细胞裂解法对植入前诊断中聚合酶链反应扩增效率的影响

目的 :探讨优化细胞裂解条件 ,提高植入前诊断中聚合酶链反应的扩增效率。方法 :吸取单个淋巴细胞或人胚胎单卵裂球 ,用碱裂解液、蛋白酶K裂解液和改良的蛋白酶K裂解液进行处理 ,随后以巢式 -聚合酶链反应扩增人肾上腺脑白质营养不良基因 (ALD基因 )的 3号外显子 ,比较其扩增效率。结果 :三种裂解液组对人淋巴细胞的扩增效率分别为 90 % ,74 % ,87% ,对人单卵裂球的扩增效率分别为 98% ,77% ,96 %。结论 :在植入前诊断中 ,采用碱裂解液及改良的蛋白酶K裂解液优于蛋白酶K裂解液     

四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应在SNP基因分型中的研究

目的 探讨四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(tetra-primer amplification refractory mutation system-potymerase chain reaction,tetra-primer ARMS-PCR)在SNP基因分型中的应用. 方法 利用人EXO1基因第10外显子CA9T单核苷酸多态性为研究对象,以tetra-primer ARMS-PCR的原理设计四种引物进行扩增,从而对Mg2 浓度、dN浓度、Taq酶用量及内外引物浓度比例4个因素进行优化. 结果 当反应体系的退火温度为51℃,Mg2 浓度、dNTP浓度分别为2.0 nanol/L、0.1 mmol/L,Taq酶用量为0.5 U,内/外引物浓度为1/0.2μmol/L时,tetra-primer ARMS-PCR应用于该SNP位点的基因分型结果最佳. 结论 四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应是SNP基因分型的一种可行方法,但在应用时需对反应条件进行必要的优化.     

正交试验在选择聚合酶链反应最适条件中的应用

正交试验在选择聚合酶链反应最适条件中的应用孙晨光，罗超权，伍新尧，杨英浩，扶庆国（中山医科大学生化教研室；广州，５１００８９）主题词聚合酶链反应；研究设计中图号０３．３聚合酶链反应（ＰＣＲ）是８０年代兴起的一种体外ＤＮＡ扩增技术。它能快速特异地扩增目...     

细胞裂解法对植入前诊断中聚合酶链反应扩增效率的影响

目的：探讨优化细胞裂解条件，提高植入前诊断中聚合酶链反应的扩增效率。方法：吸取单个淋巴细胞或人胚胎单卵裂球，用碱裂解液、蛋白酶K裂解液和改良的蛋白酶K裂解液进行处理，随后以巢式－聚合酶链反应扩增人肾上腺脑白质营养不良基因（ALD基因）的3号外显子，比较其扩增效率。结果：三种裂解液组对人淋巴细胞的扩增效率分别为90％，74％，87％，对人单卵裂球的扩增效率分别为98％，77％，96％。结论：在植入前诊断中，采用碱裂解液及改良的蛋白酶K裂解液优于蛋白酶K裂解液。     

巢式聚合酶链反应扩增外周血吞噬细胞内外伤寒沙门菌Vi基因

目的：明确外周血吞噬细胞内外伤寒沙门菌Ｖｉ基因检测在伤寒诊断中的意义。方法：高速离心沉淀,低渗溶解红细胞法分离８５例临床拟诊伤寒患者外周血吞噬细胞（内）及吞噬细胞外（血清中）伤寒沙门菌,巢式聚合酶链反应扩增伤寒沙门菌Ｖｉ基因;并与单管套式聚合酶链反应扩增粒细胞内伤寒沙门菌Ｈ基因、巢式聚合酶链反应扩增单核细胞内伤寒沙门菌Ｖｉ基因、１次聚合酶链反应扩增血清中伤寒沙门菌Ｈ基因比较。结果：巢式聚合酶链反应     

镁离子浓度对聚合酶链反应产物的影响

镁离子浓度对聚合酶链反应产物的影响尹镭１张梅２张红２（１山西医学院分子生物学实验室太原０３０００１２山西医学院生理学教研室）关键词聚合酶链反应镁脱氧核糖核酸体外扩增中图号Ｑ７８１聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）是...     

几种主流恒温扩增技术及其优化策略进展

2019年末爆发的新型冠状病毒(2019-n CoV)疫情严重威胁着人类健康与经济发展,遏制疫情发展的关键是如何准确、快速地完成2019-nCoV病毒检定。虽然2019-n CoV检测主流技术平台为PCR聚合酶链反应,但恒温扩增技术因其无需昂贵设备、操作流程简便、即时检验、结果判读简易可视化等优势,逐步成为某些紧急场景PCR替代技术。本文综述了六种主流恒温扩增技术,即依赖核酸序列扩增、滚环核酸扩增、链置换扩增、解旋酶依赖扩增、重组酶聚合酶扩增、环介导恒温扩增,并从等温核酸扩增原理、优化反应策略及其应用领域进行了阐述。     

聚合酶链反应对淋球菌,衣原体及支原体三联检测的诊断价值

聚合酶链反应对淋球菌、衣原体及支原体三联检测的诊断价值王积安，杨红起，刘继英，张爱民，杨树屏（东营市胜利石油管理局中心医院，东营市２５７０３４）关键词聚合酶链反应；淋球菌；衣原体；支原体聚合酶链反应（ＰＣＲ）是一种体外ＤＮＡ扩增技术。我院自１９９３年...     

家蝇相关序列扩增多态性扩增体系的建立与优化

目的:建立和优化家蝇的相关序列扩增多态性(SRAP-PCR)扩增体系.方法:以驯养家蝇为材料,通过单因子实验分别研究了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物浓度及Taq DNA聚合酶用量对家蝇SRAP分子标记扩增体系的影响,并对扩增体系进行了优化.结果:优化后的反应体系总体积为30 μl,含50 ng模板DNA、1.5mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTPs、0.15 μmol/L引物和0.50 U Taq DNA聚合酶.结论:家蝇SRAP-PCR扩增优化系统的建立,为今后利用SRAP技术进行家蝇遗传多样性分析、基因定位奠定了基础.     

激光捕获显微切割-单细胞PCR技术的应用研究

目的 建立一套优化的激光捕获显微切割-单细胞聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术,应用于分子组织学研究中单细胞基因的检测.方法 从淋巴结反应性增生冷冻组织切片中,应用激光捕获显微切割获取1-10个淋巴细胞,采用优化的单细胞PCR反应体系和条件进行β-珠蛋白基因检测.结果 单轮常规 PCR 各组多细胞的扩增阳性率比较无显著性差异(P>0.05),而单细胞的扩增阳性率低于各组多细胞,有显著性筹异(P<0.01);半巢式降落式PCR的单细胞扩增阳性率高于单轮常规PCR,有显著性差异(P<0.01).结论 联合应用优化的激光捕获显微切割及半巢式降落式PCR技术,显著提高了单细胞PCR的敏感性、特异性和稳定性.     

基于pJFH-1的HCV全基因组扩增方法的建立

目的基于pJFH-1建立能稳定扩增HCV全基因组的长链PCR方法。方法以pJFH-1为测试模板,通过优化PCR扩增中各个重要环节,包括引物的选择、甘油和/或DMSO最适浓度的筛选、循环条件的摸索等,建立能稳定扩增HCV全基因组的长链PCR方案。结果高Tm值(>65℃)的引物更有利于HCV全基因组的扩增;5%、10%甘油或5%DMSO可显著提高PCR扩增的特异性和扩增效率,且甘油的促进作用优于DMSO;双温法较三温法能获得更高产量的PCR产物。结论通过优化长链PCR反应体系及条件,成功实现HCV基因全长的扩增。     

尿嘧啶DNA糖苷酶防止PCR产物污染及其对核酸杂交的影响

目的 采用PCR微板核酸杂交ELISA技术分析尿嘧啶DNA糖苷酶（UNG/UDG）防止PCR产物污染及其对PCR扩增效率的影响,探讨在不同A/T含量的微生物中含尿嘧啶的PCR产物对核酸杂交的影响。方法 以3组dUTP含量不同的PCR产物作模板,抗污染组用UNG处理,直接进行再次扩增。用微板核酸杂交ELISA检测第二次PCR扩增的结果。 结果 抗污染组中以含dUTP的PCR产物作模板,结果为阴性;而以不含dUTP的PCR产物作模板,结果为阳性。非抗污染组全部为阳性。对3组PCR产物再进行核酸杂交无明显差别,且在一定温度内,3组具有同样的稳定性。 结论 UNG能有效降解含dUTP的PCR产物,使之不能作为模板再次扩增,可以有效地防止PCR产物的污染。含有尿嘧啶的PCR产物对寡核苷酸探针的杂交无影响。     

天麻ITS序列的聚合酶链反应扩增

目的:为天麻核糖体DNA中的内转录间隔区(internal transcribed spacer ,ITS)序列分析提供可靠、特异的聚合酶链反应(PCR)条件.方法:选择ITS序列通用引物对天麻ITS序列进行PCR扩增,对一系列PCR条件参数进行摸索,同时对PCR产物进行纯化后直接测序.结果:天麻ITS序列PCR扩增产物约为750 bp,不同来源样本存在有一定的差异.经测序后与Genebank中相关序列比对,天麻ITS序列总长度为598 bp,其中ITS1为235 bp,ITS2为209 bp,5.8S为154 bp,G C(%)为52%.结论:扩增天麻ITS序列的PCR反应条件可以得到可靠、特异的结果.     

Applied Study on Magnetic Nanometer Beads in Preparation of Genechip Samples

A protocol for enrichment and adsorption of karyocyte from whole blood by using magnetic nanometer beads as solid-phase absorbents was presented. The PCR amplification could be accomplished by using the nanobeads with karyocyte as template directly and the PCR products were applied on an oligonucleotide array to do gene typing. The HLA-A PCR amplification system and a small HLA-A oligonucleotide microarray were applied as the platform and an experiment protocol of separating karyocyte from whole blood using the magnetic nanometer beads (Fe203) were set up.The experimental conditions were also discussed. It showed that pH level of PBS eluent, Taq enzyme quantity and fragment length of products could influent the amplification results, and the magnetic nano-beads could succeed in sample preparation in microarray to provide a promising way in automatic detection and lab-on-a-chip.     

单细胞二重巢式PCR扩增影响因素初探

目的: 对影响单细胞二重巢式PCR扩增的因素进行初步探讨.方法:针对β-珠蛋白基因CD41-42、IVS-Ⅱ654突变位点区域采用二重巢式PCR,分别以不同的引物浓度组合、不同的Taq DNA聚合酶、不同的中和缓冲液、PCR反应前采用或不采用98 ℃预变性扩增单个淋巴细胞和/或单卵裂球,了解这些因素对PCR扩增效率的影响.结果: 不同的引物浓度组中,终浓度为0.25 μmol/L R1 F1引物对与 0.3 μmol/L R2 F2引物对配对扩增效率最高;不同的Taq DNA聚合酶中TaKaRa EX Taq的扩增效率最高;中和缓冲液-1(200 mmol/L Tricine)的扩增效率显著高于中和缓冲液-2(900 mmol/L Tris·HCl, pH 8.3/300 mmol/L KCl/200 mmol/L HCl)的扩增效率(P<0.05);单细胞PCR反应前采用98 ℃预变性与不采用98 ℃预变性的扩增效率间差异无统计学意义.结论:不同引物浓度组合、不同的Taq DNA聚合酶、不同的中和缓冲液对单细胞的二重巢式PCR的扩增效率存在明显差异,而PCR反应前采用98 ℃预变性不能提高PCR扩增效率.     

不同混合方法比较聚合酶链反应(PCR)效果的研究

目的比较不同方法下的聚合酶链反应对PCR扩增的影响。方法对124例晚期乳腺癌外周血标本的CyclinD1基因进行PCR扩增。在加入DNA模板前分别用离心法和微型旋涡混合器振荡法混合PCR反应液,分装各管后加DNA模板进行扩增、电泳。结果用微型离心机离心PCR反应液后仍扩增不出或极少能扩出PCR产物,其阳性率为11.3%,且易污染;而用微型旋涡混合器振荡法混合PCR反应液后,PCR产物扩增良好(阳性率达99.2%),且不易污染。结论微型旋涡振荡法混合PCR反应液法能在减少污染的同时大大提高PCR阳性率,是一种切实可行的基因扩增方法。     

广东菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列测定

【目的】研究地理因素对水蛭素基因结构变异的影响。【方法】抽提广东菲牛蛭基因组DNA ,根据已发表的水蛭素基因设计一对引物 ,从基因组DNA扩增出一特异性的大约 70 0bp片段 ,再回收、克隆和测序。【结果】广东菲牛蛭水蛭素基因全长为 6 42bp ,基因有 4个外显子 ,被三个内含子隔开。与马尼拉菲牛蛭水蛭素基因Hm1、Hm2 的同源性分别为 90 %与和 88 6 %。【结论】地理因素会影响菲牛蛭水蛭素基因结构的变异。     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.     

Transport of digested decontaminated sputum specimens to a central laboratory for testing forM. tuberculosis by amplicor MTB test

Rapid diagnosis of tuberculosis may improve management of infected patients and facilitate infection control procedures The relatively slow growth rate ofM. tuberculosis and the limited sensitivity and specificity of microscopy make rapid diagnosis difficult. Nucleic acid amplification techniques have been extensively studied for the detection ofM. tuberculosis DNA and a number of commercial products for detection of M.tuberculosis nucleic acid in clinical specimens are now available. As performance of diagnostic PCR at central reference laboratories may be desirable, the impact of specimen transport on the performance of the Amplicor MTB PCR assay is of practical importance. We have assessed the performance of the Amplicor MTB PCR on specimens submitted and initially processed in laboratories in 3 cities and then transported to a single laboratory for PCR assay. The overall sensitivity of the PCR test was 97 per cent and the corrected specificity was 100 per cent. All of 23 culture positive specimens collected locally were PCR positive compared with 10 of 11 culture positive specimens transported from elsewhere. In this study transportation of digested decontaminated specimens to a central laboratory either frozen at -20°, or overnight at room temperature had no apparent effect on the performance characteristic of the Amplicor MTB PCR assay.