法：诱导表达重组 ＴＮＦ－α突变体蛋白,用 ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ两步层析结合小范围线性梯度洗脱法纯化。结果：所得重组蛋白的纯度达９８％以上,比活达１．７×１０９ｕ／ｍｇ蛋白,无热原。结论：此纯化方法可对重组ＴＮＦ－α突变体蛋白进行高效快速纯化,易于实现规模化生产。     

转基因牛乳中重组人乳铁蛋白的仿生亲和纯化

目的从转基因牛乳中亲和纯化重组人乳铁蛋白。方法从仿生亲和介质库中筛选亲和配体,进行重组人乳铁蛋白的纯化研究。结果筛选出可以特异性结合重组人乳铁蛋白的固定化β-丙氨酸亲和配体,从转基因牛乳中一步纯化的重组人乳铁蛋白纯度为95.2%,蛋白回收率可达81.9%。经放大实验表明该亲和纯化工艺适合工业上大规模纯化乳铁蛋白。结论固定化β-丙氨酸可从转基因牛乳中纯化出高纯度重组人乳铁蛋白,工艺适合工业化生产。     

重组人肝细胞生长因子-β链的高效表达及包涵体纯化研究

目的　构建重组人肝细胞生长因子 - β链 (rh HGF- β)的表达体系。筛选高效表达工程菌株 ,分离纯化 rh HGF- β。方法　用工程菌诱导培养技术筛选 rh HGF- β的高效表达菌株。从诱导起始时间、诱导时间、温度、p H值、培养基组分等方面优化 rh HGF-β的表达体系。进一步对 rh HGF-β进行粗纯化 ,采用超声波破菌 ,溶菌酶破菌 ,高速离心反复洗涤获得包涵体。采用凝胶过滤层析纯化 rh HGF-β。结果　经十二烷基硫酸钠 -多丙烯酰胺冻胶电泳 (SDS- PAGE)及扫描分析目的蛋白的表达量达 3 0 % ,经纯化后可获得纯度在 90 %以上的 rh HGF-β。结论　建立了高效稳定的 rh HGF- β表达体系 ,获得实验室水平 rh HGF- β的分离纯化工艺方案     

重组人甲状旁腺激素1-34的纯化研究

重组人甲状旁腺激素(rhPTH(1-34))在工程菌pET(32a+)-PTH(1-34)/BL21(DE3)中以胞内可溶性融合蛋白形式高效表达。经过高压匀浆破菌处理,取上清经过亲和层析、酶切、阴离子交换层析、反相层析和阳离子交换层析进行分离纯化,得到rhPTH(1-34)原液样品纯度在98%以上,比活性达到1.05×104U/mg。     

大肠杆菌表达重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子的中试纯化

重组人粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子 (rHuGM -CSF)表达产物在大肠杆菌中以包涵体的形式存在。方法　包涵体高压匀浆破菌抽提后 ,经凝胶过滤层析、复性、离子交换层析及凝胶过滤层析等纯化步骤。结果终产物纯度达 97% ,比活性达 1 2× 10 7U/mg蛋白 ,测定N端 2 0个氨基酸系列与其DNA系列推导的氨基酸系列完全一致。     

重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子的分离与纯化

探讨重组人粒－巨噬细胞集落刺激因子的分离、纯化工艺。方法;经破菌溶解包含体、复性等粗提纯后,以三步色谱法精制纯化,对终产品进行纯度、生物活性、热原及急性毒性检测。结果：终产品为单一条带、单一峰,生物活性为１．５９ ×１０~７～１．８６×１０~７ＩＵ／ｍｇ,热原测定及急性毒性试验符合要求。结论：此工艺纯化的产品纯度高、生物活性好,有一定的应用价值。     

重组人红细胞生成素-α对恶性实体肿瘤患者血红蛋白水平、不良反应及生活质量的影响

目的:观察重组人红细胞生成素-α对恶性实体肿瘤患者血红蛋白水平、不良反应和生活质量的影响.方法:进展期恶性合并化疗相关贫血患者36例,化疗同步实施皮下注射rhEPO100u/(kg·次),一周三次,共2个月,对比治疗前后血红蛋白水平、不良反应和生活质量的变化.结果:36例患者通过rhEPO治疗后2个月,和治疗前比较,血红蛋白水平得到了明显改善,Hb上升≥20g/L有20例,有效率是55.6%;和治疗前对比,体质状态评分都出现了不同程度的改善.结论:化疗结合rhEPO不但可以提升肿瘤患者的血红蛋白水平,还能够预防化疗性贫血的发生,可以改善生活质量,具有一定的安全性和可靠性.     

重组人干扰素α-2b原液的制备

目的优化重组人干扰素α-2b原液的发酵纯化方法,降低生产成本,提高产品的安全性。方法构建重组大肠杆菌,通过逐级扩大培养、发酵、纯化,收集菌体;菌体裂解后,进行变性、复性,通过不同的纯化方法,得到符合质量标准的重组人干扰素α-2b原液;通过对各步工艺的考察,优化重组人干扰素α-2b的发酵、纯化方法。结果制得的重组人干扰素α-2b菌种表达量高,原液纯度可达95.0%以上,生物学比活性高于1×108U.mg-1,符合《中华人民共和国药典》的质量要求,安全性强。结论此法可应用于重组人干扰素α-2b原液的生产。