真核表达载体pcDNA3.1/VEGF-B-EGFP的构建及在骨髓间质干细胞中的表达

目的探讨血管内皮细胞生长因子B（vascular endothelial cell growth factor-B,VEGF-B）转染人骨髓间质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）的表达情况。方法将VEGF-B及编码增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid,cDNA）序列通过扩增、酶切、插入pcDNA 3.1质粒的多克隆位点,构建pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP真核表达质粒,应用脂质体介导的基因转染技术,将基因导入MSCs（pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP转染组）;应用荧光显微镜观察EGFP的表达情况;流式细胞仪检测转染效率;逆转录-聚合酶链反应、蛋白印迹法检测VEGF-B的表达情况。结果 pcDNA 3.1/VEGF-B-EGFP转染组重组质粒转染MSCs 24h后,荧光显微镜下可见强绿色荧光,流式细胞仪检测转染效率约为15%;RT-PCR检测结果显示,MSCs出现590bp目的基因;Western blot检测显示,在转染后MSCs中有VEGF-B表达。结论构建的VEGF-B真核表达质粒成功转染MSCs,为联合应用MSCs细胞移植和VEGF-B基因治疗心肌缺血的研究奠定了基础。     

构建pcDNA3.1/Hygro(+)-Lefty A真核表达载体及Lefty A的稳定表达细胞系

背景:Leffy基因可能通过拮抗转化生长因子β1,信号通路发挥抗肾纤维化作用.目的:为验证其抗纤维化作用,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-LeffyA真核表达载体,并建立LeftyA稳定表达细胞系.设计、时间及地点:基因克隆构建,单一样本观察,于2008-04/07在武汉大学人民医院中心实验室完成.材料:人肾小管上皮细胞株购于中国协和医科大学细胞库;真核表达载体pcDNA3.1/Hygro(+)由美国纽约州石溪大学SiamakTabibzadeh教授惠赠;Leffy A克隆载体pCMV-SPORT6购自武汉晶赛公司.方法:以pCMV-SPORT6为模板经PCR反应获得Leffy A编码区DNA,将其插入pcDNA3.1/Hygro(+)中构建Leffy A真核表达载体;通过LipofectamineTM2000将此重组质粒转染入人肾小管上皮细胞中,通过Hygromycin筛选挑取阳性表达克隆从而构建Leffy A稳定表达细胞系.主要观察指标:PCR扩增产物电泳鉴定结果.重组质粒的酶切鉴定结果.重组质粒基因测序结果.Leffy A稳定表达细胞系的筛选及其细胞内Leffy A mRNA表达.结果:pCMV-SPORT6经针对人Leffy A基因编码区序列的上下游引物PCR扩增后,10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,在10 kb条带处出现稍大于1.0 kb的特异性扩增条带,与预期1.1 kb目的片段大小相符.重组质粒分别被Hind Ⅲ、BamH Ⅰ单酶切后所得片段大小一致,均为6.7 kb,与重组质粒理论大小一致;经双酶切后得到大小分别为5.6 kb和1.1 kb的2条片段,与pcDNA3.1/Hygro(+)及Leffy A片段大小相符.将酶切鉴定阳性重组质粒测序,对测序结果进行生物信息学分析,发现与人Leffy A基因编码区序列完全一致.稳定转染Leffy A重组质粒的人肾小管上皮细胞高表达Leffy A mRNA.结论:pcDNA3.1/Hygro(+)-Leffy A真核表达载体构建成功,并建立了Lefty A稳定表达细胞系.     

人B7．1真核表达载体的构建、鉴定及其在白血病细胞上表达的实验研究

本研究构建包含人B7．1cDNA的重组真核表达载体pDisplay-hB7．1并鉴定,实现其在白血病细胞株HL-60细胞上的表达,获得HL60-hB7．1。应用分子克隆、PCR法扩增人B7．1基因片段,采用ApaⅠ、Sall分别双酶切PCR产物和表达载体pHook,纯化后的酶切产物由T4DNA连接酶连接,转导大肠杆菌DI-15et;应用ApaⅠ、SalⅠ双酶切和DNA序列分析技术进一步鉴定阳性克隆pDisplay-hB7．1,应用脂质体转化技术将B7．1转染HL-60细胞,同一标本分别采用直接免疫荧光法、SABC法及FACS法鉴定hB7．1在HL-60细胞上的表达,阳性细胞命名为HL60．hB7．1。结果表明,PCR法扩增出约620bp的基因片段;连接产物转导感受态细胞后,共筛选出5个阳性克隆,均可经ApaⅠ、SalⅠ双酶切出大小约620bp的基因片段,与人B7．1基因片段大小相符,提示重组载体构建成功。进一步DNA序列分析证明人B7．1基因序列和读码框架正确,与文献报道人B7．1cDNA序列一致,无基因突变。直接免疫荧光法鉴定表明,HL60-hB7．1阳性细胞数为70％,SABC法鉴定为65％,FACS法鉴定为92．7％。经以上鉴定证实hB7．1cDNA已成功转染HL-60细胞株并在其膜上高效表达,获得了HL60-hB7．1。结论：应用分子克隆方法可成功构建人B7．1（CD80）重组真核表达载体,并稳定、高效表达B7．1-于HL-60细胞胞膜上,推测应用这种方案制备的瘤苗可能具有免疫治疗和免疫保护作用。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

小鼠SRY同源盒基因SOX1的克隆及其真核表达载体pEGFP-C3-SOX1的构建

目的:克隆小鼠SRY同源盒基因SOX1的全长cDNA,构建其携带增强型荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-C3-SOX1,为进一步研究SOX1在间充质干细胞神经分化中的作用奠定基础。方法:采用RT-PCR方法从小鼠早期胚胎中扩增带有EcoRⅠ和HindⅢ双酶切位点的SOX1 cDNA片断,与pGEM-T载体连接后转化感受态细菌JM109,然后通过蓝白筛选、酶切技术筛选、鉴定出阳性菌落并进行DNA测序。用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切获得目的片断,再与EcoRⅠ和HindⅢ双酶切过的pEGFP-C3质粒相连接,重组子转化JM109感受态大肠杆菌,酶切方法鉴定阳性菌落。结果:多酶切及DNA测序结果表明提取及纯化的pEGFP-C3-SOX1质粒含有SOX1 cDNA碱基片段,方向及大小正确。结论:从小鼠胚胎中可成功克隆SOX1全长cDNA,并构建其真核表达载体pEGFP-C3-SOX1。     

pcDNA3.1-flag-pygo2真核表达载体的构建及在C6细胞中的表达

目的构建pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并在C6细胞中进行表达。方法从小鼠脑胶质细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成CDNA，设计引物，调取目的片段，与pcDNA3．1-flag载体连接后转化大肠杆菌DH5α，LB平板筛选菌落，提取质粒。重组质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经过酶切鉴定及测序后，阳离子脂质体法转染C6细胞并经免疫细胞化学染色及蛋白印迹检测重组体的表达。结果重构质粒pcDNA3．1-flag-pygo2经限制性核酸内切酶EcoRⅠ，HindⅢ酶切分析及测序检查，表明真核表达载体构建正确；瞬时转染C6细胞后，免疫细胞荧光染色及蛋白印迹检测表明转染细胞能够表达外源Pygo2基因。结论成功构建了pcDNA3．1-flag-pygo2真核表达载体并能够在真核细胞中进行表达，这为今后研究pygo2基因在胶质瘤中的作用机制奠定了基础。     

真核表达载体pcDNA3-CTLA41g的构建及体内表达

背景:CTLA-41g的制备过程比较复杂,单克隆抗体的价格比较昂贵,而且应用CTLA-41g单克隆抗体注射本身存在着血浆药物浓度不稳定的问题.目的:探讨Ctla41g表达质粒构建的可行性.设计、时间及地点:基因水平观察实验,于2005/2006在中国医科大学中心实验室完成.材料:雄性Wistar大鼠10只,近交系昆明小鼠10只.方法:提取Wistar大鼠总RNA,反转录成cDNA第1链,PCR扩增CTLA4基因,将其和真核表达载体pcDNA3酶切、连接.转化感受态菌DH5α,培养后挑取刚性克隆、提取质粒,酶切鉴定重组子、测序,最后转染近交系昆明小鼠,应用Westen Blot法检测血清CTLA41g水平.主要观察指标:构建的Ctla41g表达质粒基因序是否正确以及能否在小鼠体内进行蛋白表达.结果:对含有pcDNA3-CTLA4质粒的LB菌液进行鉴定测序,目的基因片断大小为288 bp,与Genebank上公布的CTLA4序列完全一致,质粒构建正确.利用阳性脂质体载体包被pcDNA3一CTLA41g转染小鼠,有3只在第7天血清检测CTLA41g阳性,显示pcDNA3-CTLA41g能够在鼠肌细胞内表达.结论:利用基因合成和重组技术成功构建了真核表达载体pcDNA3-CTLA41g,利用脂质体法成功的将pcDNA3-CTLA41g转染到鼠肌细胞内并进行表达.     

EBV-LMP1 cDNA克隆与真核表达载体的构建及体外表达

目的：从鼻咽癌组织中克隆EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）cDNA,构建真核表达质粒pIRES-LMP1,并检测其在体外的表达。方法：利用分子生物学技术,提取鼻咽癌总RNA,逆转录PCR获得LMP1 cDAN,克隆人pDrive Cloning Vector并测序,利用引物上设计的酶切位点Nhel和EcoRI将LMP1插入真核表达质粒pIRES中,测定序列后,用脂质体包裹转梁COS细胞,采用RT-PCR和Westrn blot 检测LMP1的表达。结果：扩增的LMP1 cDNA为1301bp,核酸序列测定证实本实验所构建的质粒正确,该表达质粒在体外转梁COS细胞后可表达LMP1分子。结论：实验所构建的pIRES-LMP1表达质粒能在体外表达LMP1分子。     

NLRC3真核表达载体的构建及转染

目的构建含基因NLRC3的重组真核载体pcDNA3.1/myc-hisA-NLRC3。方法利用基因重组技术将NLRC3基因插入到真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisA中,经酶切,PCR,测序及Western确定重组体质粒构建成功并转染。结果重组真核载体pcDNA3.1/myc-hisA-NLRC3构建成功。并将重组体转染至hUMSC细胞中并进行单克隆筛选扩增。结论重组真核载体pcDNA3.1/myc-hisA-NLRC3构建成功,并成功转染到hUMSC中,为下一步研究NLRC3的转染研究奠定基础。     

多发性骨髓瘤黏蛋白-1基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

本研究旨在构建多发性骨髓瘤黏蛋白1（两串联）基因（rnuc1-2vntr）的真核表达载体及该重组体在COS-7细胞中的表达,为研制多发性骨髓瘤基因疫苗奠定基础。以MUC1—2VNTR蛋白的编码基因作为目的基因,在其前端加上KOZAK序列后,两端分别加上HindⅢ和XbaⅠ酶的酶切位点,将人工合成的全基因定向插入pcDNA3．1／myc—his B载体中,转化E-coli感受态细胞获得重组菌株,经酶切及测序鉴定为pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒后,采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS-7细胞,用荧光显微镜对荧光表达进行观察,然后用Western blot检测重纽体在细胞内外的表达。结果表明：合成的MUC1-2VNTR基因全长约140bp,所构建的pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒经双酶切及测序鉴定后,与预期片段大小相符,并含有完整的阅读框架和目的基因。将其转入COS-7细胞后48小时,荧光显微镜和Western blot检测均可证实黏蛋白1表达。结论：成功的构建了多发性骨髓瘤真核表达载体pcDNA3．1—2vntr／myc—hisB,并在COS-7细胞中成功地表达黏蛋白1,这为黏蛋白1的功能研究和多发性骨髓瘤基因疫苗的研制提供了实验基础。     

小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的：构建小鼠Atrogin-1基因真核表达载体,研究其功能,并探讨其在癌性恶液质骨骼肌萎缩中的作用机制。方法：提取小鼠C2C12细胞RNA,反转成cDNA,PCR合成含有酶切位点的Atrogin-1 cDNA全长,酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,经鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列正确,然后用其转染293T细胞,Western blot法检测Atrogin-1蛋白的表达。结果：pcDNA3.1-Atrogin-1含大小、序列正确的Atrogin-1cDNA片段,转染pcDNA3.1-Atrogin-1的293T细胞裂解液中能检测到Atrogin-1蛋白高表达。结论：成功构建了Atrogin-1基因真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,并在真核细胞中表达了目的蛋白,其是研究癌性恶液质的重要工具。     

HLA-E真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达与鉴定

本研究旨在亚克隆HLA-E真核表达载体，并使其在HLA-I类阴性的靶细胞K562细胞上获得稳定表达。首先采用PcR方法从多顺反子表达载体(pG/A2E)扩增出目的片段A2／ E cDNA，与真核表达载体pcDNA3．1( )重组，构建成HLA—E真核表达载体pcDNA3．1( )／A2E，然后采用脂质体转染的方法将重组质粒转入K562细胞，最后经G418筛选及有限稀释，利用抗HLA-E特异的单克隆抗体K0126-3进行FACS检测，以观察HLA—E分子在靶细胞表面的表达情况。结果显示，HLA-E分子在经pcDNA3．1( )／A2E转染的靶细胞表面获得表达(27．76％)，而经空载体pcDNA3．1( )转染的靶细胞则未获得表达。结论：成功构建了pcDNA3．1( )／A2E真核表达载体，并使HLA-E分子在HLA-I类阴性的K562细胞表面表达，为进一步研究HLA-E作用的分子机制以及探索HLA-E与NK受体之间的相互作用和HLA-E体外表达对NK细胞功能的影响奠定了基础。     

LIF真核表达载体的构建及其在MSCs中的稳定表达

目的在人骨髓间充质干细胞内大量稳定的表达人白血病抑制因子（human Leukemia Inhibitory Factor,hLIF）。方法应用RT-PCR方法从人蜕膜组织中扩增出白血病抑制因子,并将其构建于pcDNA3．1真核表达载体上。利用脂质体进行基因骨髓间充质干细胞的转染。利用G418进行基因的稳定表达筛选。通过RT-PCR和Westernblot方法进行基因表达的检测。结果成功扩增出人白血病抑制因子基因,成功构建hLIF-pcDNA3．1真核表达载体。转染LIF-pcDNA3．1的骨髓间充质干细胞经G418筛选,存活十代以上。经RT-PCR及Westernblot方法检测发现转染LIF-pcDNA3．1的骨髓间充质干细胞表达白血病抑制因子明显高于未转染的骨髓间充质干细胞。结论成功构建LIF-pcDNA3．1的真核表达载体并使其在骨髓间充质干细胞得到稳定表达。     

人Seipin基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建人Seipin基因的真核表达质粒并转染293T细胞后进行鉴定。方法采用PCR法从人睾丸组织中扩增人Seipin基因,通过BamHI/XhoI限制性酶切位点克隆入真核表达载体pEGFP-C1内,构建含人Seipin基因的真核表达质粒pEGFP-Seipin。运用真核转染、Western blot和免疫荧光实验的方法,鉴定Seipin在真核细胞293T中的表达。结果克隆的人Seipin基因,测序结果显示完全正确。瞬时转染真核细胞293T后,采用Western blot在预期的位置检测出目的条带,免疫荧光实验显示293T细胞中存在人Seipin基因的表达。结论成功构建了含人Seipin基因的真核表达质粒。     

FRAT1基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建FRAT1siRNA真核干涉表达载体pSINsi-FRAT1,并测序鉴定证实克隆正确。方法设计以FRAT1基因为靶标的RNAi序列和阴性对照片段序列,并克隆入载体pSINsi-hU6,用基因测序进行重组克隆验证。结果PCR检测证实siRNA插人pSINsi-hU6质粒,测序分析证实插入序列正确。结论成功构建FRAT1基因的RNAi载体,为研究FRAT1基因对结肠癌细胞增殖凋亡侵袭的影响提供了稳定转染的RNA干扰质粒。     

靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

本研究构建并鉴定靶向mdr-1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体。根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BamHI和HindⅢ双酶切线性化的pGCsilencer人U6启动子质粒载体中;为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染的方法将构建好的3个重组载体(pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3)导入慢性髓系白血病耐药细胞株K562/A02,采用实时PCR方法检测转染细胞的mdr-1基因表达,Western-blot检测P-gp表达量的变化。结果表明:应用PCR电泳图谱和测序证实了克隆RNAi打靶序列完全正确,而且该载体又同时表达GFP标记基因,用于测定转染效率。分别转染pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3后K562/A02细胞的mdr-1基因表达和P-gp表达水平下降,证明shRNA可以特异性沉默mdr-1基因。结论:靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体构建成功,为进一步研究mdr-1基因在K562/A02细胞中的作用奠定了实验基础。     

凝血因子Ⅸ无义突变真核表达载体的构建及其在COS-7细胞的表达

本研究以含有fⅨcDNA的pcDNA3．1质粒为模板构建4种包含不同类型无义突变的fⅨ真核表达载体并进行鉴定,实现其在COS一7细胞中的表达。采用以PCR为基础的定点突变法体外构建fⅨ基因无义突变体,并通过DNA序列分析进一步鉴定证实;应用脂质体转化技术将野生型、突变型fⅨ表达载体分别瞬时转染COS-7细胞,采用实时定量PCR鉴定fⅨmRNA在各组的相对表达水平。结果表明,4个突变型质粒除相应位点的无义突变外,未见其它突变,提示无义突变载体构建成功。实时定量PCR鉴定表明,各突变组真核表达载体已成功转染COS-7细胞株并能转录为mRNA。结论：采用以PCR为基础的定点突变法可在体外构建fⅨ真核表达载体,并可在COS-7细胞中表达,其转录过程中不引发mRNA降解,这为进一步研究无义突变引起FIX功能丧失及表达量降低的机制和治疗研究提供了物质基础。