无细胞真皮支架与同种细胞相容性的动态观察

背景：无细胞真皮作为真皮替代材料已广泛应用于临床皮肤缺损的修复,能否将其应用范围扩展使其作为真皮支架用于组织工程皮肤的构建呢？目前国内外对这一方面都在进行着大量的研究。目的：动态评价同种无细胞真皮基质的细胞相容性,验证其作为皮肤组织工程支架材料的可行性。设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-10/2008-03在中国辐射防护研究院组织工程实验室完成。材料：试验中皮肤样品源自武警山西总队医院行包皮环切术的健康儿童切除的包皮。方法：采用高渗盐-SDS-胰蛋白酶法制备同种无细胞真皮,组织块贴壁法培养人成纤维细胞,使其接种于支架材料上,通过苏木精-伊红染色以及扫描电镜观察成纤维细胞在支架材料上的贴附、生长、增殖以及迁移情况。主要观察指标：①同种无细胞真皮基质的形态结构。②无细胞真皮基质的细胞相容性。结果：同种无细胞真皮基质肉眼观察为乳白色,柔韧有弹性,苏木精-伊红染色和扫描电镜显示表皮以及真皮乳头层和网状层细胞以及细胞成分已经完全去除,且真皮的胶原网状支架保留完整;接种该支架材料上的成纤维细胞生物学行为活跃,不仅能够在其表面贴附、生长、增殖,并沿细胞间隙向真皮内部浸润生长,穿过乳头层达到网状层,而且分泌细胞外基质,填充细胞间隙形成膜片样结构。结论：通过高渗盐-SDS-胰蛋白酶法制备的无细胞真皮具有良好的细胞相容性,可作为真皮支架材料用于组织工程皮肤的构建。     

异种无细胞真皮活性复合皮的制备

目的体外重建异种无细胞真皮活性复合皮.方法将表皮细胞、成纤维细胞种植于异种无细胞真皮基质表面,体外培养约1周,定时取材行真皮表面HE染色、常规组织切片HE染色及扫描电镜观察.结果表皮细胞、成纤维细胞种植后24h即贴附于真皮表面,电镜观察可见有伪足形成.培养5～7d可融合为致密单层细胞膜.结论以无细胞真皮为支架,采用细胞培养技术可于体外重建复合皮.     

同种异体人脱细胞真皮基质的细胞相容性

目的研制一种新型的同种异体人脱细胞真皮基质(Acellulardermalmatrix,ADM)的细胞相容性,为寻找理想的真皮代替品提供依据。方法用高渗盐除去人皮肤的表皮细胞层,经戊二醛交联后以低含量NaOH消蚀除去真皮中的细胞成分,得到脱细胞真皮基质,利用体外细胞培养法检测其相容性。结果皮肤中所有细胞成分都被消除,胶原纤维稍松散,结构完整,排列正常。ADM无细胞毒性,培养的NIH3T3细胞能在其上贴附、增殖。结论经高渗盐—NaOH消蚀法能完全去除皮肤中的细胞成分而不损坏胶原纤维的三维结构,制备过程简单,有较好的细胞相容性,具有临床应用价值。     

同种异体人脱细胞真皮基质的细胞相容性

目的：研制一种新型的同种异体人脱细胞真皮基质(Aeellular dermal matrix，ADM)的细胞相容性，为寻找理想的真皮代替品提供依据。方法：用高渗盐除去人皮肤的表皮细胞层，经戊二醛交联后以低含量NaOH消蚀除去真皮中的细胞成分，得到脱细胞真皮基质，利用体外细胞培养法检测其相容性。结果：皮肤中所有细胞成分都被消除，胶原纤维稍松散，结构完整，排列正常。ADM无细胞毒性，培养的NIH3T3细胞能在其上贴附、增殖。结论：经高渗盐—NaOH消蚀法能完全去除皮肤中的细胞成分而不损坏胶原纤维的三维结构，制备过程简单，有较好的细胞相容性，具有临床应用价值。     

异种无细胞真皮活性复合皮的制备

目的：体外重建异种无细胞真皮活性复合皮,方法：将表皮细胞、成纤维细胞种植于异种无细胞真皮基质表面,体外培养约１周,定时取材行真皮表面ＨＥ染色、常规组织切片ＨＥ染色及扫描电镜观察。结果：表皮细胞,成纤维细胞种植生２４ｈ即贴附于真皮表面,电镜观察可见有伪足形成,培养５～７ｄ可融合为致密单层细胞膜,结论：以无细胞真皮为支架,采用细胞培养技术可于体外重建复合皮。     

人去表皮真皮细胞活性及组织结构特征(英文)

背景:研究证实,去表皮的真皮可以作为真皮替代物,在其上接种角质形成细胞后形成表皮结构.但有关真皮替代物细胞生物活性、组织结构特点及基底膜成分分析的研究报道较少.目的:观察人去表皮真皮细胞活性及组织结构特征.方法:将健康成人皮瓣用56℃PBS溶液处理以去除表皮,用液氮连续冻融处理去除真皮中细胞成分,获得去表皮真皮.以组织块培养法观察去表皮真皮细胞活性.以苏木精染色检测去表皮真皮细胞核,以波形蛋白免疫组化检测去表皮真皮成纤维细胞成分.以PAS染色及Ⅳ型胶原免疫组化检测基底膜及其成分.以VG染色检测去表皮真皮胶原纤维,Weigert染色检测弹力纤维,VG与Weigert双染色检测胶原纤维及弹力纤维,透射及扫描电镜观察去表皮真皮超微结构.结果与结论;用组织块培养方法培养的去表皮真皮2周无细胞生长.苏木精-伊红染色显示去表皮真皮中无细胞核、波形蛋白免疫组化显示去表皮真皮中无波形蛋白表达.VG染色显示去表皮真皮胶原纤维染成玫瑰红色,Weigert染色显示去表皮真皮弹力纤维染成紫黑色,双染色进一步显示胶原纤维与弹力纤维均匀排列.去表皮真皮表面及附属器残留部位PAS反应强阳性,Ⅳ型胶原表达明显.透射及扫描电镜下观察到去表皮真皮中胶原,弹力纤维交错排列,间有孔隙,相互交织成网.去表皮真皮无活细胞成分,真皮基质表面及附属器管腔壁仍保留糖原、Ⅳ型胶原等基底膜成分,真皮基质中富含胶原及弹力纤维,是一种类似在体真皮的三维胶原基质.     

猪真皮基质上培养人表皮细胞重组皮肤的实验研究

目的:在猪真皮基质培养人表皮细胞重组复合皮。方法:取成人健康的包皮(包皮切除术自愿的提供者)1cm2全层皮片中用Th-Tr法分离表皮细胞并进行计数,以无血清完全培养基培养法作为原代细胞培养,空白对照组不放任何培养支持物。脱细胞猪真皮基质作为支架的气液界面培养法培养表皮细胞为实验组。形态学、常规组织学、HE染色观察,免疫组织染色(SABC法)检测复合皮肤中Pancy-tokeratin和层粘连蛋白(laminin)。结果:HE染色显示有2层上皮细胞形成和无基底膜形成,稍有角质化,免疫组化染色显示Pancy-tokeratin( ),提示在猪真皮基质上生长的为人表皮细胞;Laminin(±),提示培养的人表皮细胞产生的新的基底膜不明显。结论:在猪真皮基质上能进行人表皮细胞的培养,这种人表皮细胞能存活,但生长不太活跃。基底膜形成不明显。实验证明能在体外构建具有表皮与真皮复合皮肤,但这种复合皮能否作为一种临床有效皮肤还需进一步证实。     

反复冻融配合超声振荡洗涤制备猪脱细胞真皮基质

目的:改进猪脱细胞真皮基质制备方法,并与传统制备方法进行比较,为临床大面积烧伤患者治疗提供更安全、更廉价的异体皮源。方法:实验于2003-10/2007-03在北京积水潭医院烧伤研究所完成。①实验材料:实验动物为3月龄清洁中华香猪,由北京积水潭医院动物室提供。实验符合动物伦理学标准。②实验方法:取25kg实验室环境养殖的健康中华香猪,麻醉处死去毛后取躯干部位全层皮肤,仔细剃除毛发,去除脂肪。采用反复冻融,配合超声振荡和化学去污剂处理的复合方法,获得脱细胞猪真皮基质。③实验评估:利用常规病理检查和电子显微镜检查其有无明显细胞碎片残留,测试其机械强度、亲水性和细胞毒性,通过动物埋藏实验确定其组织相容性,并以戊二醛交联的脱细胞异体皮,戊二醛交联的脱细胞猪皮,以及新鲜人皮作对照,结果:①常规病理检查可见真皮结构完整,无明显破坏;上皮细胞清除彻底,无明显细胞碎片残留,电子显微镜检查见脱细胞猪皮的胶原结构完整,未发现破坏痕迹,无明显细胞残留。②各组中脱细胞猪皮基质的极限应力强度和新鲜人皮接近,无明显统计学差别(P>0.05);戊二醛交联的脱细胞猪皮强度最低,戊二醛交联的脱细胞异体皮的强度最高,且与新鲜人皮相比也有明显统计学差别(P<0.01)。③戊二醛交联的脱细胞异体皮亲水性最强,其余三者相似。④脱细胞猪皮基质浸提液中细胞生长旺盛,7d后脱细胞猪皮基质两次测试相对增殖度值分别为:182,169。按照6级分级标准,脱细胞猪皮基质毒性级别为0级,在国家标准允许范围内。⑤脱细胞猪皮基质植入1,3周,边界不清,炎性反应与吸收均不明显,新生血管与成纤维细胞长入,植入12周,植入物与组织融为一体,新生血管与成纤维细胞填充真皮支架。结论:所制备的猪脱细胞真皮基质产品真皮基质完整,细胞毒性低,物理性能与人皮接近。     

三种组织工程鼓膜支架材料的生物相容性

背景：自体组织修复鼓膜穿孔存在增加手术创伤、取材有限等缺点，构建组织工程鼓膜是鼓膜穿孔治疗的发展方向。目的：构建3种不同材料的组织工程鼓膜支架材料，并评价其生物相容性。设计、时间及地点：随机对照动物实验，细胞学体内观察。于2004-08／2005-02在解放军第四军医大学组织工程中心完成。材料：将健康小猪的硬脑膜、真皮及人羊膜进行脱细胞处理。方法：将预先培养的豚鼠鼓膜成纤维细胞种植于3种材料表面，观察成纤维细胞的生长状态；18只豚鼠随机分为3组，于右侧背皮下分别埋植制备的脱细胞硬脑膜、真皮及人羊膜。主要观察指标：3种脱细胞生物支架材料的显微结构及组织相容性。结果：3种脱细胞材料均为网状结构，无任何细胞及细胞残核存在：豚鼠鼓膜成纤维细胞能够很好地贴附于3种脱细胞材料生长，无细胞毒性：将3种组织材料分别埋植于豚鼠皮下后，无埋植材料排出现象，1周时植入材料周围有较明显炎症反应，其中以脱细胞真皮周围组织反应较轻，4周时炎症反应消失。结论：通过脱细胞方法可以成功建立具有良好生物相容性的组织工程鼓膜支架材料：3种材料中以脱细胞猪真皮的生物相容性最佳。     

脱细胞组织基质来源的生物材料

药脱细胞基质一般指异体组织经细胞灭活处理后,制备成无活体细胞存在的细胞外基质成分和结构,主要包括胶原、弹性蛋白、氨基葡糖糖、结构蛋白等。因其无抗原性,以及良好的生物相容性,成为组织工程支架材料的选择之一。目前,人源异体脱细胞真皮基质、猪源异体脱细胞真皮基质、猪源心脏瓣膜、猪源尿道膀胱脱细胞基质等产品已被批准应用于临床,脱细胞基质在软     

Construction of a dermis–fat composite in vivo: Optimizing heterogeneous acellular dermal matrix with in vitro pretreatment

Dermis–fat composite tissues have been widely used in plastic and reconstructive surgery and were previously constructed using hydrogel‐type scaffolds. The constructs can be used for in vitro cosmetic and pharmaceutical testing but are not mechanically strong enough for in vivo applications. In this study, we used heterogeneous (porcine) acellular dermal matrix (PADM) as dermal layer scaffold. PADM was pretreated with the laser micropore technique and then precultured with rat adipose‐derived stem cells (rADSCs) in vitro. rADSCs proliferated well on pretreated/unpretreated PADM, showing increased expression of genes associated with inflammatory regulation, proangiogenesis, and stemness, indicating that pretreated/unpretreated PADM both provide a beneficial microenvironment for rADSCs to exert their paracrine function. After in vitro processing, the rADSCs–polyporous PADM and PADM without pretreatments were implanted into the back of rats respectively, followed by adipose tissue transplantation. After implantation, the inflammation induced by pretreated PADM was significantly attenuated and localized compared to the unpretreated group. Moreover, the vascularization was faster, and more adipose tissue was formed in the pretreated group. Sound dermis–fat composite tissue was constructed with sufficient strength, which can potentially be used for actual repair application.     

异种去细胞真皮基质在体内转归的初步研究

目的 初步研究异种（猪）去细胞真皮基质在体内的转归。方法 经曲通（Triton）X-100、胰蛋白酶处理得到异种（猪）去细胞真皮基质后，将其包埋于SD大鼠皮下，于术后1、2、4、6、8、12、16、20和30周观察异种（猪）去细胞真皮基质的大体形态及组织学变化。结果 制备的异种（猪）去细胞真皮基质去细胞成分，胶原纤维排列有序，基底膜结构完整。大体观察异种（猪）去细胞真皮基质原始形态随时间延长而逐渐模糊．组织学观察异种（猪）去细胞真皮基质1周以炎性细胞浸润为主，以后成纤维细胞、毛细血管逐渐增多，真皮胶原排列逐渐规则、致密。结论 异种（猪）去细胞真皮基质可在体内作为支架长期存在，并可诱导自身成纤维细胞及毛细血管有序长入。     

脱细胞异体真皮基质与人脂肪干细胞的生物相容性

背景:脱细胞异体真皮基质具有优良的生物相容性和组织细胞诱导功能.目的:评价人脂肪干细胞与脱细胞异体真皮基质的生物相容性.方法:取健康成年人吸脂术后的脂肪组织分离脂肪干细胞,并行原代与传代培养,传至第3 代,将细胞与脱细胞异体真皮基质联合体外培养3,7 d,倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在支架材料上的黏附、生长及增殖情况,并计算细胞在材料上的黏附率;XTT比色法检测细胞的生长增殖情况.结果与结论:脂肪干细胞在支架材料上分布均匀,24 h内细胞开始伸展、黏附,二三天完全伸展变形,以梭形为主,呈网状排列;随着培养时间延长,支架上的细胞逐渐增多;人脂肪干细胞细胞与脱细胞异体真皮基质混合培养后平均黏附率为95.03%,并保持正常的生长增殖速度,表明支架对细胞具有良好的黏附性;脱细胞异体真皮基质材料与人脂肪干细胞复合后相容性良好.     

Clinical regenerative medicine: the skin

Tissue engineering of skin is classified into acellular artificial skin and cellular artificial skin. Acellular artificial skin or artificial dermis, is composed of an inner collagen sponge and an outer silicone film. When placed on wounds, the collagen sponge is spontaneously converted into a dermis-like connective tissue. Addition of bFGF or cultured fibroblasts accelerates synthesis of the dermis-like tissue. Cultured epidermis often fails to take on a full-thickness skin defect because of lack of dermal component. Cultured skin with both epidermal and dermal components seems to be an ideal skin substitute, but its take rate is still low. Regeneration of complete skin with skin appendages, vascular networks, elastic fibers and so on is desired.     

应用猪主动脉脱细胞基质制备新型组织工程血管支架:生物相容性及力学性能评价

背景:组织工程血管构建的关键依赖于理想的支架.猪血管作为组织工程血管构建材料已有广泛应用,但其较高的免疫原性及较差的力学强度限制了该材料作为组织工程支架的应用.目的:应用猪主动脉脱细胞基质制备一种新的具有良好机械性能及生物相容性的组织工程血管支架.方法:对猪主动脉进行脱细胞处理和热交联改性制备脱细胞血管基质支架,采用苏木精-伊红染色及生物力学分析评估其脱细胞效果及血管基质的力学性能.将人脐静脉血管内皮细胞接种于脱细胞血管基质支架中进行体外培养,评估其生物相容性.结果与结论:用1%的Triton X-100溶液处理猪主动脉84 h可完全脱除血管细胞,同时不破坏血管基质结构;经真空下120 ℃热交联处理12 h,脱细胞基质的拉伸断裂强度得到明显提高,达到1.70 MPa.在该改性血管基质支架上接种人脐带静脉内皮细胞体外培养7 d,扫描电镜显示内皮细胞呈现典型的血管内皮层状结构.表明猪主动脉经过脱细胞处理能够维持血管基质完整,冷冻干燥和真空热交联处理可有效提高其拉伸强度,且对血管内皮细胞具有良好的相容性.     

猪脂肪干细胞与脱细胞真皮基质的生物相容性

背景：脱细胞真皮基质已广泛应用于器官或组织缺损的修补。目的：观察猪脂肪源性干细胞与脱细胞真皮基质的相容性。方法：酶消化法原代培养猪脂肪源性干细胞,利用流式细胞仪和多向诱导分化方法鉴定脂肪干细胞,将其与脱细胞真皮基质共培养。结果与结论：实验成功培养出猪脂肪源性干细胞,流式细胞仪检测结果显示阳性表达CD44和CD105,不表达CD34和CD45;在诱导培养基条件下,可向脂肪细胞、成骨细胞分化。苏木精-伊红染色及扫描电镜发现干细胞能在脱细胞真皮基质表面黏附生长。脂肪源性干细胞与脱细胞真皮基质具有良好的相容性,将两者体外复合培养后,有望将复合物植入体内进行缺损组织、器官的修复。     

表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤促进创面愈合的实验研究

目的探讨表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤促进创面愈合的可行性。方法（1）用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,用Ⅳ型胶原快速黏附法分离、纯化人表皮干细胞,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液等组成人表皮干细胞培养基进行体外培养,测定克隆形成率。（2）将培养人表皮干细胞接种于制备的脱细胞真皮支架中,构建组织工程人工皮肤,移植治疗兔全层皮肤缺损创面,观察创面修复效果。（3）取新西兰白兔常规制作背部全层皮肤缺损创面,随机分为4组：A、B、C组分别用含表皮干细胞的组织工程皮肤、含角质细胞的组织工程皮肤和单纯脱细胞真皮移植于皮肤缺损创面;D组用创面空置为对照。观察创面修复情况、局部炎症反应,并记录创面愈合时间。结果体外培养的人表皮干细胞增殖稳定,克隆形成率明显高于角质细胞对照组（P〈0．05）。移植后A组创面愈合良好,局部炎症反应轻微,无出血、积脓、坏死,创面愈合时间较B、C、D组明显缩短（P〈0．05或P〈0．01）。结论以表皮干细胞作为种子细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤可用于皮肤缺损创面的修复治疗。     

组织工程皮肤的构建及组织形态学观察

背景：应用于临床的组织工程皮肤具有血管化速度慢、力学强度差以及无法永久性保留等局限,因此,需要对相关技术环节进行改进以制备一种合适的永久性皮肤替代物。目的：建立一种构建有活性的双层组织工程皮肤的方法,并对其组织形态学进行观察。方法：以Ⅳ型胶原和成纤维细胞联合修饰的同种脱细胞真皮基质为支架,与表皮干细胞复合后依次经浸没式培养和气液分离界面培养构建组织工程皮肤,利用光镜和扫描电镜对其组织学特点进行观察和分析。结果与结论：以表皮干细胞和同种脱细胞真皮基质制备的组织工程皮肤具有表、真皮双层结构,其中表皮由多层不同分化程度的表皮细胞组成,真皮为天然三维孔隙结构,胶原纤维完整,且表皮层与真皮层紧密连接,形成整体结构,可满足全层皮肤替代物的基本组织学要求。     

应用猪主动脉脱细胞基质制备新型组织工程血管支架：生物相容性及力学性能评价（英文）

背景：组织工程血管构建的关键依赖于理想的支架。猪血管作为组织工程血管构建材料已有广泛应用,但其较高的免疫原性及较差的力学强度限制了该材料作为组织工程支架的应用。目的：应用猪主动脉脱细胞基质制备一种新的具有良好机械性能及生物相容性的组织工程血管支架。方法：对猪主动脉进行脱细胞处理和热交联改性制备脱细胞血管基质支架,采用苏木精-伊红染色及生物力学分析评估其脱细胞效果及血管基质的力学性能。将人脐静脉血管内皮细胞接种于脱细胞血管基质支架中进行体外培养,评估其生物相容性。结果与结论：用1%的TritonX-100溶液处理猪主动脉84h可完全脱除血管细胞,同时不破坏血管基质结构;经真空下120℃热交联处理12h,脱细胞基质的拉伸断裂强度得到明显提高,达到1.70MPa。在该改性血管基质支架上接种人脐带静脉内皮细胞体外培养7d,扫描电镜显示内皮细胞呈现典型的血管内皮层状结构。表明猪主动脉经过脱细胞处理能够维持血管基质完整,冷冻干燥和真空热交联处理可有效提高其拉伸强度,且对血管内皮细胞具有良好的相容性。     

猪脂肪干细胞与脱细胞真皮基质的生物相容性

背景:脱细胞真皮基质已广泛应用于器官或组织缺损的修补。目的:观察猪脂肪源性干细胞与脱细胞真皮基质的相容性。方法:酶消化法原代培养猪脂肪源性干细胞,利用流式细胞仪和多向诱导分化方法鉴定脂肪干细胞,将其与脱细胞真皮基质共培养。结果与结论:实验成功培养出猪脂肪源性干细胞,流式细胞仪检测结果显示阳性表达CD44和CD105,不表达CD34和CD45;在诱导培养基条件下,可向脂肪细胞、成骨细胞分化。苏木精-伊红染色及扫描电镜发现干细胞能在脱细胞真皮基质表面黏附生长。脂肪源性干细胞与脱细胞真皮基质具有良好的相容性,将两者体外复合培养后,有望将复合物植入体内进行缺损组织、器官的修复。