成人骨髓间质干细胞诱导分化为神经元样细胞及其与细胞分裂的关系

目的探讨成人骨髓间质干细胞(hMSC)向神经元样细胞分化过程中分化与细胞分裂的关系。方法从成人骨髓中分离骨髓间质干细胞(MSC),培养扩增。用参芪液诱导MSC分化为神经元样细胞,经免疫组化鉴定其神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。诱导后进行神经元样细胞计数,掺入Brdu测定,计算标记系数。采用双标记间接免疫荧光法检测神经元样细胞特异性表面标记(NSE、NF)与细胞分裂的标记Brdu的关系。抑制DNA合成,计算Brdu、NSE和NF阳性细胞数。结果MSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF阳性,GFAP阴性。MSC诱导分化后的细胞总数增加,诱导分化后12h内细胞增殖较快。30%以上分化的神经元样细胞在表达NSE和NF的同时可见Brdu标记,而另一部分分化的神经元则无Brdu标记。抑制DNA合成,并不会阻止神经元的分化,仍有70%的分化神经元表达神经元特异性标记蛋白NSE。结论MSC诱导分化的部分神经元样细胞可进行细胞分裂,但抑制细胞分裂不影响神经元分化。     

丹参酮诱导间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

神经干细胞的发现和研究,改变了以往神经细胞不可再生的传统观念.目的:研究丹参酮在体外诱导间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的作用.方法:用Ficoll-Paque液将成人骨髓细胞进行密度梯度离心和贴壁筛选分离出MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达和进行细胞周期测定.采用含丹参酮的无血清L-DMEM诱导MSC分化为神经元样细胞,并探讨丹参酮不同浓度对MSC诱导分化为神经元样细胞的影响.以免疫组化方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果:MSC原代可获得(6-8)×105、第5代可获得(2-3)×108个细胞.流式细胞仪检测结果CD29、CD44、CD166表达阳性,CD14、CD34、CD45、HLA-DR为阴性;扩增后的各代MSC表面抗原表达无显著差别;90%以上MSC都处在G0/G1期.丹参酮诱导后,MSC形态上转变为典型的神经元样细胞,免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性.结论:采用的细胞培养条件适于MSC的纯化和扩增,培养细胞为MSC;丹参酮可以在体外诱导MSC分化为神经元样细胞,其诱导转化率与丹参酮的浓度有关.     

天麻诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的：探讨天麻对体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的影响：方法：通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养。中药天麻定向诱导分化为类神经元样细胞光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志物神经原烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)。结果：大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。天麻诱导2h后大部分可分化为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论：大鼠MSC可诱导分化为神经元样细胞。     

丹参素定向诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 研究丹参素体外定向诱导骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)分化为神经元样细胞。方法 利用Ficoll-Paque液将骨髓细胞进行密度梯度离心和贴壁筛选分离出MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达。采用含丹参素的无血清L-DMEM诱导MSC分化为神经元样细胞,并且探讨丹参素不同浓度及不同作用时间对MSC诱导分化为神经元样细胞的影响。以免疫组化方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达、结果 MSC在体外传代扩增后,流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD166表达阳性,CDl4、CD34、CD45、HLA-DR为阴性。丹参素诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出,呈典型的核周体形态,类似神经元;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性。结论 丹参素可以在体外诱导MSC分化为神经元样细胞,其诱导转化率与丹参素浓度和作用时间有关。     

黄芩甙诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的　黄芩甙体外定向诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法　通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞 ,体外扩增培养。中药黄芩甙定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态 ,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇酶 (NSE)、巢蛋白 (Nestin)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。结果　大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。黄芩甙诱导 5h后大部分骨髓间充质干细胞转变为神经元样细胞 ,出现胞体和突起 ,免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性 ,GFAP阴性。结论黄芩甙可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞前后基因表达的研究

目的:探讨成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞前后基因表达的变化.方法:从成人骨髓分离MSC,培养扩增.用参芪液诱导hMSC分化为神经元,并用免疫组化法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达来鉴定是否为神经元样细胞.采用半定量RT-PCR方法检测10个基因(包括内胚层基因Ceruloplasmin;中胚层基因SM 22;外胚层基因Amyloid precursor protein、syntaxin;生殖系基因protamine;神经元特异性基因NeuroD、NF、NSE、GFAP、Tau)在诱导分化前后的变化.结果:hMSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞.免疫组化结果显示诱导出的神经元样细胞表达NSE、NF阳性,GFAP阴性.hMSC在分化前表达内胚层、中胚层、外胚层和生殖系基因,随着分化时间的延长,生殖系基因不表达,内胚层和中胚层基因表达减弱,外胚层基因表达基本不变.而在分化过程中外胚层基因和神经元特异性标记基因表达明显增强.结论:hMSC分化为神经元样细胞的过程并不是简单的神经特异性基因的"开"和"关",而是与神经细胞分化成熟过程中相关基因表达的量相关.     

左归丸对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的影响

目的观察左归丸药物血清对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经样细胞分化的影响。方法采用全骨髓贴壁培养法原代培养、传代培养BMSCs;观察细胞形态,采用免疫细胞化学染色及流式细胞术检测细胞表面CD90、CD29、CD34和CD45表达以鉴定BMSCs;分别使用β-巯基乙醇及左归丸药物血清诱导BMSCs向神经样细胞分化,采用Western blot法检测诱导后神经标志蛋白(Nestin、NSE、GFAP)表达。结果培养至第3代的骨髓间充质干细胞,CD90、CD29表达阳性,CD34和CD45表达阴性;分别经β-巯基乙醇、左归丸药物血清诱导后,BMSCs可见典型的神经元样改变,神经标志蛋白(Nestin、NSE、GFAP)表达均显著增高(P0.05)。结论左归丸药物血清可以诱导大鼠BMSCs分化,且分化细胞具备神经细胞的形态及特征,该研究为临床治疗提供了新思路、新方法;但是诱导过程中的作用机制还不清楚,有待进一步的研究。     

补肾填精法促进骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探讨补肾填精方右归丸含药血清体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的作用.方法:用DMEM/F-12培养液培养Wistar大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs).用右归丸含药血清诱导BMSCs分化后,倒置显微镜观察细胞形态变化;用尼氏染色法观察神经细胞特征性结构;用免疫细胞化学染色法鉴定神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及神经细胞特异性标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE),微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达.结果:诱导6h后,骨髓基质干细胞胞体收缩,有突起伸出;诱导24 h后突起增多形成网络结构;尼氏染色法显示诱导后的细胞胞体中有尼氏体.免疫细胞化学染色示NSE及MAP-2阳性表达,GFAP无表达.结论:右归丸含药血清可以体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞.     

隐丹参酮体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究

目的:探讨隐丹参酮体外诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的实验研究。方法:采用贴壁法分离获得BMSCs,并利用流式细胞术进行鉴定。将获得的第3代BMSCs分为对照组、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)组及隐丹参酮组。Western blot及RT-PCR法检测诱导后巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2 (MAP-2)、微管蛋白(β-tubulinⅢ)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及mRNA表达,MTT法检测细胞增殖情况,western blot检测Wnt/β-catenin信号通路激活情况。结果:与对照组比较,b FGF组及隐丹参酮组Nestin、NSE、MAP-2、β-tubulinⅢ蛋白及mRNA表达量均显著提高(P 0. 01),GFAP蛋白及mRNA表达量降低(P 0. 01),细胞活力升高(P 0. 01),Wnt3a、β-catenin及Cyclin D1表达量上调(P0. 01)。结论:隐丹参酮可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs向神经细胞分化。     

三七总皂苷对人骨髓间充质干细胞诱导分化后神经元样细胞生长状态的影响

目的 研究三七总皂苷（tPNS）与bFGF联合在人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）分化为神经元样细胞过程中的诱导作用及作用剂量.方法 全骨髓贴壁法分离、培养、扩增、纯化hBMSCs,流式细胞仪检测hBMSCs表面CD29、CD44、CD105、CD34分子,测定周期.取第三代hBMSCs,含20%胎牛血清的1 mmol/Lβ-巯基乙醇（BME）预诱导24 h,继而用bFGF（20 ng/mL）标准组、tPNS（1 mg/mL）药物组、20 ng/mL bFGF＋低、中、高剂量tPNS（0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL）诱导液诱导,设立空白对照组.采用免疫细胞化学法鉴定神经细胞特异性抗原标记神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋-2（MAP-2）和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达.MTT法检测各组诱导后不同时间点对神经元样细胞活力的影响.结果 成功分离培养hBMSCs,经诱导后大部分hBMSCs分化为神经元样细胞,联合诱导组细胞生长状态及活力较好,阳性细胞NSE、MAP-2比例高于对照组（P〈0.05）,GFAP表达阴性.结论 tPNS与bFGF联合在体外能有效诱导hBMSCs分化为神经元样细胞,表达神经细胞特异性抗原,保持较好的活力、延长存活时间.     

三七总皂苷在骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞中的调解作用研究

目的:探讨三七总皂苷在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞中的调解作用。方法:①实验材料:成年健康Wister大鼠(雌雄不限),SRF级,体质量(150±30)g;②实验方法:无菌的条件下从大鼠的股骨中分离并继代培养MSCs细胞,当传至第5代时,先用完全培养液[含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]进行预诱导,再更换无血清培养液(含三七总皂苷0.25g/L)进行诱导,采用免疫组织化学SABC法检测神经丝蛋白(NF-M)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白43(GAP-43)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:①采用三七总皂苷诱导后,大多数MSCs呈神经元样细胞分化。经免疫组织化学鉴定,上述细胞表现为NSE、MAP-2和NF染色阳性,呈棕黄色,而GFAP染色阴性。②采用三七总皂苷进行诱导时,MSCs的胞体逐渐增大,并伸出细长的突起,在突起的末端出现分支,有些相邻细胞的突起还成网状连接。③三七总皂苷诱导MSCs转变为类似于神经元样的形态,经免疫组织化学鉴定,大多数细胞表现为NF-M、NSE、nestin、MAP-2和GAP-43染色阳性,并在胞质和突起中有棕黄色的物质,而GFAP染色均为阴性。SABC法显示NSE和MAP-2阳性细胞数分别为(72.64±2.04)%和(73.5±2.17)%。结论:三七总皂苷在体外能使MSCs向神经元样细胞转化,且具有神经元样细胞的特性,这为MSCs治疗相关疾病提供了理论基础。     

地黄多糖对大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞诱导分化作用的研究

目的:探讨地黄多糖体外对大鼠骨髓间充质干细胞( BMSCs)分化为神经样细胞的诱导作用.方法:以大鼠BMSCs为研究对象,采用流式细胞仪检测BMSCs表面标志,MTT法检测细胞生长曲线,当第3代细胞爬片达到80％以上汇合时,分为对照组、化学方法诱导组(5 mmol·L -1,β-mercap toethanol)、脑源性神经生长因子(10 μg·L-1,BDNF)组和地黄多糖组(200 mg·L-1)进行诱导,6h后应用免疫细胞化学染色法检测各实验组神经元巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,RT-PCR检测nestin,NSE,βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)和GFAP mRNA的表达情况.结果:经分离鉴定培养5代以内大鼠BMSCs增殖旺盛、具有较好的细胞活力;免疫细胞化学染色和RT-PCR检测结果显示,对照组不表达神经细胞标志物,各诱导组诱导后有特异性神经细胞标志物表达.其中地黄多糖组Nestin,NSE阳性细胞率分别为( 56.74±1.36)％,(73.37±1.27)％,高于化学诱导组(28.21±2.43)％,(2.31±2.72)％和神经生长因子组(31.3±1.61)％,(28.87±1.65)％,(P＜0.05);GFAP阳性细胞率(20.17±1.27)％低于化学诱导组和神经生长因子组,差异具有统计学意义(P＜0.05);化学诱导组Nestin,NSE和GFAP阳性细胞率与生长因子组比较,差异无统计学意义.结论:地黄多糖具有诱导BMSCs向神经样细胞分化的作用,主要向神经元样细胞方向诱导.     

香丹注射液定向诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元的特点及其影响因素

目的探讨香丹注射液诱导成年SD大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)定向分化为神经元样细胞的特点和影响因素．方法体外培养rMSCs至第5代,培养基中加入碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导24h,更换含不同浓度香丹注射液的诱导液诱导,比较香丹注射液rMSCs分化(诱导率)在不同的培养基组成、诱导剂浓度和接种时的细胞密度等因素的影响,并用台盼蓝染色法、四唑盐比色法(MTT法)评判上述因素对诱导后细胞存活率的影响．结果1％～5％香丹注射液的诱导组,均可诱导rMSCs分化为神经元样细胞,诱导后6～12h诱导率可达(83.5±3．8)％,90％以上的细胞存活时间＞36h。其他条件相同时,香丹注射液3％～5％的浓度组、无血清的D／F12+N2+bFGF诱导组和2．5×10^4／cm^2的细胞接种密度,可得到最高的诱导率和细胞存活率。结论3％～5％的浓度、无血清D／F12+N2+bFGF(10ug／L)和2．5×10^3／cm^2的细胞接种密度是香丹注射液定向诱导rMSCs分化为神经元样细胞的最适条件．     

小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定

目的：建立成年小鼠骨髓间充质干细胞（MSC）的分离和培养方法，并对其表面标志进行鉴定，为其应用提供实验依据。方法：应用体外细胞培养技术将小鼠MSC自股骨、胫骨中分离、纯化和培养，倒置显微镜观察其生长过程，流式细胞仪检测MSC表面抗体的表达。结果：使用全骨髓贴壁分离方法分离、扩增的MSC贴壁后形态较均一，生长良好，细胞表达CD29，CD44，但CD34和CD45表达阴性。结论：可以用全骨髓贴壁法从小鼠骨髓分离培养出MSC，在体外进行有效扩增，为以小鼠为模型研究MSC在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的运用提供实验基础。     

电针血清与丹参注射液对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的：研究电针血清与丹参注射液对骨髓间充质干细胞分化的影响。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养，MSCs用含10％健康大鼠电针血清、10％脑梗塞大鼠血清、10％脑梗塞大鼠电针血清和含10％丹参注射液的L-DMEM诱导MSCs，光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可以通过贴壁法成功分离，并可在体外大量扩增，健康大鼠电针血清、脑梗塞大鼠血清、脑梗塞大鼠电针血清诱导48小时之后未见神经元样细胞出现，免疫细胞化学染色NSE、Nestin阴性。丹参诱导4小时后，大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin染色呈阳性。结论：健康大鼠电针血清、脑梗塞大鼠血清、脑梗塞大鼠电针血清不能诱导MSCs体外分化；丹参注射液可以在体外诱导MSCs分化为神经元样细胞。     

龟板含药血清对骨髓间充质干细胞增殖细胞核抗原表达的影响

目的:观察益肾龟板血清对大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)体外增殖过程的增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen,PCNA)表达的影响。方法:使用密度梯度法分离大鼠骨髓间质干细胞进行培养,经Brdu标记和CD44染色及两者双重染色鉴定后,观察在培养液中添加不同浓度龟板血清条件下MSC增殖过程。用免疫组织化学方法和原位杂交方法检测MSC的PCNA及其mRNA表达;免疫荧光细胞化学法结合激光扫描共聚焦显微镜技术检测PCNA蛋白表达的变化。结果:龟板血清以浓度依赖方式促进MSC的PC-NA及其mRNA表达阳性细胞数和PCNA蛋白表达,与对照组比较有显著性(P<0.05)。结论:龟板血清促MSC增殖作用可能与上调PCNA表达有关。