小鼠Cdc14A基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠pcDNA3.1-MYC-细胞分裂周期14A(Cdc14A)真核表达载体,并观察和验证其在真核细胞中的表达。方法将化学合成的目的基因Cdc14A定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定正确后,采用脂质体法转染HEK293细胞,通过Western blot检测细胞内Cdc14A的表达,并检测Cdc14A基因序列。结果 pcDNA3.1-MYC-Cdc14A真核表达载体构建成功,将其转染HEK293细胞48h,提取细胞蛋白,采用Western blot检测到细胞内Cdc14A的表达,并且测序结果与预期结果一致。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-MYC-Cdc14A,为研究Cdc14A在小鼠一细胞期受精卵G2/M期转换中的作用奠定了基础。     

肌腱愈合及粘连形成机制的研究:胰岛素样生长因子1基因真核表达载体的构建及表达

目的:探讨真核表达载体介导外源性胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染肌腱细胞的可能性。方法:组织块法培养原代肌腱细胞,体外重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1,并以脂多胺DOGS为介导转染培养的肌腱细胞,反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测IGF-1mRNA的表达,ELISA法检测IGF-1活性蛋白表达。结果:成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1;RT-PCR检测显示转染后的肌腱细胞成功表达IGF-1mRNA;ELISA结果显示转染组IGF-1蛋白表达较对照组明显增高(t=-2.873,P<0.05)。结论:重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1能够将IGF-1cDNA成功导入肌腱细胞并表达。     

小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的：构建小鼠Atrogin-1基因真核表达载体,研究其功能,并探讨其在癌性恶液质骨骼肌萎缩中的作用机制。方法：提取小鼠C2C12细胞RNA,反转成cDNA,PCR合成含有酶切位点的Atrogin-1 cDNA全长,酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,经鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列正确,然后用其转染293T细胞,Western blot法检测Atrogin-1蛋白的表达。结果：pcDNA3.1-Atrogin-1含大小、序列正确的Atrogin-1cDNA片段,转染pcDNA3.1-Atrogin-1的293T细胞裂解液中能检测到Atrogin-1蛋白高表达。结论：成功构建了Atrogin-1基因真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,并在真核细胞中表达了目的蛋白,其是研究癌性恶液质的重要工具。     

大鼠Delta1基因真核表达载体的构建与鉴定

背景:最近有数据表明,Notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受.推测Notch/Notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用.目的:构建大鼠Deltal基因(Notch配体)真核表达载体,并观察其在树突状细胞中的表达.方法:应用RT-PCR方法从大鼠骨髓细胞中获得全长Delta1基因片段,并将此基因片段构建在pcDNA3.1(+)真核表达载体上.利用脂质体基因转染技术将含大鼠Delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1转染入树突状细胞中,观察Delta1基因在树突状细胞中的表达.结果与结论:双酶切鉴定结果显示,Delta1已成功构建在pcDNA3.1的Hindlll和Xbal双酶切位点之间,任选一个酶切阳性克隆pcDNA3.1/Deltal送上海生工生物公司进行序列测定,测序结果与Genebank中Delta1基因序列完全一致,阅读框正确.转染Delta1基因的树突状细胞形态与其亲本细胞类似,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Deltal的表达显著增高.实验成功利用基因转染方法将Delta1基因导入树突状细胞,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1,并使之高效表达并分泌Delta1蛋白.     

真核过表达载体共转染3个胰岛发育关键基因在小鼠胎肝细胞内的表达

背景:大量文献表明,向肝脏细胞引入一个多个胰岛发育的关键因子(如Pdx1、MafA及Ngn3)可以使肝细胞向胰岛细胞的方向进行转化。目的:构建以pcDNA3.1(+)为骨架的质粒载体并共同转染胰十二指肠同源框蛋白(Pdx1)、神经源素3(Ngn3)及V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(MafA)至小鼠胎肝细胞并检测其表达情况。方法:以基因组或小鼠胰腺cDNA为模板扩增Pdx1、MafA及Ngn3三个目的基因,应用分子生物学技术,将3个目的片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点中,构建小鼠系列真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafAORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3ORF通过Lipofectamine2000介导的脂质体转染小鼠胎肝细胞系BNLCL.2,用反转录PCR以及间接免疫荧光法检测3个目的基因的表达情况。结果与结论:目的基因克隆正确,反转录PCR,间接免疫荧光法证实了脂质体转染后小鼠胎肝细胞中有Pdx1、Ngn3以及MafA的表达。结果表明,真核过表达载体pcDNA3.1(+)-MafAORF,pcDNA3.1(+)-Pdx-1ORF,pcDNA3.1(+)-Ngn3ORF可成功构建,并能够将Pdx1、Ngn3以及MafA三个基因转至小鼠胎肝细胞进行表达。     

重组VEGF165在哺乳动物细胞中表达及其生物学活性

目的构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-血管内皮生长因子(VEGF)165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的表达,对目的蛋白进行鉴定和生物学活性分析。方法分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至哺乳动物细胞NIH 3T3并进行抗生素压力筛选,采用双抗夹心ELISA、SDS-PAGE和免疫印迹方法对目的蛋白在转染细胞中的特异表达进行鉴定,在血管内皮细胞ECV304上对表达产物的细胞结合活性和促增殖活性进行分析。结果构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165成功转染NIH3T3,获得加压筛选的重组细胞,目的基因得到稳定表达,目的蛋白能与血管内皮细胞ECV304特异结合,并具有促内皮细胞增殖活性。结论应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH 3T3细胞可稳定表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白。     

S100A4基因载体的构建及其在人胃癌细胞系中的表达

目的 克隆S100A4 cDNA,构建pcDNA3.1-S100A4重组表达载体,转染胃癌细胞系MKN1,观察S100A4在胃癌细胞中的表达情况。方法 Trizol法提取人胃上皮细胞GES-1的总RNA,逆转录反应获得含S100A4基因的cDNA。聚合酶链反应GenBank获得S100A4基因序列,并设计引物,利用聚合酶链反应(PCR)扩增出分子量为327 bp的产物。构建pMD18-T simple-S100A4重组质粒,转化JM109菌。菌液测序成功后,提取质粒,进行BamHⅠ/HindⅢ双酶切,酶切产物回收纯化,连接表达载体pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-S100A4真核表达载体。利用脂质体介导转染方法将纯化的表达载体转染到胃癌细胞系MKN1中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后MKN1细胞中S100A4 mRNA表达水平。结果 PCR产物连接克隆载体的测序结果与GenBank公布的无突变序列一致,HindⅢ/BamHⅠ双酶切可以成功构建真核表达载体pcDNA3.1-S100A4;在胃癌细胞系MKN1中转染pcDNA3.1-S100A4表达载体,以转染pcD...     

人上皮细胞黏附分子的真核表达及鉴定

目的构建人上皮细胞黏附分子(EpCAM)全基因的真核表达质粒,研究其在HepG2细胞中的表达。方法将EpCAM基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-EpCAM,转染人肝癌HepG2细胞。通过免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测对转染后细胞内EpCAM蛋白的表达进行鉴定。结果双酶切鉴定结果表明重组质粒构建成功。免疫荧光、Western Blotting及流式细胞检测结果一致表明,转染后EpCAM基因在HepG2细胞中表达成功。结论成功构建了人EpCAM的真核表达载体,并在HepG2细胞中表达,为研究高表达人EpCAM的肝癌细胞的功能打下基础。     

HSV-TK单基因及其与hIL-12融合基因表达载体的构建

目的构建HSV-TK单基因和TK/hIL12融合基因的真核表达载体。方法 PCR扩增质粒pGT60-hIL12中HSV-TK与hIL12治疗基因片段,同时引入pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点,构建HSV-TK单基因及其与hIL12融合基因的真核表达载体。结果 DNA测序分析、限制性双酶切鉴定证实构建的真核表达载体中治疗基因的序列、大小和方向正确。结论成功构建了pcDNA3.1-TK和pcDNA3.1-TK/hIL12真核表达载体,为进一步探索HSV-TK与hIL12基因的协同抗瘤作用提供实验基础。     

HBV preS2真核载体的构建及其表达

【目的】扩增乙型肝炎病毒（HBV）前S2基因（preS2）,并构建其真核表达载体,为研究HBV树突状细胞疫苗奠定实验基础。【方法】从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBVDNA,用聚合酶链反应技术扩增全长preS2基因,将其克隆到真核载体pcDNA3．1（＋）上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定筛选阳性克隆,构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）preS2,并将其转染巨噬细胞48h后,ELISA检测细胞裂解液中preS2的表达。【结果】从慢性乙型肝炎患者血清抽提的DNA中扩增得到约860bp大小的目的片段,preS2基因片段正确插入pcDNA3．1（＋）载体,得到HBVpreS2真核表达载体pcDNA3．1（＋）-pre2。【结论】成功地构建了舍preS2基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-preS2,并能在巨噬细胞中表达目的蛋白HBVpreS2。     

HLA-E真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达与鉴定

本研究旨在亚克隆HLA-E真核表达载体，并使其在HLA-I类阴性的靶细胞K562细胞上获得稳定表达。首先采用PcR方法从多顺反子表达载体(pG/A2E)扩增出目的片段A2／ E cDNA，与真核表达载体pcDNA3．1( )重组，构建成HLA—E真核表达载体pcDNA3．1( )／A2E，然后采用脂质体转染的方法将重组质粒转入K562细胞，最后经G418筛选及有限稀释，利用抗HLA-E特异的单克隆抗体K0126-3进行FACS检测，以观察HLA—E分子在靶细胞表面的表达情况。结果显示，HLA-E分子在经pcDNA3．1( )／A2E转染的靶细胞表面获得表达(27．76％)，而经空载体pcDNA3．1( )转染的靶细胞则未获得表达。结论：成功构建了pcDNA3．1( )／A2E真核表达载体，并使HLA-E分子在HLA-I类阴性的K562细胞表面表达，为进一步研究HLA-E作用的分子机制以及探索HLA-E与NK受体之间的相互作用和HLA-E体外表达对NK细胞功能的影响奠定了基础。     

pcDNA3.1-bFGF真核表达载体的构建及其在犬骨髓基质干细胞中的表达

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs)后的表达情况,并进一步研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法:提取国人脑胶质瘤细胞BT325总RNA,RT-PCR法扩增bFGF cDNA片段,构建重组载体pcDNA3.1-bFGF,重组载体经脂质体介导转染犬BMSCs,半定量RT-PCR及Western blot检测表达。结果:重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。bFGF在犬BMSCs中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-bFGF,此重组载体在犬BMSCs中能够表达。     

有利于创伤修复愈合的人血管内皮细胞生长因子真核表达质粒的构建

目的构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的真核表达质粒pcDNA3-VEGF.方法采用PCR技术和DNA重组技术,将编码人VEGF的cDNA序列克隆至表达载体pcDNA3.1(+)上,挑取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序.结果从HepG2细胞中克隆出VEGF121基因的cDNA片段,该序列由Kozak序列,翻译起始密码子ATG,信号序列,编码序列和终止密码子等部分组成.DNA测序表明,VEGF121基因的cDNA序列正向插入到pcDNA3.1(+)的多克隆位点上.结论本研究获得了VEGF121基因的真核达质粒pcDNA3-VEGF,为进一步研究VEGF的转基因治疗奠定基础.     

LIF真核表达载体的构建及其在MSCs中的稳定表达

目的在人骨髓间充质干细胞内大量稳定的表达人白血病抑制因子（human Leukemia Inhibitory Factor,hLIF）。方法应用RT-PCR方法从人蜕膜组织中扩增出白血病抑制因子,并将其构建于pcDNA3．1真核表达载体上。利用脂质体进行基因骨髓间充质干细胞的转染。利用G418进行基因的稳定表达筛选。通过RT-PCR和Westernblot方法进行基因表达的检测。结果成功扩增出人白血病抑制因子基因,成功构建hLIF-pcDNA3．1真核表达载体。转染LIF-pcDNA3．1的骨髓间充质干细胞经G418筛选,存活十代以上。经RT-PCR及Westernblot方法检测发现转染LIF-pcDNA3．1的骨髓间充质干细胞表达白血病抑制因子明显高于未转染的骨髓间充质干细胞。结论成功构建LIF-pcDNA3．1的真核表达载体并使其在骨髓间充质干细胞得到稳定表达。     

丙肝核心抗原-CD40L胞外段真核表达载体的构建及其免疫原性分析

目的构建丙肝核心抗原-CD40L胞外段融合蛋白真核表达载体,并探讨其免疫原性。方法应用基因重组技术在原有载体的基础上构建真核表达载体pcDNA3.1-core-CD40L并加以鉴定。该表达质粒肌肉内注射免疫小鼠,ELISA法检测小鼠外周血中抗丙肝核心抗体,流式细胞仪检测小鼠外周血T淋巴细胞亚型,real time PCR法检测外周血单个核细胞内细胞因子,CTL杀伤实验检测小鼠脾淋巴细胞的杀伤活性。结果构建了真核表达载体pcD-NA3.1-core-CD40L,该载体能诱发小鼠产生高滴度的抗丙肝核心抗原的抗体,流式和real time结果证实该质粒能诱使小鼠T淋巴细胞由T0期向Th1和Th2转换,并以Th1为主,CTL杀伤结果显示该表达质粒能诱使小鼠产生高水平的细胞杀伤能力。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-core-CD40L,该质粒能够在小鼠体内正确表达,并能诱发高水平的细胞杀伤活性。     

NLRC3真核表达载体的构建及转染

目的构建含基因NLRC3的重组真核载体pcDNA3.1/myc-hisA-NLRC3。方法利用基因重组技术将NLRC3基因插入到真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisA中,经酶切,PCR,测序及Western确定重组体质粒构建成功并转染。结果重组真核载体pcDNA3.1/myc-hisA-NLRC3构建成功。并将重组体转染至hUMSC细胞中并进行单克隆筛选扩增。结论重组真核载体pcDNA3.1/myc-hisA-NLRC3构建成功,并成功转染到hUMSC中,为下一步研究NLRC3的转染研究奠定基础。