骨髓间充质干细胞诱导分化为类雪旺细胞各阶段标志物的表达研究

目的探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类雪旺细胞各阶段的标志物表达情况。方法分别提取、分离和纯化Wistar鼠骨髓间充质干细胞做为待诱导细胞。诱导试剂为2-巯基乙醇、全反式维甲酸、heregulin-β1、血小板源性生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和弗司扣林。控制诱导试剂加入的种类,使细胞处于不同的诱导阶段,将其分为5组分别行免疫组化检测细胞p75、s-100和GFAP的表达情况。第1组未加入任何诱导试剂。第2组经过2-巯基乙醇诱导。第3组经过2-巯基乙醇诱导后,再加入全反式维甲酸。第4组在第3组基础上,再同时加入heregulin-β1、血小板源性生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和弗司扣林。第5组是将第4组细胞移入普通培养基培养7d后进行检测。结果第1￣3组标志物p75、s-100、GFAP表达率均为阴性,第4组p75(59.0±4.1)%、s-100(62.0±5.4)%和GFAP(56.0±3.2)%,第5组p75(34.0±5.2)%、s-100(23.0±2.5)%和GFAP(32.0±4.8)%。结论骨髓间充质干细胞在序贯加入诱导因子后可分化为类雪旺细胞,但类雪旺细胞表达雪旺细胞的标志物不具有...     

血管内皮生长因子体外诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞

目的：本实验探讨血管内皮生长因子对骨髓基质细胞在体外向神经细胞分化的作用。旨在为临床使用BMSCs移植和神经保护剂治疗脑损伤提供实验基础。 方法: 采用青年SD大鼠的全骨髓细胞进行培养。传至第3代时,流式细胞分析鉴定骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）表面标志物CD90和CD45。经10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,b-FGF）预诱导24h后,用含不同浓度血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ,VEGF）的诱导液进行诱导。细胞分为4组：A～C组分别加入浓度为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml VEGF的诱导液;D组作为对照组,不加VEGF。倒置相差显微镜（×200）下逐日观察细胞形态变化,诱导后的第3天和第10天分别计数每20个随机视野下神经细胞样形态的细胞总数。采用免疫组织化学方法鉴定神经细胞标志蛋白神经烯醇化酶（neuron specific enolase,NSE）。 结果: 流式细胞分析结果示P3代BMSCs细胞表面CD90(＋)CD45(－)。诱导第3天A~C组均有细胞出现胞体回缩,呈锥形或圆形,胞体折光性增强,伸出较细长单级或多极突起,并分出次级突起,诱导第10天,A~C组发生以上形态改变的细胞数目较前增多,D组中也有个别细胞出现以上形态改变。B组中的神经元样细胞数目最多,与A组、C组及D组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;D组中神经元样细胞数目最少,与A组、B组及C组比较差异有统计学意义（P<0.05）。第10天各组神经元样细胞数目均较第3天增多,各组第3天和第10天神经元样细胞数目相比较差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学证实具有神经元样形态的细胞表达NSE。 结论:在本实验条件下,VEGF能促进骨髓基质细胞体外向神经元样细胞分化,本实验预设的VEGF的3个浓度中,10ng/ml为最合适的浓度。     

脐血源性神经球分化为类雪旺细胞的研究

目的 研究脐血间充质干细胞(CB-MSC)向雪旺细胞谱系分化的生物表型和特征.方法诱导CB-MSC为悬浮的神经球,然后用胶质生长因子诱导分化为类雪旺细胞.分化的CB-MSC表现出和雪旺细胞类似的形态学的改变.通过免疫化学染色和Western blotting鉴定这些细胞雪旺细胞标志的表达情况;通过分化的CB-MSC与背根神经节神经元共培养观察其促进其轴突生长的作用.结果 未分化的CB-MSC很少表达nestin、GFAP和S-100.在CB-MSC诱导成神经球以后,82.38%±3.70%的细胞表达nestin,而GFAP和S-100仍然阴性.接种于分化液36 h后细胞表达nestin、GFAP、S-100,阳性率分别为43.78%±3.21%、35.42%±1.82%和29.49%±2.54%.相比未分化CB-MSC,分化的CB-MSC中神经轴突的形成率和轴突的长度明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).结论CB-MSC可以通过诱导转变为神经球,神经球可以诱导成雪旺细胞的形态,表型和功能类似雪旺细胞,可做为一种替代骨髓间充质干细胞的细胞来源,对于治疗神经系统疾病具有潜在的应用价值.     

大鼠骨髓基质干细胞体外分离、培养及分化的相关实验研究

目的探索大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)体外分离、培养及纯化的合适实验条件,并探讨其在体外定向诱导分化为神经元样细胞的可行性。方法通过密度梯度离心法从成年大鼠骨髓中分离出BMSC,而后通过贴壁培养法培养及纯化,观察其生长特性;对纯化后的BMSC使用碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)进行定向诱导分化,并进行免疫细胞化学鉴定。结果体外培养的BMSC传4代后,纯度最高,可达(95.23±3.06)%;其诱导分化7 d后,(75.43±7.63)%的细胞表现为-βTubulinⅢ阳性的神经元样细胞,(33.01±6.73)%的细胞则为GFAP阳性的胶质细胞。结论BMSC在体外培养条件下生长良好,经bFGF和EGF诱导后可大量分化为神经元样细胞和神经胶质细胞。     

bFGF、EGF诱导成人骨髓基质细胞向血管内皮细胞分化的实验研究

目的探讨骨髓基质细胞向内皮细胞分化的可能性。方法从成人肋骨中分离培养骨髓基质细胞，用bFGF和EGF作为诱导剂，观察细胞形态的变化，采用免疫组织化学方法检测诱导后的细胞表达血管相关性Ⅷ情况，并观察体外微血管网状结构的形成情况。结果经bFGF和EGF诱导后的细胞在形态上表现为内皮细胞特征，血管相关性Ⅷ呈阳性表达，并且在体外可形成微血管样结构。结论骨髓基质细胞在bFGF和EGF诱导下，可以分化为内皮细胞。     

成人骨髓基质干细胞体外诱导为许旺细胞的实验研究

目的　探索成人骨髓基质干细胞 (h MSCs)诱导分化为许旺细胞 (Schwann cell,SC)的可行性 ,奠定组织工程学治疗周围神经疾病的理论基础。方法　采取 Ficoll-paque梯度离心骨髓 ,分离 h MSCs,经过纯化、扩增培养 ,并证实其细胞来源 ;之后采用 BHA、RA及 Forskolin、b FGF、PDGF、HRG顺次诱导、培养 ,经免疫组化鉴定S-10 0、GFAP的表达状况。结果　经过预诱导剂及诱导剂的先后作用 ,h MSCs的细胞形态发生明显改变 ,胞体呈长梭形 ,两极有丝状突起形成 ,经免疫组化的证实 ,S-10 0、GFAP阳性表达率分别为 (75%± 6.2 % )和 (67%± 4.5% )。结论　 h MSCs经诱导后 ,细胞形态、体积大小均发生明显改变 ,S-10 0、GFAP染色呈阳性 ,符合许旺细胞形态和功能特征 ,证实 h MSCs可以作为种子细胞转化为许旺细胞 ,促进周围神经疾病的愈合     

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的：已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞，实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性，以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞，为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞。 方法：实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行。①动物：选择5只普通级SD大鼠，由泸州医学院实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉，取双侧胫骨和股骨，磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔，采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞，胰蛋白酶与EDTA联合消化，传至第4代，用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化。③实验评估：观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化，采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：①骨髓基质细胞形态观察：原代细胞接种1 d后开始贴壁增殖，3 d后多数贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形；10 d后90%细胞融合，以长梭形为主，突起粗大，形成网状、片状；传代后细胞贴壁速度加快，增殖能力更强，7 d左右达到融合。②诱导分化后细胞生长情况和形态变化：第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d，成球的细胞脱离瓶底，悬浮在细胞液中。将细胞离心弃上清，换成血清分化液后，细胞球逐渐贴壁，球周围很快发出突起，分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞。③神经细胞特异性标志的表达：骨髓源性细胞球表达巢蛋白，呈棕黄色，为神经干细胞；从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性。 结论：骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞，且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞。     

体外诱导成人骨髓基质细胞分化为神经元样细胞

目的探讨成人骨髓基质细胞(BMSCs)的生物学特性及诱导为神经元样细胞的方法.方法采用Ficoll-Paque液(1.077×103g/L)从成人骨髓中分离BMSC,体外扩增,以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、全反式维甲酸(ATRA)、联丁酰基环腺苷酸(dbcAMP)为诱导剂,诱导期间观察细胞形态和数目的变化,并通过免疫细胞化学鉴定神经元烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况.结果此诱导条件下95%的细胞成为神经元样细胞,免疫组织化学检查显示这些细胞表达NSE、GFAP或nestin.结论bFGF和EGF、ATRA、dbcAMP能诱导成人BMSCs分化为神经元样细胞,而且具有较高的阳性转化率.     

趋化因子SDF-1体外趋化骨髓基质细胞迁移的实验研究

目的探讨趋化因子SDF-1在体外对骨髓基质细胞的迁移作用。方法采用全骨髓法培养成年Wistar大鼠骨髓基质细胞。取第五代骨髓基质细胞行免疫荧光鉴定；后通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测骨髓基质细胞表达趋化因子受体CXCR4的情况．利用Boyden小室法探讨趋化因子SDF-1对骨髓基质细胞的体外趋化作用及其特异性。结果第五代骨髓基质细胞都表达间充质干细胞标记物Vimentin、Laminin及Fibronectin；细胞免疫荧光及RT-PCR结果证实骨髓基质细胞表达趋化因子受体CXCR4；趋化因子SDF-1（5、50、500ng／mL）体外可趋化骨髓基质细胞迁移，抗SDF-1多克隆抗体可对抗其趋化迁移作用。结论SDF-1／CXCR4通路参与骨髓基质细胞体外迁移，为进一步研究骨髓基质细胞的迁移机制提供了理论依据。     

RA和SHH体外联合诱导骨髓基质干细胞转化为神经细胞

目的研究体外使用全反式维甲酸(RA)和音猬因子(SHH)联合诱导人骨髓基质干细胞(BMSCs)转化为神经细胞的可行性。方法从健康志愿者髂骨处抽取骨髓5ml,体外分离、纯化、扩增到第三代后分别接种于A组[RA0.5μg/ml]、B组[SHH500ng/ml 碱性成纤维生长因子-8(FGF-8)100ng/ml]和C组[RA0.5μg/ml SHH500ng/ml FGF-8100ng/ml]诱导液中,诱导BMSCs分化为神经样细胞。使用倒置相差显微镜及免疫荧光技术观察诱导前后细胞改变。结果诱导7d后,各组均有部分BMSCs胞体收缩,折光性增强,突起伸出,表现出神经细胞的形态。免疫荧光表现神经元烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白(MAP-2)和β微管蛋白(β-tubulin)阳性。C组的各种分化细胞数均高于A组和B组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论SHH联合RA可以在体外有效诱导人BMSCs转化为神经细胞,两者之间具有协同作用。     

脑源性神经营养因子诱导大鼠骨髓基质细胞成为神经干细胞及其分化作用的实验研究

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)诱导大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)成为神经干细胞及其分化作用。方法取成年大鼠BMSCs,分别以BDNF和BDNF+RA(维甲酸)作为诱导物诱导,于诱导3d、7d后行巢蛋白(Nestin)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色。结果诱导3天后BDNF和BDNF+RA诱导组均有大量Nestin染色阳性细胞,BDNF+RA组阳性率高于BDNF组(P<0.01)。NSE、GFAP免疫阳性细胞在诱导3d后也有少量表达。诱导7天后BDNF和BDNF+RA诱导组Nestin阳性细胞明显减少,与诱导3天后比较差异有显著性(P<0.01),而NSE、GFAP阳性细胞数增多,与诱导3天后相比差异有显著性(P<0.01),且BDNF+RA组阳性率高于BDNF组(P<0.01)。结论联合应用BDNF与RA可提高BMSCs神经转化,并促进其向神经元及星形胶质细胞细胞分化。     

趋化因子Fractalkine体外趋化骨髓基质细胞迁移的实验研究

目的探讨趋化因子Fractalkine对骨髓基质细胞(BMSCs)的体外迁移作用。方法采用全骨髓法培养成年Wistar大鼠BMSCs,取第五代BMSCs行免疫荧光鉴定;后通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测BMSCs表达趋化因子受体CX3CR1的情况,利用Boyden小室法探讨趋化因子Fractalkine对BMSCs的体外趋化作用及其特异性。结果第五代BMSCs都表达间充质干细胞标记物Vimentin、Laminin及Fibronectin;CX3CR1细胞免疫荧光及RT-PCR结果证实BMSCs表达趋化因子受体CX3CR1,趋化因子Fractalkine(5、50、500ng/mL)体外可趋化BMSCs迁移,抗Fractalkine多克隆抗体可对抗其趋化迁移作用。结论Fractalkine/CX3CR1通路参与BMSCs体外迁移,为进一步研究BMSCs的迁移机制提供了理论依据。     

骨髓源及脂肪源干细胞向神经元样细胞诱导分化潜力的比较研究

目的 比较骨髓源基质干细胞(BMSCs)和脂肪源间充质干细胞(ADSCs)向神经元样细胞诱导分化的潜力. 方法 体外分离培养来自成年SD大鼠的BMSCs和ADSCs,传至第5代时加入表皮生长因子(EGF,10ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,20ng/mL),诱导6 h、12 h、24h、72 h、1周、2周后,用免疫荧光染色和Westernblot检测两种细胞的神经细胞特异性标志(巢蛋白和β.微管蛋白Ⅲ)的表达,并做统计学分析. 结果 BMSCs和ADSCs经诱导后,细胞形态发生变化,均表达神经细胞特异性标志.免疫荧光染色结果显示诱导后各时间点BMSCs和ADSCsnstin阳性率或β.tubulin Ⅲ阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05),且诱导后ADSCs表达nestin阳性细胞或β.tubulinⅢ的能力在各个时间点都比诱导后BMSCs强.说明诱导后的ADSCs向神经元样细胞方向分化的能力更强.Western blot结果也与免疫荧光染色结果类似. 结论 两种不同来源的干细胞在分化成神经元样细胞方面的能力不同.ADSCs比BMSCs具有相对更强的神经元样细胞分化能力.     

富血小板血浆诱导兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

背景：对于骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化,目前大多存在诱导物价格昂贵、制备困难或细胞培养周期长、成骨能力低等缺点,近年研究发现浓缩血小板中存在的生长因子有诱导骨再生的作用。 目的：观察富血小板血浆对体外培养兔骨髓基质干细胞的增殖和成骨细胞分化作用。 方法：从8只兔双侧股骨大转子抽取骨髓,体外分离培养兔骨髓基质干细胞,传至第3代分为两组,实验组用含1%富血小板血浆的DMEM进行干预,对照组加入普通DMEM条件培养液。 结果与结论：倒置显微镜下,原代培养细胞24~36 h后开始贴壁,10~12 d细胞融合成单层。实验组细胞培养第2天已贴壁,第6天细胞大部分融合;对照组细胞形态学变化较实验组晚出现1~3 d。培养第2,6,10,14天,碱性磷酸酶活性测定和茜素红钙结节染色结果显示,体外培养的兔成骨细胞生长良好,生化指标稳定,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性,证实富血小板血浆能促进体外培养的兔骨髓基质干细胞增殖,并能促使其向成骨细胞分化。     

丹参诱导鼠骨髓间充质细胞向神经元分化

目的：研究丹参对鼠骨髓间充质细胞的分化作用。方法：丹参注射液诱导鼠骨髓间充质细胞向神经元方向分化，采用免疫细胞化学方法对分化的和未分化的细胞进行鉴定。结果：丹参可诱导鼠骨髓间充质细胞向神经细胞分化，分化的细胞早期表达巢蛋白和Musashi1蛋白，后期则表达神经元的标志物神经元特异性醇化酶和神经微丝M，在最适合的诱导条件下约50％-60％的细胞表达这两种神经元的标志物。结论：骨髓组织中存在能分化为神经元的干细胞，丹参能够诱导这种干细胞向神经元分化，这种细胞可能成为中枢神经系统自体细胞移植的另一个干细胞的来源。     

骨髓基质细胞对神经干细胞分化为神经元的影响

采用细胞共培养方式和免疫化学染色方法 ,研究骨髓基质细胞对神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞的影响。实验发现 ,体外培养的中脑神经干细胞在与成年大鼠骨髓基质细胞共培养 7d后 ,在神经干细胞后代中神经元比例可达 38.6 %± 10 .8% ,明显高于自然分化组 2 0 % ,提示骨髓基质细胞提供的微环境可明显提高神经干细胞后代中神经元的比例。     

Transplantation of bone marrow stromal cells for peripheral nerve repair

Cell transplantation using bone marrow stromal cells (BMSCs) to alleviate neurological deficits has recently become the focus of research in regenerative medicine. Evidence suggests that secretion of various growth-promoting substances likely plays an important role in functional recovery against neurological diseases. In an attempt to identify a possible mechanism underlying the regenerative potential of BMSCs, this study investigated the production and possible contribution of neurotrophic factors by transected sciatic nerve defect in a rat model with a 15 mm gap. Cultured BMSCs became morphologically homogeneous with fibroblast-like shape after ex vivo expansion. We provided several pieces of evidence for the beneficial effects of implanted fibroblast-like BMSCs on sciatic nerve regeneration. When compared to silicone tube control animals, this treatment led to (i) improved walking behavior as measured by footprint analysis, (ii) reduced loss of gastrocnemius muscle weight and EMG magnitude, and (iii) greater number of regenerating axons within the tube. Cultured fibroblast-like BMSCs constitutively expressed trophic factors and supporting substances, including nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), collagen, fibronectin, and laminin. The progression of the regenerative process after BMSC implantation was accompanied by elevated expression of neurotrophic factors at both early and later phases. These results taken together, in addition to documented Schwann cell-like differentiation, provide evidence indicating the strong association of neurotrophic factor production and the regenerative potential of implanted BMSCs.     

Co-transplantation of Schwann cells and bone marrow stromal cells versus single cell transplantation on repairing hemisected spinal cord injury of rats

BACKGROUND: Bone marrow stromal cells (BMSCs) or Schwann cells (SCs) transplantation alone can treat spinal cord injury. However, the transplantation either cell-type alone has disadvantages. The co-transplantation of both cells may benefit structural reconstruction and functional recovery of spinal nerves.OBJECTIVE: To verify spinal cord repair and related mechanisms after co-transplantation of BMSCs and SCs in a rat model of hemisected spinal cord injury.DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized, controlled, animal experiment was performed at the Department of Histology and Embryology, Mudanjiang Medical College from January 2008 to May 2009.MATERIALS: Rabbit anti-S-100, glial fibrillary acidic protein, neuron specific enolase and neurofilament-200 monoclonal antibodies were purchased from Sigma, USA.METHODS: A total of 100 Wistar rats were used in a model of hemisected spinal cord injury. The rats were randomly assigned to vehicle control, SCs transplantation, BMSCs transplantation, and co-transplantation groups; 25 rats per group. At 1 week after modeling, SCs or BMSCs cultured in vitro were labeled and injected separately into the hemisected spinal segment of SCs and BMSCs transplantation groups through three injection points [5 μL (1 × 107 cells/mL)] cell suspension in each point). In addition, a 15 μL 1 × 107 cells/mL SCs suspension and a 15 μL 1 × 107 cells/mL BMSC suspension were injected into co-transplantation group by the above method.MAIN OUTCOME MEASURES: The Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) locomotor rating scale and somatosensory evoked potential (SEP) tests were used to assess the functional recovery of rat hind limbs following operation. Structural repair of injured nerve tissue was observed by light microscopy, electron microscopy, immunohistochemistry, and magnetic resonance imaging (MRI). In vivo differentiation, survival and migration of BMSCs were evaluated by immunofluorescence.RESULTS: BBB scores were significantly greater in all three transplantation groups compared with vehicle control group 8 weeks after transplantation. In particular, the co-transplantation group displayed the highest scores among the groups (P < 0.05). Moreover, recovery of SEP latency and amplitude was observed in all the transplantation groups, particularly after 8 weeks. Again, the co-transplantation group exhibited the greatest improvement (P < 0.05). In the co-transplantation group, imaging showed a smooth surface and intact inner structure at the injury site, with no scar formation, and a large number of orderly cells at the injured site. Axonal regeneration, new myelination, and a large amount of cell division were detected in the co-transplantation group by electron microscopy. Neuron specific enolase (NSE)- and glial fibrillary acidic protein (GFAP)-positive cells were observed in the spinal cord sections 1 week following co-transplantation by immunofluorescence staining.CONCLUSION: Co-transplantation of SCs and BMSCs effectively promoted functional recovery of injured spinal cord in rats compared with SCs or BMSCs transplantation alone. This repair effect is probably achieved because of neuronal-like cells derived from BMSCs to supplement dead neurons in vivo.