刺五加苷B介导PI3K/Akt/mTOR通路诱导肺癌细胞凋亡和自噬北大核心CSCD

探讨刺五加苷B对肺癌A549和H460细胞凋亡和自噬的影响及其分子机制。采用噻唑蓝比色法(methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric,MTT)检测5、10、15、20、25、30、35、40、45 mmol·L^(-1)刺五加苷B对肺癌细胞的细胞毒作用;台盼蓝排斥实验检测不同时间刺五加苷B对肺癌细胞A549和H460存活率的影响;克隆形成实验检测刺五加苷B对肺癌细胞A549和H460增殖的影响;acridine orange/ethidium bromide(AO/EB)荧光双染、Hoechst 33342荧光染色法检测刺五加苷B对肺癌细胞A549和H460凋亡的影响,并应用Western blot法检测凋亡相关蛋白探究凋亡相关分子机制;应用AO荧光染色、Western blot法检测自噬泡以及自噬相关蛋白P62和微管相关蛋白1轻链3蛋白(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达情况。结果显示,与对照组相比,刺五加苷B以浓度依赖的方式抑制肺癌细胞A549和H460的生长,并得到刺五加苷B对肺癌细胞A549和H460最佳作用时间均为24 h,最佳作用浓度分别为28.64、22.16 mmol·L^(-1);刺五加苷B能够抑制肺癌细胞A549和H460集落形成;与对照组相比,在刺五加苷B的作用下能够促进凋亡小体的形成诱导细胞发生凋亡,同时诱导线粒体途径相关蛋白的表达;在刺五加苷B的作用下肺癌细胞中酸性自噬泡增多,LC3Ⅱ表达增加、P62蛋白表达下降,磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(serine-threonine kinase,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶标(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路中PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达下降。研究表明,刺五加苷B能够抑制肺癌细胞生长,减少集落形成,并发现是通过线粒体途径诱导肺癌细胞发生凋亡,此外还可诱导细胞自噬的发生,其作用机制可能与PI3K/Akt/mTOR通路有关。     

厚朴酚调控人小细胞肺癌H446细胞凋亡的机制研究

目的:探讨厚朴酚对人小细胞肺癌H446细胞增殖和凋亡的影响。方法:体外培养人小细胞肺癌H446细胞,经不同浓度和不同时间的厚朴酚作用后,应用MTT法检测厚朴酚对H446细胞增殖的影响;采用流式细胞仪罗丹明123染色法检测线粒体膜电位的改变;蛋白印迹方法检测凋亡相关蛋白的表达。结果:厚朴酚可呈时间剂量依赖性抑制H446细胞增殖,诱导线粒体膜电位的下降,免疫印迹结果显示Bcl-2的表达降低,Bax、Cyto.c和活化pro-caspase 9的表达增加。结论:厚朴酚可显著抑制H446细胞增殖,介导线粒体途径的细胞凋亡。     

黄芪甲苷减轻异丙肾上腺素诱导H9c2细胞肥大损伤的机制研究

目的:探讨黄芪甲苷减轻异丙肾上腺素(ISO)诱导H9c2心肌细胞肥大损伤的保护作用及潜在机制。方法:以100μmol/L ISO作用H9c2细胞建立细胞肥大损伤模型。将细胞分为正常对照组、模型组及黄芪甲苷6.25、12.5、25μmol/L组,黄芪甲苷预给药2 h,ISO作用24 h。CCK-8法检测细胞活力,荧光染色测定细胞表面积,Hoechst 33342和TUNEL染色测定细胞凋亡率。比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,荧光探针DCFH-DA检测活性氧(ROS)水平,WST-8法测定超氧化物歧化酶(SOD)水平。q RT-PCR检测Bcl-2、Bax、P62、LC3 m RNA水平。Western Blot检测Sirt1、P62、Caspase-3、Beclin、P53蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平。结果:黄芪甲苷能显著减轻ISO诱导的H9c2细胞肥大损伤,减少心肌细胞表面积及LDH的释放,降低细胞凋亡率及细胞内ROS水平,升高SOD水平,上调自噬相关m RNA及蛋白的表达,下调凋亡相关m RNA及蛋白的表达。结论:黄芪甲苷能有效抑制ISO诱导的H9c2细胞肥大及凋亡,其机制可...     

喜炎平注射液联合顺铂对抑制肺癌细胞的协同作用

目的:探究喜炎平注射液与顺铂联合用药是否存在协同抑制肺癌细胞的作用。方法:体外培养人肺癌H460细胞株,经喜炎平注射液和(或)顺铂作用后,采用Hoechst 33342流式细胞术检测细胞凋亡的变化程度,采用MTT法检测肺癌细胞的存活率。结果:喜炎平注射液联合顺铂能够明显抑制肺癌增殖,其抑制效果明显强于两药单用;喜炎平注射液联合顺铂能够导致肺癌细胞凋亡,其作用机制可能为活化Caspase-3、Caspase-7,激活Caspase系统,从而诱导人肺癌H460细胞株细胞凋亡。结论:喜炎平注射液和顺铂两药联用具有明显的协同作用,能有效抑制肺癌细胞增殖,并且诱导细胞凋亡,其作用机制可能与活化Caspase系统有关。     

麦门冬汤合千金苇茎汤提取部位对非小细胞肺癌H460细胞毒作用的研究

目的:通过药效评价实验筛选出麦门冬汤合千金苇茎汤(简称金方)的有效部位。方法:MTT法观察不同浓度的金方提取出的8个部位对肺癌NCI-H460细胞和正常人胚肺成纤维细胞HFL-I生长增殖的影响,初步筛选有效部位;平板细胞克隆形成试验,检测有效部位对肿瘤细胞克隆形成能力的影响;同时用流式细胞仪进行细胞周期检测分析,评价有效部位对细胞周期的影响;Hoechst33258染色后在荧光显微镜下观察NCI-H460细胞凋亡的形态变化。结果:不同浓度提取各部位中,6部位对NCI-H460细胞有显著的生长抑制作用;作用72 h后,荧光显微镜下可见NCI-H460细胞核固缩,染色质凝聚等凋亡形态学特征;流式检测显示对NCI-H460细胞主要抑制在S期,并有凋亡细胞出现。结论:麦门冬汤合千金苇茎汤提取各部位中6部位对NCI-H460细胞具有细胞毒作用,可有效抑制肺癌细胞生长,并对人体正常细胞(胚肺成纤维细胞)无显著影响,可以进一步分离筛选组分及单体化合物。     

鱼腥草生物碱抑制人大细胞肺癌细胞生长研究

目的研究鱼腥草生物碱对人大细胞肺癌细胞株H460生长的抑制作用。方法用20倍95%乙醇回流提取,大孔树脂分离纯化鱼腥草生物碱;MTS实验观察鱼腥草生物碱对H460细胞体外增殖的作用,计算IC50;观察鱼腥草生物碱对H460细胞形态及细胞核的影响,流式细胞仪检测鱼腥草生物碱抑制H460细胞周期及诱导H460凋亡的情况。结果鱼腥草生物碱可抑制H460细胞增殖,IC50为130.17μg/m L。鱼腥草生物碱可致H460细胞萎缩、死亡、细胞核碎裂及出现凋亡小体,能使H460细胞周期阻滞于G0/G1期,诱导H460凋亡。结论鱼腥草生物碱能抑制H460细胞的生长,具有诱导其发生凋亡的作用。     

厚朴酚对抗6-OHDA诱导PC12细胞损伤的作用机理研究

目的:探讨厚朴酚对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导PC12细胞损伤的保护作用可能机制.方法:将厚朴酚或6-OHDA加入培养的PC12细胞中.四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)检测细胞活力,用荧光分光计法测定细胞损伤过程中活性氧、半胱氨酸蛋白酶3的含量变化.结果:在加入100μmol/L 6-OHDA时PC12细胞活性显著下降,厚朴酚(0.1～10μmol/L)预处理1 h可明显抑制6-OHDA导致的PC12细胞活性下降,ROS含量水平的上升以及caspase-3的活性上升.结论:厚朴酚对6-OHDA诱导的PC12细胞损伤有一定的保护作用,其作用机制涉及到抑制细胞内ROS的产生和Caspase-3的激活.     

射干提取物抑制肺癌细胞恶性行为的研究

目的:研究中药射干对肺癌细胞恶性行为的影响,并探讨其作用机理。方法:制备射干乙醇提取物,作用于体外培养的人肺癌细胞H460,采用软琼脂集落形成法检测锚定非依赖性生长能力,Matrigel穿膜法检测细胞侵袭能力,悬浮成球法检测肿瘤干细胞自我更新能力,实时荧光定量PCR法检测细胞中microRNA-21的表达水平。结果:射干乙醇提取物有力抑制了肺癌细胞的锚定非依赖性生长能力和侵袭能力,显著下调了肺癌细胞中microRNA-21的表达水平。结论:射干可以抑制肺癌细胞的恶性行为,具有良好的抗肺癌应用价值。     

蓝莓花青素经线粒体凋亡通路诱导人胃腺癌BGC-823细胞凋亡

目的:研究蓝莓花青素(Blueberry Anthocyanin,BA)诱导人胃腺癌BGC-823细胞凋亡过程中线粒体超微结构、线粒体膜电位及凋亡调节蛋白的改变。方法:采用倒置相差显微镜观察细胞形态;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dU TP缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡;透射电镜法观察线粒体超微结构改变;原位末端标记/碘化吡啶(TUNEL/PI)双染流式细胞术检测细胞凋亡率;罗丹明123(Rhodamine 123,Rho123)荧光探针标记流式细胞仪检测和分析线粒体跨膜电位(MTP,△Ψm);蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡调节相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平。结果:蓝莓花青素呈剂量和时间依赖性的抑制人胃腺癌BGC-823细胞生长;100μg/ml蓝莓花青素作用4h后线粒体肿胀空泡化、内部结构消失,8h后细胞核染色质成块状边集,细胞凋亡;不同浓度蓝莓花青素作用24h后,流式细胞仪检测BGC-823细胞凋亡率呈浓度依赖性增加。不同浓度蓝莓花青素作用BGC-823细胞24h后,代表线粒体膜电位的Rho123荧光强度降低;经100μg/ml蓝莓花青素刺激BGC-823细胞4、12、24小时后促凋亡蛋白Bax表达升高,抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低。结论:蓝莓花青素对人胃腺癌BGC-823细胞具有生长抑制和诱导凋亡作用,诱导凋亡可能通过线粒体凋亡途径起作用。     

厚朴酚对MPTP诱导PC12细胞凋亡的抑制作用

目的:探讨厚朴酚(mangolol,Mag)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导PC12细胞凋亡的抑制作用及可能作用机制。方法:将厚朴酚(终浓度0.1,10μmol.L-1)或/和MPTP(终浓度50,100,150,200μmol.L-1)加入到培养的PC12细胞中。四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞增殖活性,用流式细胞仪检测细胞凋亡率,以及Western-blot法检测Bax和Bcl-2的蛋白表达变化。结果:在加入不同浓度的MPTP处理细胞24 h,细胞增殖活性渐次降低,而厚朴酚0.1～10μmol.L-1预处理1 h可明显减轻MPTP导致的PC12细胞的损伤,抑制细胞凋亡,以及Bcl-2/Bax比值的改变。结论:厚朴酚对MPTP诱导的PC12细胞凋亡损伤有一定的抑制作用,其作用机制涉及到影响细胞内Bcl-2/Bax蛋白的表达。     

自噬对槲皮素诱导人肝癌SMMC-7721细胞死亡的影响

 目的 研究自噬在槲皮素（quercetin,Que）诱导的人肝癌细胞系SMMC-7721死亡中的作用。方法 采用四甲基偶氮唑蓝法测定槲皮素对SMMC-7721细胞的抑制作用;单丹磺酰戊二胺、免疫荧光法观察给药后自噬的发生; 乳酸脱氢酶 (LDH)漏出率、蛋白印迹法观察槲皮素诱导的SMMC-7721细胞死亡的分子机制。结果 槲皮素对SMMC-7721生长有显著抑制作用,呈明显的时间、剂量依赖性; 槲皮素可激活SMMC-7721 细胞的LC3的表达、诱导自噬的发生;乳酸脱氢酶漏出率实验结果表明,在槲皮素给药前用3-甲基腺嘌呤（3-MA）阻断自噬或者氯喹碱化溶酶体,可增强槲皮素对SMMC-7721细胞的细胞毒作用; 蛋白印迹结果显示,槲皮素可使SMMC-7721细胞溶酶体组织蛋白酶B的表达明显增强。结论 槲皮素能明显抑制SMMC-7721 细胞的生长,并诱导其发生自噬;自噬激活能降低槲皮素对SMMC-7721细胞的毒性;自噬的发生与溶酶体酶组织蛋白酶B表达增强相关。     

人参皂苷Rh_2通过激活p38诱导K562细胞自噬凋亡的实验研究

为了研究人参皂苷Rh2对人白血病细胞K562的凋亡作用,并从自噬角度来探讨其机制。实验采用CCK-8方法检测人参皂苷单体Rh2对人白血病K562细胞增殖抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡;Hoechest染色观察细胞核染色质的形态;吖啶橙和MDC染色观察Rh2对细胞自噬的影响;Western blot和RT-PCR检测Rh2对白血病细胞自噬重要基因的表达的影响;运用自噬抑制剂(3-MA)研究自噬对细胞增殖和凋亡的影响。CCK-8显示人参皂苷Rh2在低浓度时能有效抑制白血病细胞增殖,且其抑制作用具有浓度和时间依赖性;FCM和Hoechest显示Rh2能增加细胞的凋亡和染色质呈凋亡形态改变;吖啶橙和MDC染色发现Rh2组细胞的绿色荧光增强,并出现大量酸性自噬小泡;Western blot和RT-PCR结果发现Rh2能上调Beclin-1,LC3A,LC3B,激活型Caspase-3和p-p38的表达;运用细胞自噬剂(3-MA)会削弱Rh2对K562的增殖抑制和促凋亡作用。人参皂苷Rh2可能通过激活磷酸化的p38,诱导细胞自噬途径,从而抑制K562细胞增殖和促进凋亡作用。     

固本抑瘤Ⅱ号及其拆方含药血清诱导MCF7细胞自噬的研究

目的:研究固本抑瘤Ⅱ号(GYⅡ)及其拆方大鼠含药血清对人乳腺癌细胞MCF7自噬的影响。方法:制备GYⅡ及其拆方大鼠含药血清,培养MCF7细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长抑制,单丹磺酰尸胺(MDC)及Hoechst 33342双染色荧光显微镜、微管相关蛋白1轻链3(MAP-LC3)蛋白Ⅱ(MAP-LC3-Ⅱ)染色激光共聚焦及透射电镜观察自噬,MAP-LC3-Ⅱ/DNA双参数流式细胞术同步分析细胞自噬与细胞周期。结果:与空白组比较,全方组、益气组含药血清处理MCF7细胞表现出细胞抑制效应,活血组、鸡血藤组含药血清处理MCF7细胞均表现出明显的自噬。结论:GYⅡ全方和益气组具有抑制MCF7细胞增殖的效应,而活血组和鸡血藤组未见抑制作用,可能与该两组含药血清诱导MCF7细胞自噬有关。     

槲皮素诱导MCF-7细胞死亡机制中自噬与凋亡的相关性

 目的 研究槲皮素（quercetin,Que）在人乳腺癌细胞系（MCF-7）死亡中的作用,初步探讨自噬和凋亡机制在MCF-7死亡中的相关性。方法 采用噻唑蓝（MTT）法测定Que对MCF-7细胞的抑制作用; AO/EB染色、Hochest33258染色、单丹磺酰尸胺（MDC）、免疫荧光法观察给药后自噬和凋亡的发生;MTT法结合乳酸脱氢酶（LDH）漏出率和流式细胞仪研究自噬与凋亡机制在MCF-7死亡中的关系。结果 Que对MCF-7生长有显著抑制作用,呈明显的时间、剂量依赖性; Que可诱导MCF-7 细胞发生自噬和凋亡;在Que给药前用3-甲基腺嘌呤（3-MA）阻断自噬或用氯喹碱化溶酶体,Que对MCF-7的细胞毒性作用增强;碱化溶酶体后,Que可使 MCF-7细胞的凋亡峰提前;溶酶体组织蛋白酶抑制剂E64d能降低Que对MCF-7细胞的生长抑制。结论 Que能明显抑制MCF-7细胞的生长,并诱导其发生自噬和凋亡,自噬在早期起保护作用,另一方面溶酶体组织蛋白酶可能参与了Que诱导的MCF-7细胞死亡;溶酶体可能是MCF-7细胞发生自噬和凋亡的枢纽。     

Graveoline Isolated from Ethanolic Extract of Ruta graveolens Triggers Apoptosis and Autophagy in Skin Melanoma Cells: A Novel Apoptosis‐Independent Autophagic Signaling Pathway

Anti‐cancer drugs generally kill cancer cells by apoptosis but fail to do so when they become resistant and escape apoptosis signals. But these resistant cells can still be killed by autophagy. Therefore, drugs having both apoptotic and autophagic abilities are solicited in effective cancer management. In search of such a drug, we examined the efficacy of graveoline, a bioactive compound isolated from Ruta graveolens on skin melanoma A375 cells through the use of specific signaling cascades and their inhibitors. Cytotoxicity of graveoline was tested by conducting MTT assay. Induction of autophagy and apoptosis was checked. Expression of related proteins and their localization were studied by conducting immunoblot assay and through confocal microscopy, respectively. We found graveoline‐induced Beclin‐1 associated autophagy in A375 cells and 3‐methyladenine, an inhibitor of autophagy did not affect apoptosis. Conversely, caspase inhibitor that blocked apoptosis did not affect autophagic cell death, suggesting thereby that these two were independent events. Use of reactive oxygen species (ROS) scavengers inhibited cell death, but blocking autophagy did not affect graveoline‐induced ROS generation, suggesting that ROS generation ensued autophagy. Thus, graveoline‐induced both apoptotic and autophagic cell death in skin melanoma cells, a desirable quality in effective anti‐cancer drug design. Copyright © 2013 John Wiley & Sons, Ltd.     

Apoptotic Effect of Galbanic Acid via Activation of Caspases and Inhibition of Mcl‐1 in H460 Non‐Small Lung Carcinoma Cells

Galbanic acid (GBA), a major compound of Ferula assafoetida, was known to have cytotoxic, anti‐angiogenic and apoptotic effects in prostate cancer and murine Lewis lung cancer cells; the underling apoptotic mechanism of GBA still remains unclear so far. Thus, in the present study, the apoptotic mechanism of GBA was investigated mainly in H460 non‐small cell lung carcinoma (NSCLC) cells because H460 cells were most susceptible to GBA than A549, PC‐9 and HCC827 NSCLC cells. Galbanic acid showed cytotoxicity in wild EGFR type H460 and A549 cells better than other mutant type PC‐9 and HCC827 NSCLC cells. Also, GBA significantly increased the number of Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) positive cells and sub G1 population in H460 cells. Western blotting revealed that GBA cleaved poly (ADP‐ribose) polymerase (PARP), activated Bax and caspase 9, attenuated the expression of Bcl‐2, Bcl‐x_L, and Myeloid cell leukemia 1 (Mcl‐1) in H460 cells. However, interestingly, overexpression of Mcl‐1 blocked the ability of GBA to exert cytotoxicity, activate caspase9 and Bax, cleave PARP, and increase sub G1 accumulation in H460 cells. Overall, these findings suggest that GBA induces apoptosis in H460 cells via caspase activation and Mcl‐1 inhibition in H460 cells as a potent anticancer agent for NSCLC treatment. Copyright © 2015 John Wiley & Sons, Ltd.     

大补阴汤含药血清对H460细胞的生长抑制作用

目的：探讨中药复方大补阴汤含药血清对人非小细胞性肺癌H460细胞的生长抑制作用。方法：将小鼠随机分为正常组、生理盐水组和大补阴汤组,连续灌胃给药7天后,眼眶取血,分离血清;生物倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测大补阴汤含药血清对人非小细胞性肺癌H460细胞的生长抑制作用。结果：大补阴汤作用H460细胞48h和72h以后,可见部分细胞变圆,体积变小,有凋亡小体产生。大补阴汤可时间依赖性抑制H460细胞的生长。结论：中药复方大补阴汤含药血清可以抑制H460细胞的增殖,为进一步探讨其抗肿瘤作用机制提供实验依据。     

“七叶灵”颗粒抑制H460细胞生长和转移作用靶点的实验研究

目的观察“七叶灵”颗粒对人肺腺癌H460细胞生长的抑制作用,以及对H460细胞中COX-2、OPN和hTERT表达的影响,探讨“七叶灵”颗粒在抑制肿瘤细胞生长、延缓肿瘤细胞的转移和浸润方面的作用靶点。方法MTT法测定“七叶灵”颗粒对人肺腺癌H460细胞生长的抑制率,根据结果得出IC50值。用RT-PCR法检测不同浓度的“七叶灵”颗粒对COX-2、OPN和hTERT表达的影响。结果①“七叶灵”颗粒对人肺腺癌H460细胞的生长有抑制作用。②IC50值随时间的增加明显降低（P〈0．05）。③RT-PCR法结果显示：“七叶灵”颗粒抑制了COX-2、OPN和hTERT表达（P〈0．05）。结论“七叶灵”颗粒具有益气养精、清热解毒、消肿散结的功效,有抑制人肺腺癌H460细胞生长的作用,并通过调节COX-2、OPN和hTERT的表达,起到抑制肿瘤细胞生长,延缓肿瘤细胞转移和浸润的作用。     

电针对大鼠脑缺血后脑内神经细胞凋亡的影响

本研究运用TUNEL染色法观察电针对大鼠脑缺血后脑内神经细胞凋亡的影响。结果显示：在假手术组和单纯电针组，大鼠脑内未见神经细胞凋亡，脑缺血后12小时，大脑皮层梗塞区内大量的神经细胞凋亡，在缺血十电针组，大脑皮层梗塞区内神经细胞凋亡数目显著减少。结果表明：电针抑制脑缺血后脑内神经细胞凋亡。