miR-150调控PDCD4对结核分枝杆菌H37Rv感染THP-1巨噬细胞的影响

目的:探讨miR-150对结核杆菌H37Rv感染THP-1巨噬细胞炎症、细胞增殖及凋亡的影响.方法:结核杆菌H37Rv感染THP-1巨噬细胞24、36和48 h后,ELISA法检测细胞IFN-γ及炎症因子(IL-6、TNF-α、IL-1β)含量.感染H37Rv的THP-1巨噬细胞转染miR-150 mimic,miR-...     

人巨细胞病毒IE1蛋白促进巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α及凋亡

为了研究HCMV IE1-GFP融合蛋白瞬时高表达对巨噬细胞分泌活性及其凋亡的影响,将真核表达载体pEGFP/IE1转染至巨噬细胞(Mφ),转染48h后,用荧光显微镜观察GFP-IE1融合蛋白或GFP的表达与定位。ELISA法检测细胞培养上清中IL-1β或TNF-α的含量以及用RT-PCR检测其mRNA的表达情况,并收集Mφ经PI染色后流式细胞术(FCM)检测其凋亡率。结果发现,GFP-IE1融合蛋白在Mφ内瞬时表达且定位于细胞核,GFP定位于整个细胞中。GFP-IE1融合蛋白在Mφ内瞬时高表达使Mφ分泌IL-1β和TNF-α量及其mRNA表达量均增加且Mφ凋亡率明显上升,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),而GFP表达对Mφ分泌及其凋亡无影响(P>0.05)。HCMV IE1瞬时高表达可上调Mφ分泌细胞因子IL-1β和TNF-α并促进Mφ凋亡。     

重组人生长激素对THP-1单核细胞TNF-α和IL-6分泌的影响与NF-κB活性的相关性研究

目的探讨重组人生长激素(rhGH)对THP-1单核细胞TNF-α和IL-6分泌的影响,并研究其与NF-κB活性的相关性。方法应用ELISA检测rhGH诱导THP-1细胞培养上清中TNF-α和IL-6的分泌情况,并观察LPS和NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082对其分泌的影响;应用荧光素酶报告基因和电泳迁移率实验(EMSA)检测NF-κB在rhGH诱导的单核细胞中的活化程度。结果 rhGH单独可以促进THP-1细胞分泌TNF-α和IL-6,抑制LPS诱导的细胞因子的分泌;BAY11-7082能显著抑制rhGH和LPS诱导的TNF-α和IL-6的分泌,NF-κB活性与TNF-α和IL-6的分泌呈现明显的相关性。结论 rhGH可通过NF-κB信号通路双向调节THP-1单核细胞TNF-α和IL-6的分泌。     

LDL诱导THP-1细胞炎性因子FOS、TNF-α、IL-1β的顺序表达

目的探讨LDL诱导THP-1细胞内炎性因子FOS、TNF-α、IL-1β表达及3种炎性因子的关系,为早期诊断动脉粥样硬化提供依据。方法采用实时荧光定量PCR检测LDL刺激的THP-1细胞中FOS、TNF-α、IL-1βm RNA的表达,TNF-α抑制剂刺激THP-1细胞中FOS、TNF-α、IL-1βm RNA的表达及TNF-α抑制剂对LDL诱导的THP-1细胞中FOS、TNF-α、IL-1βm RNA表达影响;采用流式细胞仪检测TNF-α抑制剂刺激的THP-1细胞凋亡情况。结果 LDL刺激THP-1细胞FOS m RNA的表达0.5 h达到高峰(P0.05),TNF-αm RNA的表达1 h开始上升并达到最高(P0.05),IL-1βm RNA的表达1 h开始上升(P0.05);TNF-α抑制剂不促进细胞凋亡,100μg/ml时凋亡率最低。TNF-α抑制剂刺激细胞FOS m RNA 2 h表达下降(P0.05),TNF-αm RNA 1 h表达上升(P0.05),2 h表达下降(P0.05),IL-1βm RNA 1 h表达下降(P0.05);LDL诱导细胞1 h后加入TNF-α抑制剂刺激细胞FOS m RNA 1 h表达下降(P0.05),TNF-αm RNA 0.5 h表达下降(P0.05),IL-1βm RNA 0.5 h表达下降(P0.05)。结论 LDL能够促进THP-1细胞内FOS、TNF-α、IL-1β的表达,且它们之间有一定的表达顺序,TNF-α能促进IL-1β的表达。     

卡氏肺大鼠肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达的变化

目的探讨卡氏肺孢子虫肺炎(Pneumocysitis carinii pneumonia,PCP)大鼠肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophage,AM)TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达的变化。方法采用AM体外培养技术,应用RT-PCR法分别测定脂多糖(LPS)诱导的AM中TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达的动态变化。结果肺泡巨噬细胞受LPS刺激后,PCP模型大鼠TNF-αmRNA在1、4 h表达高于正常组(P<0.05),IL-1βmRNA表达在4、8 h时表达高于正常组(P<0.01),IL-6mRNA表达在8 h时PCP高于正常(P<0.05),表达峰值都提前,并且在4 h达到峰值。结论LPS刺激后,PCP大鼠肺泡巨噬细胞在早期可能更易分泌TNF-α、IL-1β、IL-6作为免疫分子,起免疫防御和免疫损伤作用。     

乙型肝炎病毒及其核心抗原对巨噬细胞极化的影响

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)对巨噬细胞M1/M2极化的影响。方法:体外培养人白血病单核细胞系THP-1,用佛波酯将其诱导为人巨噬细胞,然后分别与HepG2/HepG2.2.15细胞和HBcAg共培养。通过流式细胞术观察共培养后THP-1巨噬细胞极化相关分子的变化;收集细胞培养上清,用ELISA检测巨噬细胞中促炎和抗炎细胞因子的分泌水平;应用RT-qPCR检测共培养后巨噬细胞极化相关分子和细胞因子的表达水平。结果:与HepG2细胞对照组相比,分泌HBV的HepG2.2.15细胞与THP-1巨噬细胞共培养能够上调其CD86和CCR7表达水平,同时促进IL-6、TNF-α和IL-10的分泌。而与HBcAg共培养后,THP-1巨噬细胞上CD163、CD206以及CD86表达水平升高,同时促进TGF-β、IL-10和TNF-α的分泌。结论:①HBV主要促进THP-1巨噬细胞向促炎的M1方向极化;②HBcAg主要促进THP-1巨噬细胞向抑炎的M2方向极化但同时也影响THP-1巨噬细胞向M1方向的极化。     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导THP-1细胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-6能力及其相关Toll样受体的差异性

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)脂多糖(LPS)诱导人单核-巨噬样细胞THP-1分泌IL-1β、TNF-α、IL-6能力及相关Toll样受体(TLR)的差异. 方法 采用酚水法提取Pg ATCC33277株脂多糖(Pg-LPS),并用红外光谱法和鲎试验进行鉴定.采用ELISA试剂盒定量检测Pg-LPS作用的THP-1细胞分泌IL-1β、TNF-α和IL-6水平.采用TLR2或TLR4单克隆抗体阻断试验联合ELISA检测,了解Pg-LPS结合靶细胞上Toll样受体的类型.实验中采用大肠杆菌0111:B4株脂多糖(E-LPS)作为对照. 结果 1μg/ml Pg-LPS作用THP-1细胞,分别于0.5、6和6 h检测分泌IL-1β、TNF-α和IL-6的水平明显升高(P0.05).TLR2或TLR4单抗均可有效阻断Pg-LPS作用的THP-1细胞分泌IL-1B或IL-6(P<0.05),但仅,ILR2单抗显示了阻断TNF-α分泌的作用(P<0.05).E-LPS诱导THP-1细胞分泌上述3种细胞因子的活性仅可被TLR4单抗所阻断(P<0.05). 结论 Pg-LPS诱导THP-1细胞分泌IL-1β、TNF-α和IL-6活性略高于E-LPS,TLR2而非TLR4是Pg-LPS介导靶细胞分泌上述细胞因子的主要受体.     

BCG-PPD、H37Rv-PPD诱导入巨噬细胞死亡及TNF-α、IL-1β和IL-10的表达差异

目的 本实验对不同毒力结核杆菌的衍生蛋白(PPD)对人巨噬细胞(THP-1)的影响及其与TNF-αt、IL-1 β及IL-10的差异性进行研究.方法 用H37Rv-PPD和BCG-PPD分别在3 h、8 h、15 h及24 h四个时间点刺激分化成熟的THP-1细胞,再应用Hochest染色法,荧光镜下观察细胞的转归差异(凋亡及坏死情况),同时取上清用ELISA法测TNF-α、IL-1β及IL-10的浓度.结果 BCG-PPD刺激下细胞核以椭圆凋亡小体多见,而H37Rv-PPD刺激下细胞核则多呈坏死状,以坏死多见;BCG-PPD刺激下上清中TNF-α及IL-10的表达量低于H37Rv-PPD刺激组,但BCG-PPD刺激下IL-1β的表达量却高于后者.结论 提示高毒力菌株衍生蛋白(H37Rv-PPD)引起THP-1坏死的原因可能与TNF-α的过度表达有关,而凋亡少见可能与IL-10抑制凋亡作用有关,而低毒力菌株衍生蛋白诱导凋亡与IL-1β有关.可能菌株毒力差异就存在于菌株的蛋白成分之中,且与上述几种细胞因子密切相关.     

重组腺病毒介导的sTLR2和sTLR4体外抗炎效应的实验研究

目的观察重组腺病毒介导的sTLR2和sTLR4对炎症模型细胞因子表达水平的影响。方法将人单核细胞系THP-1细胞随机分为正常对照组、炎症对照组、重组腺病毒AdTLR2组、重组腺病毒AdTLR4组、重组腺病毒AdTLR2+AdTLR4组。AdTLR2和AdTLR4单独或者联合作用于各组细胞,通过RT-PCR方法检测TLR2和TLR4 mRNA表达,应用ELISA法对上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量进行检测,探讨AdTLR2和AdTLR4对LPS诱导的THP-1细胞上清细胞因子表达水平的影响。结果通过RT-PCR方法检测THP-1细胞转染AdTLR2+AdTLR4后,TLR2和TLR4能够获得高表达。AdTLR2和AdTLR4单独和联合作用于LPS所致炎症细胞后,细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量较炎症对照组显著降低,且联合作用较单独作用组进一步降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论重组腺病毒AdTLR2和AdTLR4能够降低LPS所致炎性细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量,并且联合使用的抗炎效果优于AdTLR2或AdTLR4的单独作用。提示制备的重组腺病毒能够分泌sTLR2和sTLR4,能有效抑制炎性细胞的活化,减少细胞因子的释放,具有一定的抗炎作用。     

紫花地丁含药血清对巨噬细胞炎症因子分泌的影响

目的探讨紫花地丁用于炎症性疾病的疗效机制。方法采用紫花地丁水煎剂灌胃干预清洁级SD大鼠常规制备含药血清,按一定浓度于96孔板中与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养,24 h后以Griess比色法检测培养上清中NO含量,ELISA法检测培养上清中TNF-α和IL-6含量。结果与相同浓度的正常血清对照组比较,在5%～20%的紫花地丁含药血清作用下:1)未经LPS活化的巨噬细胞TNF-α、NO分泌增加(P0.05或P0.01),而IL-6分泌则降低(5%含药血清组)(P0.01)或增加(10%含药血清组)(P0.01);2)经LPS活化的巨噬细胞TNF-α、NO分泌降低(P0.05或P0.01),而IL-6分泌则降低(10%含药血清组)(P0.01)或增加(20%含药血清组)(P0.01);与同浓度组未经LPS活化的巨噬细胞比较:1)正常血清5%～20%各浓度组经LPS活化的巨噬细胞TNF-α、IL-6及NO分泌增加(P0.05或P0.01);2)紫花地丁含药血清5%～20%各浓度组经LPS活化的巨噬细胞NO分泌量显著降低(P0.01),TNF-α分泌量在5%含药血清浓度组降低(P0.01),而在10%和20%浓度组升高(P0.01),IL-6分泌量在5%含药血清浓度组降低(P0.01),而在20%浓度组升高(P0.01)。结论紫花地丁含药血清对巨噬细胞产生TNF-α、IL-6和NO的干预作用,可能是其调控炎症反应过程的重要机制。     

HPV18型E2蛋白高表达对巨噬细胞凋亡及其分泌功能的影响

目的:研究HPV18 E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白瞬时高表达对巨噬细胞(MΦ)凋亡及分泌活性的影响,为进一步研究E2蛋白在HPV18致癌机制中的作用奠定实验基础.方法:通过PCR从现有真核表达载体pEGFP-C1/E2上分别扩增出TAD、DBD基因片段,并构建真核表达载体pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD.将3种真核表达载体及pEGFP-C1分别转染MΦ,用倒置荧光显微镜观察它们的表达与定位,并以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测它们的表达.通过3种融合蛋白在MФ内的瞬时高表达,在转染48 h后分别检测各组细胞培养基中TNF-α和IL-1β的含量,并收集MΦ经染色以及流式细胞术(FCM)观察检测其凋亡.结果:GFP-E2融合蛋白主要表达于细胞核,细胞质内也有表达,而GFP-DBD融合蛋白仅表达于细胞核内,GFP-TAD仅表达于细胞质.GFP-E2、GFP-TAD融合蛋白在MΦ内高表达后MΦ凋亡率上升,细胞因子TNF-α和IL-1β分泌量增加,且GFP-TAD作用强于GFP-E2.而EGFP-DBD无此作用.结论:HPV18 E2及其TAD与EGFP融合蛋白瞬时高表达可诱导MΦ凋亡并上调其分泌细胞因子TNF-α和IL-1β.     

Recombinant Brugia malayi pepsin inhibitor (rBm33) induced monocyte function and absence of apoptotic cell death: an in vitro study

The effect of recombinant Brugia malayi pepsin inhibitor (rBm33) on human monocytes/macrophages has been examined using THP-1 cells. THP-1 cells stimulated with rBm33 showed enhanced levels of expression of pro-inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α, IL-6) and diminished levels of IL-12, iNOS and anti-inflammatory cytokine (IL-10) expression suggesting the predominant features of Th1 response. Phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) treated THP-1 cells stimulated with rBm33 and subsequent incubation with GFP expressing Escherichia coli (E. coli) for 2 h enhanced the uptake of E. coli. Nitric oxide (NO) levels measured in the supernatants of these cultures did not show significant changes. Apoptotic studies with Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) from normal individuals stimulated with rBm33 did not induce apoptosis of monocytes or lymphocytes. These observations suggest that rBm33 stimulates macrophages to induce Th1 response and does not promote apoptosis.     

阿托伐他汀通过下调NLRP1炎性体表达抑制IL-1β和IL-18的释放

 目的:探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1(NLRP1)炎性体在阿托伐他汀抑制THP-1巨噬细胞白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)分泌中的作用。方法:用10 μg/L脂多糖诱导THP-1巨噬细胞分泌IL-1β和IL-18,以不同浓度阿托伐他汀(1、10和20 μmol/L)孵育细胞24 h,或以10 μmol/L阿托伐他汀处理细胞不同时间(12、24和48 h),或转染NLRP1 siRNA以沉默细胞内NLRP1的表达。采用RT-PCR检测细胞内NLRP1炎性体mRNA的表达,Western blot检测细胞内NLRP1炎性体蛋白的表达,ELISA检测细胞上清液中IL-1β和IL-18的含量。结果:阿托伐他汀可抑制THP-1巨噬细胞NLRP1炎性体mRNA和蛋白的表达,且这种效应呈浓度和时间依赖性。转染NLRP1 siRNA后,THP-1巨噬细胞NLRP1的蛋白表达明显下降,且阿托伐他汀对IL-1β和IL-18分泌的抑制作用明显增强。结论:阿托伐他汀通过抑制NLRP1炎性体表达减少巨噬细胞IL-1β和IL-18的释放,发挥抗炎作用,进而延缓动脉粥样硬化进展。     

IL-12基因不同亚基真核表达载体的构建及表达

目的:克隆并构建含人白介素12(hIL-12)基因p35、p40不同亚基的真核表达载体,瞬时转染真核细胞并诱导IL-12的表达。方法:人单核细胞白血病细胞株(THP-1)和人白血病细胞株(HL-60),经DMSO、IFN-γ和LPS诱导后,用RT-PCR及SOEPCR扩增IL-12p40、p35及p40-p35融合基因;并构建pcDNA-p35、pcDNA-p40及pcDNA-IL-12真核表达载体。以3种重组质粒分别瞬时转染COS-7细胞后,通过RT-PCR及ELISA法检测目的基因的表达。结果:经诱导后,从HL-60细胞中扩增到IL-12p40和p35基因片段;但从THP-1细胞中只扩增到p35基因片段,未能扩增到p40基因片段;经酶切鉴定、PCR扩增及序列测定表明pcDNA-p35、pcDNA-p40及pcDNA-IL-12真核表达质粒构建成功;并在COS-7细胞中可检测到IL-12的表达。结论:含hIL-12基因不同亚基的真核表达质粒的成功构建,对进一步研究IL-12在免疫应答中的调节作用以及作为免疫佐剂改善BCG免疫保护效果的研究奠定了基础。     

Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) modulates palmitate-induced cytokine production in macrophage cells

Objective

The aim of the study was to investigate the effect of PTP1B modulation on palmitate-induced cytokine production in macrophages.

Methods

Lentiviruses carrying PTP1B-shRNA or cDNA at different multiplicities of infection (MOIs) were used to decrease and increase PTP1B expression in Raw 264.7 cells, respectively. mRNA and protein levels of TNF-α and IL-6 were measured by real-time PCR and ELISA, respectively.

Results

0.5 mM palmitate reduced PTP1B mRNA and protein levels by 25 and 19 %, respectively, compared to untreated cells. Overexpression of PTP1B decreased mRNA and protein levels of TNF-α and IL-6 in macrophages stimulated with palmitate. We found that protein and mRNA levels of cytokines significantly increased in knockdown cells stimulated by palmitate in a dose-dependent manner with increased MOI. NF-kB, JNK, p38 and ERK specific inhibitors significantly reduced the production of TNF-α and IL-6 in macrophages stimulated with palmitate and also PTP1B knockdown cells. Furthermore, inhibition of PTP1B resulted in increased phosphorylation of JNK, p38, ERK and NF-kB p65 in macrophage cells.

Conclusions

The data of this study demonstrate that PTP1B negatively regulates palmitate-induced cytokine secretion in macrophages by mechanisms involving the activation of MAPKs and NF-kB pathways.     

In vitro activation of murine peritoneal macrophages by recombinant YopJ: production of nitric oxide, proinflammatory cytokines and chemokines

Recently it was reported that 3 μg/ml of recombinant YopJ induced apoptosis in murine peritoneal macrophages in vitro. However, in this study, we report the activation of murine peritoneal macrophages in vitro on treatment with sub-apoptotic dose of recombinant YopJ protein (1 μg/ml). The activation involves enhanced production of nitric oxide (NO), tumor necrosis factor-α (TNF-α), IL-12, and IL-6. Production of NO and IL-6 was found to peak at 24 h of rYopJ treatment, whereas IL-12 and IFN-γ production peaked at 18 h of rYopJ treatment. Increased mRNAs expression of nitric oxide, IL-12, IL-6 and IFN-γ molecules, was also observed in rYopJ-treated macrophages by RT-PCR. rYopJ induced the enhanced activity of protein tyrosine kinases which was inhibited by pharmacological inhibitor genestein, wortmanin and H-7 suggesting the role of tyrosine kinases, PI3K and PKC in the above process. rYopJ also induced increased enhanced production chemokines MIP-1α, MCP-1, and RANTES in macrophages. Significantly, increased expression of TLR-2, TLR-6, MyD 88 and IRAK-1 was also observed by immunoblotting in rYopJ-treated macrophages. rYopJ induced production of NO, TNF-α and IL-6 was significantly inhibited in macrophages pretreated with pharmacological inhibitor wortmanin, genestein and H-7 demonstrating the probable involvement of protein tyrosine kinases in the above process.     

肺炎嗜衣原体CPAF诱导THP-1细胞产生前炎症细胞因子和凋亡

目的 研究肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae,Cpn)衣原体蛋白酶样活性因子(Chlamydial protease-like activity factor,CPAF)能否在体外诱导人单核细胞THP-1产生前炎症细胞因子和凋亡,为进一步探索Cpn感染宿主致病的分子机制提供实验依据.方法 将Cpn CPAF全基因克隆于pGEX6p-2载体上,在大肠杆菌(E coli)中诱导表达重组蛋白,经去内毒素纯化柱和琼脂糖凝胶FF获得纯化且无脂多糖(LPS)污染的重组蛋白GST-CPAF.以不同浓度的该蛋白作用于THP-1,ELISA检测TNF-α吨和IL-6水平.MTT法检测经该蛋白处理后THP-1的增生或抑制作用,用Hoechst33258荧光染色、DNA片段化分析、Armexin V-FITC-PI染色法检测细胞凋亡情况.结果 制备的莺组蛋白GST-CPAF以时间和剂量依赖方式刺激THP-1分泌TNF-α和IL-6,并以剂量依赖方式抑制THP-1增殖;当GST-CPAF刺激THP-1细胞24 h后,能诱导细胞调亡.结论 制备的Cpn重组蛋白GST-CPAF能诱导THP-1产生前炎症细胞因子和凋亡,可能是Cpn致病机制中的一个因素.     

miR-33表达与炎症反应的关系

目的 探讨miR-33表达与炎症反应的相关性。方法 细胞培养箱中培养人单核细胞（THP-1）48~72 h后传代,传至3代,加入100 ng/ml佛波醇（PMA）诱导24 h分化成为巨噬细胞。采用实时荧光定量PCR技术检测不同浓度LPS（0、1、10、100 ng/ml）以及10 ng/ml LPS不同刺激时间（0、24、36、48 h）THP-1巨噬细胞miR-33表达;另采用ELISA法检测THP-1巨噬细胞中TNF-α、IL-6和MCP-1表达量,分析miR-33表达与炎症反应的相关性。结果 随着LPS浓度（0、1、10、100 ng/ml）增加,miR-33表达、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐渐增加,不同浓度组miR-33表达、TNF-α、IL-6和MCP-水平比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。随着LPS刺激时间（0、24、36 h）延长,miR-33表达逐渐上调、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐渐增加,36 h达到高峰,48 h逐渐下降到正常,不同时间点miR-33表达、TNF-α、IL-6和MCP-1水平比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。Pearson相关性分析显示,miR-33表达与TNF-α、IL-6和MCP-1呈正相关（P＜0.05）。结论 THP-1细胞中miR-33表达与其炎症反应具有一定正相关性。