大鼠骨髓间充质干细胞体外向肠神经细胞分化及胶质细胞源神经营养因子表达的变化

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞向肠神经分化的条件及胶质细胞源神经营养因子(glial cellline-derived neurotrophic factor,GDNF)及其受体RET基因表达的变化.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),传至第四代,进行诱导分化.以10ng/ml GDNF和10%FBS的稀释胎肠培养基(fetal gut culture medium,FCCM)以及仅含有10 ng/ml GDNF的L-DMEM诱导7 d,对照组为含10%FBS的L-DMEM完全培养液,免疫组化的方法鉴定细胞的神经特异性烯醇化酶(neural specific enolase,NSE)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)及一氧化氮合酶(nit ric oxide synthase,nNOS)的表达.RT-PCR检测GDNF及RET mRNA的变化,Westem Blot方法检测GDNF蛋白的表达情况.结果 BMSCs能在体外成功培养及纯化,诱导7 d后,实验组均可见NSE、VIP及nNOS的表达,两实验组的阳性率有统计学差异,而对照组为阴性.RT-PCR检测示,BMSCs向肠神经细胞诱导后,GDNF表达显著增强,并促使RET基因表达Western Blot结果提示,诱导后的细胞GDNF在蛋白水平上表达增强.结论 GDNF联合FCCM可诱导BMSCs分化为肠神经细胞,在向神经细胞分化的过程中,能促进GDNF表达的增强,并促使RET基因的表达,GDNF-RET信号通路在肠神经分化过程中可能发挥着重要作用.     

胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素-3双基因转染大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经样细胞的研究

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和神经营养素3(NT-3)双基因修饰诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞的可行性以及GDNF和NT-3的表达变化.方法 全骨髓法分离培养BMSCs,流式细胞术检测BMSCs标志CD90和造血干细胞标志CD45.转染带荧光的GDNF和NT-3基因,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及细胞形态变化;免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和神经胶质酸性蛋白(GFAP)表达;Western blot 检测细胞中GDNF及NT-3蛋白表达.对照组为未转染GDNF和NT-3基因的BMSCs.结果 BMSCs能在体外成功分离培养,细胞高表达CD90(92.7%),不表达CD45.诱导分化后,BMSCs胞体变圆,伸出明显突起,并可见多数细胞相互交织成网状结构,呈神经细胞样形态.免疫荧光标记检测可见实验组细胞表达NSE和NF,而不表达GFAP.而对照组阴性.Western blot检测可见细胞GDNF及NT-3蛋白表达增强.结论 GDNF和NT-3双基因修饰诱导的BMSCs可分化为神经样细胞并表达神经元的标志,为基因治疗神经系统疾病如先天性巨结肠提供实验基础.     

大鼠骨髓间充质干细胞去血清培养后钙激活中性蛋白酶10基因转录变化

目的检测血清剥夺是否诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）凋亡,探讨钙激活中性蛋白酶-10（Calpain-10）是否参与血清剥夺诱导的大鼠BMSCs凋亡。方法原代培养的大鼠BMSCs,流式细胞术鉴定细胞表型,去血清培养,应用PI/Annexin-V双染法流式细胞仪计数0、24、48h凋亡细胞的比例,应用荧光定量PCR测定血清剥夺24h诱导凋亡的Calpain-10基因mRNA水平。结果流式细胞术鉴定细胞发现CD29、CD44、CD105表达阳性,CD45、CD14、CD34表达阴性,符合BMSCs特点;血清剥夺后24h早期凋亡细胞比例最高。荧光定量PCR结果示与正常对照组比较血清剥夺诱导凋亡24h Calpain-10基因mRNA水平显著上调（2-ΔΔCT=22.433）。结论血清剥夺可诱导大鼠BMSCs凋亡,并上调Calpain-10基因mRNA水平,Calpain-10可能参与血清剥夺诱导的大鼠BMSCs凋亡。     

慢病毒介导CX43基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞体系的建立及鉴定

目的建立慢病毒介导间隙连接蛋白43(CX43)基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体系并进行鉴定,为研究CX43过表达BMSCs在移植物抗宿主病中的作用奠定实验基础。方法采用全骨髓贴壁分离培养法获取小鼠BMSCs,流式细胞术检测细胞表面标志和成骨、成脂、成内皮细胞诱导分化能力;重组慢病毒载体pHBLV~(TM)-CX43-GFP、pHBLV~(TM)-GFP转染BMSCs,未转染慢病毒的BMSCs为空白对照,应用细胞免疫荧光、免疫组化法和Western blot方法检测各组CX43的表达。结果流式细胞术检查示BMSCs表达CD73,CD44,CD29和CD90,不表达CD34,CD105;成骨诱导21d茜素红染色呈红色结节,成脂诱导分化14d可见明显脂滴并油红染色阳性,成内皮细胞诱导分化21d免疫荧光示内皮细胞标识CD31,CD34表达明显增加,接种于Matrigel基底胶上具有成小管能力;免疫荧光、免疫组化和Western blot方法均显示CX43基因修饰的BMSCs的CX43蛋白表达明显增加。结论成功建立了小鼠BMSCs分离培养法和CX43基因体外转染BMSCs体系。     

丹参诱导人脐血间充质干细胞分化为神经样细胞

目的探讨丹参注射液对人脐血单个核细胞来源的间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的诱导作用。方法利用FACScan流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD29、CD44、CD59、CD33,用丹参注射液诱导人脐血原代细胞和脐血来源的间充质干细胞向神经细胞方向分化,并与神经生长因子(NGF)和神经常苷脂(GM1)的诱导作用比较,用免疫细胞化学方法对分化和未分化细胞进行鉴定。结果人脐血原代细胞中MSCs的表耐标记CD29、CD44、CD59阳性率分别为10.7%、37.27%和66.67%,而造血细胞的表面标记CD33阳性率仅为0.33%。人脐血传代细胞(第5代)MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59的阳性率分别为40.2%、70.5%和95.4%。原代培养的贴壁细胞形态呈大小不等圆形和条形,用丹参诱导可表达神经细胞的标记。传代培养的间充质干细胞,可维持在未分化状态稳定增殖。用丹参可诱导这种细胞向神经样细胞分化,表达神经干细胞标记nestin,神经元的标记β-Ⅲ类神经微管(β-TubulinⅢ)、神经微丝(NF)和神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。与NGF和GMI的诱导作用比较,细胞形态类似,表达相同的神经细胞标记,丹参的诱导速度较快,诱导后细胞表达神经元标记的比例较高。结论人脐血是MSCs的来源之一,丹参可诱导人脐血干细胞分化为神经样细胞,丹参可作为神经诱导剂,人脐血干细胞可作为神经干细胞的来源。     

人脐带间充质干细胞的生物学特性及向神经样细胞分化的研究

目的 研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞（MSCs）的特性及向神经细胞分化的可能性,为神经移植寻找新的细胞来源。方法 检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记;丹参和B巯基乙醇诱导人脐带来源的MSCs向神经细胞分化,用免疫细胞化学方法对分化和未分化的细胞进行鉴定;半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞的神经相关基因表达。结果 从人脐带分离、培养的贴壁细胞,体外生长形态类似于成纤维细胞,可以维持在未分化状态稳定增殖,体外增殖超过10代。这类细胞MSCs的表面标记CD29、CD44、CD59、CD105仿呈现高表达,造血细胞表面标记CD14、CD33、CD34、CD27、CD45、CD117和与移植免疫排斥相关的表面标记CD80（137—1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L不表达或低表达。丹参和β巯基乙醇均可诱导人脐带MSCs向神经样细胞分化,分化的细胞表达神经干细胞的标记巢蛋白（Nestin）,神经元的标记类神经微管（β-TubulinⅢ）和神经微丝（NF）,以及神经胶质细胞的标记胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。RT-PCR检测证实,经丹参诱导后的MSCs表达神经干细胞相关基因Nestin,诱导前和诱导后的MSCs均表达神经细胞基因Pleiotrophin,诱导后的表达明显增强。结论 人脐带华尔通胶含有丰富的MSCs,易于培养扩增,其表达MSCs的表面标记。不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞标记。人脐带来源的MSCs能分化为神经细胞,表达神经细胞的相关标记和基因,这种细胞可能成为中枢神经系统细胞移植的一个干细胞来源。     

血清剥夺诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡及其对Smac基因转录的影响

目的观察体外血清剥夺诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡及BMSCs凋亡过程中Smac基因表达变化,进一步探索BMSCs凋亡机制。方法用密度梯度离心和差异贴壁相结合法分离BMSCs,体外培养、扩增。流式细胞术对培养的BMSCs进行免疫表型鉴定。BMSCs体外血清剥夺培养0h(正常对照组)、24h、48h,用AnnexinⅤ-FITC和碘化丙啶(PI)双标记行流式细胞术凋亡检测。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)生成cDNA,以荧光定量PCR检测分析Smac mRNA的丰度。结果体外培养第5代BMSCs流式细胞术免疫表型鉴定结果符合BMSCs特点。与0h比较,血清剥夺24、48h后,BMSCs发生显著凋亡,各组比较有统计学差异(F=170.96P<0.01),且24h点早期凋亡百分率达到(32.99±2.52)%。同时荧光定量PCR检测显示24h点Smac mRNA表达与正常对照组相比显著升高(t=2.814P<0.05)。结论血清剥夺能诱导BMSCs凋亡,被诱导凋亡的BMSCs中Smac基因转录增加。     

先心病婴幼儿骨髓间充质干细胞向心肌样细胞诱导分化的实验研究

目的探讨先心病婴幼儿骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）向心肌样细胞诱导分化的可行性，为心肌组织工程提供新的种子细胞的来源。方法无菌条件下抽取先天性心脏病婴幼儿胸骨骨髓3～5ml，经密度梯度离心（Percoll分离液，T为1．073），接种获得BM～SCs，常规培养。流式细胞仪检测细胞表面抗原。将已传2代的细胞应用5-氮杂胞苷（5-Azacytidine，5Aza）诱导24h，更换为完全培养基（LG-DMEM）后继续培养，2周后行免疫细胞化学及透射电镜行超微结构检查。结果先心病婴幼儿BMSCs基本上为梭型成纤维细胞样形态，表面标记为CD29、CD44、CD71、CD90表达阳性，CD3、CD14、CD34、CD45、HLA-DR不表达。BMSCs经5-Aza诱导2周后α-actin，Desmin，cTnI，Cx-43免疫细胞化学染色阳性，透射电镜示诱导后的细胞有明显的肌丝，单个细胞核呈椭圆形，位于细胞的中央。结论先心病婴幼儿骨髓阃充质干细胞可在体外经5-Aza诱导分化为心肌样细胞，有望成为应用自体细胞体外构建工程化心肌重要的种子细胞。     

小鼠肠神经嵴干细胞体外神经元亚型分化的研究

目的 研究胚鼠(E14～17)、新生鼠(P1、P5)肠神经嵴干细胞(GNCSCs)在体外培养中经诱导向一氧化氮合酶(NOS)和血管活性肠肽(VIP)神经元分化的特点;研究标本取材和细胞消化分离间隔时间对P5鼠收获GNCSCs克隆球数量和诱导分化能力的影响.方法 分离并培养胚鼠、新生鼠GNCSCs,采用血清联合多聚赖氨酸或单纯多聚赖氨酸促分化,SABC法进行nNOS和VIP免疫细胞化学染色;将P5鼠按标本取材和细胞分离的间隔时间分为0、15、30、45、60 min组,对培养72h GNCSCs克隆球进行计数,再采用血清联合多聚赖氨酸促分化,SABC法进行nNOS和VIP免疫细胞化学染色.结果 血清联合多聚赖氨酸对胚鼠、新生鼠GNCSCs克隆球诱导分化作用明显强于单纯使用多聚赖氨酸(P＜0.05);胚鼠、新生鼠GNCSCs经体外培养、血清联合多聚赖氨酸诱导,均可分化出nNOS和VIP阳性细胞;P5鼠0min组获得的GNCSCs克隆球数和经联合诱导分化出的阳性细胞数明显高于其他各组(P＜0.05),15、30min均明显高于45、60min组(P＜0.05).结论 血清联合多聚赖氨酸对GNCSCs向NOS和VIP神经元分化的诱导作用明显优于单纯使用多聚赖氨酸;胚鼠和新生鼠GNCSCs经体外培养、血清联合多聚赖氨酸的诱导,可分化出NOS和VIP神经元;P5鼠肠管获得GNCSCs数和NOS、VIP神经元分化能力随标本取材、细胞分离间隔时间延长而降低.     

应用5-杂氮脱氧胞苷诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化的体外研究

目的 探讨5-氮杂脱氧胞苷(5-AzaC)体外诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化的可行性.方法 B超引导下穿刺抽得孕中期羊水,体外分离、培养得到羊水来源间充质干细胞,传代后计数细胞并绘制生长曲线.体外成骨、成脂诱导观察人羊水来源间充质干细胞多向分化能力.采用5-AzaC对羊水来源间充质干细胞成肌诱导2周,观察细胞形态学变化,RT-PCR、免疫荧光染色方法鉴定成肌细胞特异mRNA及蛋白表达.结果 人羊水来源间充质干细胞体外培养后迅速进入对数生长期,培养7 d未达到平台期.茜素红和油红O染色证实人羊水来源间充质干细胞可诱导分化为成骨、成脂细胞样细胞.人羊水来源间充质干细胞经5-AzaC诱导2周逐渐变长梭形.而对照组细胞呈扁平多角形.免疫荧光染色及RT-PCR结果提示实验组细胞表达肌结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白I(Tn I)、横纹肌辅肌动蛋白(α-Actinin)及mRNA;对照组呈阴性.结论 人羊水来源间充质干细胞体外增殖能力强,能分化为成骨、成脂细胞样细胞.5-AzaC能在体外诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化.     

谷氨酸诱导骨髓间质干细胞凋亡及其对Smac基因转录影响

目的观察谷氨酸能否诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡,探讨Smac基因是否参与谷氨酸诱导的BMSCs凋亡。方法原代培养大鼠BMSCs,加谷氨酸培养后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测分别经10、30、50mmol/L谷氨酸作用24h后BMSCs存活率,并用PI/Annexin-V双染法流式细胞仪计数各组凋亡细胞比例,通过逆转录聚合酶链反应观察经30、50mmol/L谷氨酸作用24h后Smac基因mRNA表达变化。结果谷氨酸诱导组BMSCs凋亡率较对照组升高(P<0.05),且随谷氨酸浓度增加,凋亡细胞百分率也相应增加;RT-PCR法发现谷氨酸作用后,BMSCsSmac基因表达较对照组升高(P<0.05),且随谷氨酸浓度增加,Smac基因表达也增加。结论谷氨酸能诱导BMSCs凋亡,Smac基因可能参与谷氨酸诱导的BMSCs凋亡。     

脂肪间充质干细胞的体外诱导和成血管作用

目的 研究在体外诱导脂肪间充质干细胞(ADMSCs)向内皮细胞分化、在立体培养基上的血管形成情况.方法 将传至第三代的ADMSCs用内皮细胞诱导液、Matrigel三维培养基进行诱导培养,对ADMSCs和诱导细胞选用CD31、CD44细胞表面抗原在流式细胞仪检测表达情况,用HE染色、FⅧ-RAg免疫组织化学染色及倒置显微镜、透射电镜等进行观察鉴定.结果流式细胞仪上检测ADMSCs的表达为CD44阳性、CD31阴性,诱导的细胞CD31阳性、CD44阴性.诱导细胞14d倒置显微镜下呈铺路石样形态,FⅧ-RAg染色细胞呈阳性,透射电镜下在细胞浆内见到内皮细胞特有标志物Weibel-Palade小体。ADMSCs在Matrigel三维培养基上诱导,24h细胞迁徙成团、有伪足伸出,诱导7d伸出的细胞形成交叉网格状,13d形成较长血管,20d较长血管粗而多、出现小分叉,30d长血管、分叉血管变粗厚;FⅧ-RAg染色后诱导血管亦呈阳性.结论 脂肪间充质干细胞在体外经诱导能向内皮细胞分化、能形成血管,可作为促进组织工程移植物血管化的良好的种子细胞.

Abstract：

Objective To study in vitro induction of adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) into endothelial cells and blood vessel formation on three-dimensional (3D) media． Methods The 3rd passage ADMSCs were induced in vitro into endothelial cells on conditional medium and grew on Matrigel medium． The cell surface antigens CD31 and CD44 were detected with flow cytometric analysis before and after induction． HE staining, FⅧ-RAg immunohistochemical staining, inverted microscope and transmission electron microscope were used for morphological study.Results The expression of CD44 was positive and CD31 negative in ADMSCs in flow cytometric analysis.After induction,CD31 became positive while CD44 was negative． Paving-stone-like cell appearance was seen under inverted microscope 14 days after induction.The cells were FⅧ-RAg positively stained with immunohistological method,and Weibel-Palade body was observed under transmission electron microscope.On Matrigel media,the induced cells migrated in lumping with pseudopodia protrusion after 24 hours,and formed grid structure on the 7th day.Long vasculature was observed on the 13th day,and the vessels branched on the 20th to 30th day.The vessels stained positive for FⅧ-Rag． Conclusions ADMSCs have the potential to give rise to endothelial cells with in vitro induction and to form vessel structure in 3D media.ADMSCs have potential role in vascularized tissue engineering grafting．     

发育中神经元惊厥性损伤的相关基因表达

目的　研究惊厥发生后不同发育阶段神经元白细胞介素 1受体 (IL 1R)、Cx36基因表达。方法　无镁细胞外液短暂处理培养的发育中皮层神经元 ,用Real time定量RT PCR方法检测IL 1R、Cx36mRNA表达改变。结果　 1.体外培养 6、17d神经元无镁处理后IL 1R表达呈一过性降低 ,之后 6d神经元表达恢复正常 ,而17d神经元表达增加 ,于处理后 2 4h达高峰 (P <0 .0 5 )。 2 .体外 6d的神经元无镁处理后Cx36表达渐增高 ,于处理后 2 4h达高峰。体外 17d神经元处理后 6hCx36表达与对照组比较明显降低 (P <0 .0 5 ) ,2 4h降低达峰值。结论　无镁诱导惊厥后体外 6、17d神经元IL 1R、Cx36表达不同 ,可能与惊厥造成 6、17d的神经元损伤不同有关     

Bone marrow mesenchymal stem cells attenuate lung inflammation of hyperoxic newborn rats

Zhang H, Fang J, Su H, Yang M, Lai W, Mai Y, Wu Y. Bone marrow mesenchymal stem cells attenuate lung inflammation of hyperoxic newborn rats. Abstract: BPD is a significant global health problem and currently lacks effective therapy. We established a neonatal rat model of BPD to investigate therapeutic potential of BMSCs in neonatal lung disease. BMSCs were isolated, identified, and transfected by lentiviral vector carrying GFP gene in vitro. Neonatal rats were injected intravenously with either BMSCs or PBS after they had been already exposed to high oxygen for seven days, and assessed on post‐injection day 3, day 7, and day 14 for weight gaining, lung histology, radical alveolar counts, and lung cytokine level. BMSCs were positive for CD29, CD44, and CD90 whereas negative for CD34, CD45, CD11b and with differentiation potential into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. BMSCs expressed GFP after transfected by lentivirus. After injection, BMSCs exert their therapeutic benefit of improving weight gaining, preventing alveolar growth arrest, and suppressing lung inflammation of neonatal rats. Intravenous delivery of BMSCs in newborn rats conferred protection from hyperoxia‐induced lung injury, and one of the effects of BMSCs treatment is suppressing lung inflammation.     

全反式维甲酸诱导K562细胞铁代谢变化的研究

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)对K562白血病细胞中铁代谢相关基因表达产物(H-Fn、TfR及IRP2)的影响及其相互关系.方法 应用联苯胺、瑞氏、非特异性酯酶、硝基四氮唑蓝还原试验4种染色方法 ,观察ATRA对K562细胞的诱导分化特点;应用流式细胞术检测经ATRA处理后,K562细胞表面抗原CD71及CDl3表达水平的变化;应用RNA/蛋白带移动分析方法 (RNA/protein band-shift assay)检测铁调节蛋白(IRP)的结合活性;采用放射免疫分析法测定K562细胞内铁蛋白含量的变化;采用RT-PCR方法 对ATRA处理的K562细胞H-Fn、TfR及IRP2 mRNA水平的表达进行检测,同时对RT-PCR产物克隆测序.结果 K562细胞经ATRA诱导,出现粒系分化的形态学特征,中幼粒细胞及以后阶段的细胞数明显增多.细胞表面抗原CD71下降而CD13表达升高.ATRA处理组的H-Fn mRNA水平较对照组升高,而IRP2及TfR mRNA减少;处理组IRP结合活性较对照组明显下降,但铁蛋白含量升高.结论 ATRA诱导K562细胞向粒系方向分化过程中,伴有一系列铁代谢相关基因表达产物的改变,其上游调控机制有待进一步探讨.     

牵张应力对小儿体外骨髓间充质干细胞向成骨、成脂肪分化的相关性研究

目的 探讨周期性机械应力对小儿骨髓问充质干细胞(MSCs)分化方向的影响.方法 利用自行建立的机械牵张应力装置,对体外MSCs加载力学信号,并复合成脂肪诱导剂,选用化学染色、RT-PRC、免疫组化、Western Blot的方法检测MSCs干预后成骨指标(OC、BMP-2、I型胶原)和成脂肪分化的指标(PPART-2、脂滴).结果 MSCS受力后,细胞OC mRNA表达较对照组明显增高,而且与干预时间相关;干预7 d后,细胞内BMP-2、I型胶原蛋白表达较对照组明显增强;MSCs在成脂肪诱导过程中,接受应力后细胞脂滴的出现和PPARy-2 mRNA的表达均明显下降.结论 适当的应力促进MSCs向成骨方向分化,抑制其向脂肪方向分化.