叔丁基对苯二酚对亚砷酸钠致Chang liver细胞毒性的影响

目的 探讨叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)对亚砷酸钠(NaAsO_2)致Chang liver细胞毒性的影响.方法 Chang liver细胞培养48 h后分别以20、40、60和80 μmo/L的NaAsO_2染毒24和48 h,作为NaAsO_2单独作用组.以5和20μmol/L的tBHQ预处理Chang liver细胞24h,以40和60μmol/L的NaAsO_2染毒24和48h,作为tBHQ预处理组;对照组处理同NaAsO_2:单独作用组.每个浓度设3个复孔.用Alamar Blue法检测细胞活力.结果 NaAsO_2单独作用24和48 h组Alamar Blue还原率显著下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);且NaAsO_2单独作用48 h组的Alamar Blue还原率均显著低于24 h组,差异有统计学意义(P＜0.01).5 μmol/L的tBHQ预处理组与对应的60 μmol/L NaAsO_2单独作用24h组相比,显著提高了Alamar Blue还原率(P＜0.01);20 μmol/L的tBHQ预处理组的Alamar Blue还原率均显著高于相对应NaAsO_2单独作用24 h组(P＜0.05).5 μmol/L的tBHQ预处理组的Alaraar Blue还原率均显著高于相对应NaAsO_2单独作用48h组(P＜0.01);20μmol/L的tBHQ预处理组与对应的40μmol/L NaAsO_2单独作用48h组相比,显著提高了Alamar Blue还原率(P<0.01).结论 tBHQ能够降低NaAsO_2致Chang liver细胞的毒性,增强细胞对NaAsO_2毒性的抵抗能力.

Abstract：

Objective To study the antagonism of text-butylhydroquinone (tBHQ)to NaAsO_2 induced cytotoxicity in Chang liver cells in vitro.Methods Chang liver cells were exposed to NaAsO_2(0,20,40,60 and 80μmol/L)for 24 and 48 hours,or Chang liver cells were treated with tBHQ(5 and 20 μmol/L),then exposed to NaAsO_2(40 and 60 μmol/L)for 24 and 48 hours.The conditions of control group was the same as NaAsO_2 group.Alamar Blue was used to evaluate the viabifity of cells.Results Chang liver cells were exposed to NaAsO_2 for 24 and 48 hours,Alamar Blue reduction rates decreased significantly and Alamar Blue reduction rates of 48 hours group were lower than 24 hours group (P<0.01).Alamar Blue reduction rate of 5 μmol/L tBHQ pretreatment group was higher than 60 μmol/L NaAsO_2 group for 24 h(P<0.01);Alamar Blue reduction rate of 20μmol/L tBHQ pretreatment group were higher than respective NaAsO_2 group for 24 h(P＜0.05).Alamar Blue reduction rate of 5 μmol/L tBHQ pretreatment group were higher than respective NaAsO_2 group for 48 h(P＜0.01);Alamar Blue reduction rate of 20 μmol/L tBHQ pretreatment group was higher than 40 μmol/L NaAsO_2 group for 48 h(P<0.01).Conclusion tBHQ can decrease the cytotoxieity induced by NaAsO_2 in Chang liver cells,increase the resistance to the cytotoxieity induced by NaAsO_2 in Chang liver cells.     

砷对人皮肤角质形成细胞抗氧化能力影响

目的 研究亚砷酸钠(NaAsO₂)对人皮肤角质形成细胞(HaCaT)抗氧化能力的影响。方法 用流式细胞仪检测细胞内二氯荧光素(DCF)的荧光强度;用改良硫代巴比妥酸荧光法测定细胞内丙二醛(MDA)含量;用Nitrite-kit法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性;用紫外速率直接法测定过氧化氢酶(CAT)的活性。结果 各实验组(2.5,5,10和20μmol/LNaAsO₂)的DCF荧光强度均显著增高(P<0.05),分别是对照组的1.3,1.6,1.7和1.8倍;各实验组的MDA含量显著增高(P<0.05),分别是对照组的1.1,1.4,1.5和2.2倍;10和20μmol/LNaAsO₂组SOD活性显著下降,分别为对照组的78%和61%;10和20μmol/LNaAsO₂组SIOD和CAT活性显著下降,分别为对照组的50%和34%。结论 砷可以引起人皮肤细胞的氧化损伤,降低抗氧化能力。     

无机砷化合物对HaCaT细胞毒性作用

目的探讨无机砷化合物对人表皮角质细胞(HaCaT)毒性与氧化应激和砷代谢关系。方法用四甲基偶氮唑盐法测定细胞生存率;检测砷化物对丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力影响;流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS);原子荧光分析方法检测细胞内外不同形态砷含量。结果200.0 μmol/L As₂O₃(iAs^Ⅲ)、50.0~500.0 μmol/L Na₂HAsO₄·7H₂O(iAs^Ⅴ)能够明显降低HaCaT细胞生存率,生存率分别为(54.8±5.9)%、(85.4±9.5)%、(70.0±4.0)%、(58.8±6.0)%,在低剂量时,2种砷化物表现为促进HaCaT细胞增殖(P<0.05);iAs^Ⅲ组随剂量增加MDA含量梯度增加,iAs^Ⅴ组MDA含量先增加后降低呈倒U形;细胞内ROS含量iAs^Ⅲ组> iAs^Ⅴ组;细胞外iAs^Ⅲ、iAs^Ⅴ含量均高于细胞内,细胞内砷甲基化率表现为5.0 mol/L iAs^Ⅲ组(87.3%)>50.0 mol/L iAs^Ⅲ组(61.8%),5.0 mol/L iAs^Ⅴ组(40.0%)>50.0 mol/L iAs^Ⅴ组(10.5%),且iAs^Ⅲ组高于iAs^Ⅴ组。结论无机砷化物对HaCaT 细胞毒性影响与氧化应激和砷代谢水平有关。     

二氯乙烯对体外培养人皮肤角质形成细胞的氧化损伤作用

目的探讨二氯乙烯(dichloroethylene,DCE)对体外培养的人皮肤角质形成细胞(keratinocyte,KC)的氧化损伤作用。方法使用2.800、1.400、0.700、0.350、0.175 mmol/L的DCE对体外培养的人KC染毒4 h,检测细胞活力和细胞内MDA、ROS含量、SOD活性,以及线粒体内8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG)水平。结果经不同浓度DCE作用4 h后,细胞活力无明显改变。随着DCE浓度升高,细胞内MDA和ROS水平呈上升趋势,而SOD活性呈下降趋势,与溶剂对照组相比较差异有统计学意义;线粒体内8-OHdG水平也随着DCE浓度增加而呈现上升趋势。结论 DCE对人KC有氧化损伤作用。     

亚砷酸钠对HaCaT细胞增殖周期及ROS生成影响

目的 探讨亚砷酸钠(NaAsO₂)对人皮肤角质形成细胞(HaCaT)增殖、细胞周期及活性氧(ROS)生成影响。方法 以0、25、50μmol/L NaAsO₂作用于HaCaT细胞6 h后,以Alamar Blue还原法检测细胞增殖水平;以流式细胞仪检测细胞周期及ROS水平。结果 25、50μmol/L NaAsO₂组细胞增殖水平分别为(93.5±1.18)%、(82.9±2.64)%,明显低于对照组(100±0.51)%(P<0.05);G2/M期细胞数分别为(19.15±0.29)%、(18.12±1.35)%,明显高于对照组(15.24±0.04)%(P<0.05);ROS水平分别为(128.61±6.23)%、(152.92±7.25)%,明显高于对照组(100.00±3.45)%(P<0.05)。结论 NaAsO₂作用可引起HaCaT细胞ROS含量增高,同时G2/M期细胞数增多,但G2/M期细胞比例增高并不是由细胞增殖作用所引起。     

亚慢性砷暴露对大鼠肝脏自噬作用影响

目的 从细胞自噬角度探讨亚慢性砷暴露对大鼠肝脏自噬作用的影响及相关分子机制.方法 40只150 ～ 180 g SD大鼠,随机分为对照组、砷暴露高、中、低剂量组(NaAsO2 8、4、2mg/kg);灌胃给予不同浓度的含砷水,对照组给予等量生理盐水,连续12周,每周6d.12周后处死大鼠取肝组织与全血.苏木素-伊红染色...     

性成熟前期染砷对雌性SD大鼠生殖功能影响

目的 探讨性成熟前期亚砷酸钠（NaAsO₂）染毒致雌性SD大鼠子宫、卵巢结构改变及性激素水平变化影响。方法 SD大鼠40只,随机分为4组,即对照组、低、中、高剂量砷组,分别灌胃给予双蒸水、1.25、2.50、5.00 mg/kg NaAsO₂,4周后,断颈处死,双侧卵巢及子宫做苏木素-伊红染色观察卵巢及子宫组织形态学变化;采用放射免疫法测定血清中卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇、孕酮含量;酶联免疫法检测血清中血管内皮生长因子（VEGF）、细胞周期蛋白D₁（cyclin D₁）、孕激素受体（PR）含量。结果 随NaAsO₂剂量增加,染砷组大鼠卵巢内总卵泡数减少、细胞发育不良、成熟卵泡减少及畸形发育;子宫内膜变薄,腺体减少,腺腔变窄,腺上皮细胞由长柱状变成短柱状,间质增宽;与对照组比较,中、高剂量砷组大鼠血清中FSH、LH、雌二醇含量[分别为（3.23±0.20）、（3.21±0.18） IU/L、（2.64±0.27）、（2.62±0.25） ng/mL、（56.69±6.37）、（55.95±7.25） pg/mL]明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）;与对照组比较,中、高剂量砷组大鼠血清中VEGF、cyclin D₁、PR蛋白含量[分别为（13.54±1.98）、（12.44±2.06） ng/L、（1.089±0.133）、（1.040±0.136）μg/L、（324.27±19.77）、（320.46±18.01） ng/L]下降,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 性成熟前期染毒NaAsO₂可引起SD雌性大鼠卵巢与子宫结构改变,其机制可能与NaAsO₂导致大鼠雌二醇水平下降,下丘脑分泌FSH、LH减少有关。     

亚砷酸钠对HaCat细胞活力及磷酸化蛋白激酶B表达的影响

为探讨亚砷酸钠(NaAsO2)对人角质形成细胞(HaCat)活力及蛋白激酶B(PKB/Akt)磷酸化活化的影响,本研究以Alamar Blue还原法检测NaAsO2(0,5,10,25,50,100μmol/L)作用于HaCat细胞6 h后细胞的活力水平;并以Western blot法检测NaAsO2(0,25,50μmol/L)作用于HaCat细胞6 h后细胞中磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)的蛋白表达情况。结果表明,NaAsO2作用6 h,Alamar Blue还原率随NaAsO2染毒剂量的升高而显著下降,具有显著的剂量-效应关系;NaAsO2染毒组细胞内p-Akt表达水平与对照组相比均显著提高,提示砷性肿瘤的发生可能与p-Akt蛋白表达水平增高有关。     

亚砷酸钠对HaCaT细胞的氧化应激作用

目的研究不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)对人皮肤永生化角质形成细胞株(HaCaT)的氧化应激作用。方法用AlamarBlue还原法检测NaAsO2对细胞活力的影响,用PI染色法检测细胞的凋亡和坏死率,利用2′7′二乙酰二氯荧光素(DCFHDA)检测细胞内ROS水平,同时用荧光法测定细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量。结果0001μmolL至1μmolL组的AlamarBlue还原率显著高于对照组,而10μmolL以上组的AlamarBlue还原率下降,20μmolL组的凋亡和坏死率显著高于对照组,各实验组的DCF荧光强度与对照组相比明显提高,1μmolL以上组细胞内GSH水平增高,5μmolL组GSSG水平增高。结论各浓度砷引起HaCaT细胞内ROS增多,低浓度时促进细胞增殖,高浓度则抑制细胞活力,砷诱导HaCaT细胞内的GSH增多,发挥解毒作用。     

叔丁基对苯二酚对锰致神经细胞毒性的保护作用

目的 研究叔丁基对苯二酚(tBHQ)对锰致大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞毒性的保护作用.方法 以不同终浓度(300、600、900μmol/L)的MnCl2分别处理PC12细胞24、48、72 h,用噻唑蓝(MTT)法检测PC12细胞毒性.MnCl2组予600μmol/L MnCl2处理72 h;tBHQ组予40 μmol/L tBHQ处理细胞84h;tBHQ+MnCl2组予40μmol/L tBHQ预处理12h后,600 μmol/LMnCl2处理72 h,用MTT法检测细胞毒性,MnCl2处理剂量为300 μmol/L时用Annexin V-FITC/PI法流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡.结果 与对照组比较,300、600、900μmol/LMnCl2处理24、48、72h,细胞增殖相对比值降低,差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);300、600、900 μmol/L MnCl2处理组各组间相互比较,有剂量一效应关系,差异均有统计学意义(P＜0.01).与对照组比较,600 μmol/L MnCl2组抑制PC12细胞增殖,抑制率为40%,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组及MnCl2组比较,tBHQ组和tBHQ+MnCl2组的细胞出现增殖效应,细胞增殖相对比为1.8,差异均有统计学意义(P＜0.01).300μmol/L MnCl2处理组PC12细胞凋亡率明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),tBHQ+MnCl2组细胞凋亡率低于300μmol/L MnCl2处理组,差异有统计学意义(P＜0.01),细胞凋亡抑制率61%.结论 锰可抑制PC12细胞增殖作用,可诱导细胞凋亡;tBHQ可减弱锰抑制PC12细胞的增殖作用并可削弱锰致PC12细胞凋亡的作用.     

低剂量长期砷暴露对HaCat细胞周期及周期蛋白影响

目的探讨低剂量长期砷暴露对人皮肤角质形成细胞系HaCat细胞周期及周期蛋白D1(cyclin D1)和p21影响。方法HaCat细胞暴露于浓度为0、0.05、0.1 μmol/L的NaAsO₂ 15周后,用流式细胞仪测定10 000个细胞的细胞周期分布;用western blot法检测细胞cyclin D1和p21的蛋白表达水平。结果与对照组比较,NaAsO₂染毒组细胞的G₀/G₁期细胞数明显增高,S期细胞数明显降低,而G₂/M期无明显变化;0.05、0.1 μmol/L砷染毒组细胞内cyclin D1表达水平分别为(152.40±8.17)%、(145.59±2.89)%,与对照组[(99.99±1.13)%]比较,均明显增高;0.05、0.1 μmol/L砷染毒组细胞内p21表达水平分别为(64.06±1.62)%、(39.57±1.82)%,均明显低于对照组的(99.9±2.83)%,呈剂量效应关系(P<0.05)。结论长期低剂量砷暴露可诱导HaCat细胞周期异常,cyclin D1表达上升,p21表达下降。     

构树叶总黄酮对人永生化表皮细胞的防护效果

目的 探讨构树叶总黄酮(total flzvonoids of Brottssonetia papyrifera，TFBP)对铅、砷引起的人永生化表皮细胞活性损伤和氧化损伤的防护效果。方法 采集构树叶并利用聚酰胺柱洗脱法提取构树叶总黄酮。用不同剂量的铅和砷处理细胞，加入不同浓度的构树叶总黄酮，采用噻唑蓝(MTT)染色法检测细胞活性变化，采用丙二醛(MDA)试剂盒测MDA的变化。结果 0．1～1．0mmol／L的醋酸铅对细胞的活性有抑制作用。低浓度亚砷酸钠(0．5～1．0μmol／L)对人永生化表皮细胞有增值作用。高于5．0μmol／L的亚砷酸钠对表皮细胞生长有抑制作用。添加大于100mg／LTFBP后与对照组比较，MTT值明显升高，MDA的含量明显降低，有显著性差异。结论 醋酸铅和亚砷酸钠对人永生化表皮细胞有活性损伤和氧化损伤，构树叶总黄酮TFBP能降低这种氧化损伤，对细胞有防护功能。     

短期暴露于纳米SiO_2对HaCaT细胞基因组DNA甲基化的影响

目的探讨纳米SiO2对体外培养细胞基因组总体DNA甲基化水平的影响。方法分别以2.5、5、10μg/ml纳米SiO2溶液和10μg/ml微米级SiO2处理人皮肤表皮细胞系(HaCaT)24h;以3μmol/L DNA甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(DAC)处理48 h的10μg/ml组为阳性对照,并设立溶剂对照组。应用高效毛细管电泳(HPCE)定量分析纳米SiO2处理细胞24h后,基因组DNA总体甲基化的变化,用Q-PCR和Western Blot方法检测甲基化相关蛋白mRNA和蛋白的表达变化,并用DNA甲基化转移酶活性试剂盒检测DNA甲基化转移酶的活性。结果 HPCE定量分析结果显示纳米SiO2可引起HaCaT细胞总体甲基化程度降低,呈剂量依赖性关系;与正常细胞相比,微米SiO2以及2.5、5和10μg/ml纳米SiO2组分别降低37.8%、43.9%、54.9%和52.8%,差异有显著性(P<0.05);对照组5-aza-dC处理后使HaCaT细胞甲基化程度减少27.3%。各组酶的蛋白表达与mRNA表达水平及DNMTs活性变化具有相同的变化趋势,经纳米SiO2处理的HaCaT细胞,DNMT1、DNMT3a及MBD2表达随着纳米SiO2剂量的上升而下降,DAC组表达水平最低。结论纳米SiO2能引起HaCaT细胞整体基因组DNA甲基化水平降低,可能与DNA甲基化转移酶的酶活性降低有关。     

姜黄素对中波紫外线损伤HaCaT细胞保护作用

目的通过姜黄素(Cur)影响中波紫外线(UVB)辐射HaCaT细胞线粒体膜电位(Δψ)及其相关因子,探讨其对UVB损伤细胞的保护作用及其机制。方法HaCaT细胞经UVB辐射后,加入不同剂量姜黄素继续培养,通过罗丹明123和Fluo-3/AM荧光强度检测细胞Δψ电位和细胞内游离钙离子浓度([Ca²⁺]i),以流式细胞术检测caspase-3和细胞色素c(Cytc)凋亡相关蛋白的表达。结果UVB辐射HaCaT细胞后,低线粒体膜电位的细胞数为(80.8±2.23)%,[Ca²⁺]i为(71.9±1.61)%,caspase-3和Cytc蛋白表达量分别为(29.00±1.60)%和(27.5±1.60)%,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);加入姜黄素后与UVB组比较,细胞线粒体膜电位、[Ca²⁺]i及Cytc和caspase-3蛋白表达均呈剂量-效应关系,即随着药物浓度的增加,具有低细胞线粒体膜电位的细胞数、Cytc和caspase-3蛋白表达均显著减少,[Ca²⁺]i显著降低。结论姜黄素可能通过提高细胞线粒体膜电位,降低[Ca²⁺]i含量,减弱Cytc和caspase-3的级联反应,达到其抑制UVB辐射引起的HaCaT细胞凋亡,具有对UVB损伤HaCaT细胞的保护作用。     

亚砷酸钠致脏器细胞DNA链断裂的实验研究

目的 观察不同剂量亚砷酸钠(NaAsO₂)在不同时相引发小鼠体内细胞DNA链断裂损伤的影响.方法 采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)分别测定ICR小鼠皮下注射NaAsO₂0.4,2,10mg/kg后1,3,6h的脾脏、胸腺、骨髓和肝细胞的DNA链断裂损伤.结果 不同剂量亚砷酸钠注射后,可以发现2和10mg/kgNaAsO₂可诱发脾细胞、胸腺细胞、骨髓细胞DNA链断裂,各组出现的彗星细胞百分比明显高于对照组,同时DNA迁移距离也较对照组明显增大;而在染毒后不同时相观察的结果表明,NaAsO₂诱发脾细胞出现DNA链断裂损伤在1h最为明显,而胸腺细胞和骨髓细胞相对较晚,DNA链断裂损伤高峰出现在染毒3h;染毒6h,各种组织细胞的DNA链断裂损伤开始减少,逐渐趋于正常.各剂量组及时间点均未观察到亚砷酸钠有诱导肝细胞DNA链断裂损伤的作用.结论 2mg/kg和10mg/kgNaAsO₂可诱发小鼠体内脾、胸腺和骨髓细胞的DNA链断裂损伤,但不同细胞对NaAsO₂作用的反应性不完全一致.     

无机砷对肝细胞转录因子Nrf2及其调控蛋白表达影响

目的 探讨不同时间和不同浓度亚砷酸钠(NaAsO₂)暴露对Chang肝细胞株NF-E2相关因子2(Nrf2)、及其调控的下游抗氧化酶NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)和血红素单加氧酶-1(HO-1)蛋白表达的影响。方法 25μmol/L NaAsO₂作用Chang肝细胞2、4、6、12和24 h;或不同浓度的NaAsO₂(10、25和50μmol/L)作用Chang肝细胞6 h,免疫印迹法(western blot)检测细胞内Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达情况。结果 25μmol/L的NaAsO₂可以明显诱导Chang肝细胞Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达(P<0.01);Nrf2蛋白2 h开始明显诱导,4 h表达水平最高,此后随暴露时间的延长虽然表达有所下降,但持续至24 h仍明显高于对照组;NQO1的蛋白表达水平也从4 h开始增加并持续至24 h;HO-1的蛋白表达则从6 h开始明显诱导,且随暴露时间的继续延长表达持续上升,具有明显的时间-效应关系;10、25和50μmol/L NaAsO₂染毒6 h,Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达均随染毒剂量的增加而大量诱导,具有明显的剂量-效应关系(P<0.01)。结论 NaAsO₂暴露能够诱导Chang肝细胞Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表达增强,且具有一定的剂量-效应关系。     

中波紫外线对人永生化表皮细胞损伤作用

目的 探讨中波紫外线（UVB）对人永生化表皮（HaCaT）细胞的损伤作用,为紫外线损伤防护提供技术支持。方法 取体外培养HaCaT细胞,用0（对照组）、10、30、60 mJ/cm²剂量的UVB照射后继续培养12 h,以流式细胞术检测细胞凋亡率,用彗星实验（单细胞凝胶电泳）检测细胞DNA损伤情况。结果 对照组、10、30、60 mJ/cm²紫外线照射组HaCaT细胞早期凋亡率分别为（1.2±0.14）%、（2.23±0.37）%、（4.13±0.29）%、（5.97±0.17）%,晚期凋亡率分别为（2±0.13）%、（7.63±0.52）%、（23.36±0.98）%、（40.46±1.39）%,与对照组比较,UVB照射组HaCaT细胞早期、晚期凋亡率明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）;对照组、10、30、60 mJ/cm²紫外线照射组HaCaT细胞DNA尾矩分别为（0.13±0.25）、（21.78±2.31）、（53.48±5.66）、（79.16±7.47）,Olive尾矩分别为（0.32±0.47）、（16.17±1.96）、（36.43±2.89）、（51.71±1.87）,与对照组比较,UVB照射组HaCaT细胞DNA尾矩、Olive尾矩明显延长,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 UVB照射可使HaCaT细胞DNA产生损伤,诱发细胞凋亡,细胞DNA损伤可能是某些高原罕见病的发病原因之一。