增强型绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子包装细胞系的建立及鉴定

目的：建立及鉴定产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子（hRI）的PA317包装细胞系。方法：采用脂质体转染法将pLNCX-EGFP-C1-hRI质粒转染至PA317包装细胞,分为空白细胞组（未转染组）、pLNCX-EGFP-C1转染组（对照组）、pLNCX-EGFP-C1-hRI转染组（实验组）,每组设3个复孔,转然后用RT-PCR和Western blot方法检测egfp-hRI基因在PA317细胞的表达。结果：RT-PCR和Western blot方法显示,转染后在PA317细胞中检测到egfp-hRI基因表达;用脂质体转染法获得了G418阳性的PA317包装细胞克隆。结论：实验成功建立了产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的PA317包装细胞系,为后续试验奠定了基础。     

含热休克蛋白70和绿色荧光蛋白双顺反子慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定人热休克蛋白70(Hsp70)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子慢病毒表达载体,以探索Hsp70对细胞保护作用的影响。方法通过基因重组技术将人Hsp70连接到含EGFP的慢病毒载体中,包装并收集病毒,感染人胰腺癌细胞系Aspc-1细胞后,通过荧光显微镜观察EGFP的表达,同时利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Westernblot)技术检测Hsp70基因的表达情况。结果酶切和测序鉴定Hsp70-IRES-EGFP双顺反子慢病毒载体构建正确,包装病毒感染细胞后荧光显微镜观察到细胞发绿色荧光,RT-PCR和western blot检测均表明感染病毒后细胞Hsp70的表达量明显增加。结论成功构建了Hsp70-IRES-EGFP双顺反子慢病毒载体,为后续研究Hsp70的功能和作用机制奠定了一定的基础。     

小鼠Tox3基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3基因克隆入慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染HEK293FT细胞,包装重组慢病毒LV-Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Tox3 mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Western blot）法检测TOX3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV-Tox3;RT-PCR及Western blot 结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV-Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

[目的]构建LYRM1基因绿色荧光蛋白融合载体,进而观察LYRM1基因编码蛋白在细胞内的定位情况.[方法]运用RT-PCR技术从人网膜脂肪组织中分离LYRM1基因的完整编码框,将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2,脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达情况.[结果]PCR、酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建正确.激光共聚焦显微镜下观察到pEGFP-N2转染的细胞中绿色荧光均匀分布于整个细胞,而pEGFP-LYRM1转染的细胞中绿色荧光主要集中在细胞核区域.[结论]成功构建了LYRM1绿色荧光蛋白融合载体,LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中.     

镍精炼烟尘对NIH/3T3细胞NF-κB表达及iNOS、NO分泌的影响

将镍精炼烟尘配制成终浓度分别为0.00、12.50、25.00、50.00、75.00、100.00μg/ml的混悬液,处理小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)24 h。CCK-8法检测镍精炼烟尘的细胞毒性,免疫印迹法(Western blot)检测核转录因子-κB(NF-κB)的蛋白表达水平,分光光度法检测细胞上清液中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)的含量。NIH/3T3细胞的生存率随镍精炼烟尘染毒浓度的增加而降低,差异有统计学意义(P0.05)。镍精炼烟尘诱导NIH/3T3细胞NF-κB蛋白表达高于对照组,诱导NIH/3T3细胞iNOS和NO分泌量增加,且随染毒浓度的增加而增加,差异均有统计学意义(P0.05)。提示镍精炼烟尘会致NIH/3T3细胞NF-κB活性增加,进而诱导炎性因子iNOS和NO分泌量增加,参与炎症的调控过程。     

具有抑制肿瘤前景基因-人MCPIP基因的克隆及细胞定位

目的 构建人MCPIP基因的真核表达载体,观察其在人胚肾细胞系(HEK293T)细胞中的表达及其定位特征.方法 佛波酯(PMA)刺激单核细胞THP-1转化为巨噬细胞,提取细胞mRNA,反转录为cDNA作为模板,扩增MCPIP基因编码区序列,克隆入真核细胞载体中,酶切鉴定目的 基因.将重组质粒转染HEK293T细胞,Western blot检测MCPIP蛋白质表达状况,激光共聚焦显微镜下直接观察基因定位情况.结果 酶切鉴定和测序证明,成功构建MCPIP真核表达载体.Western blot检测表明MCPIP真核表达载体转染293T细胞表达大小约为70kD的蛋白质.激光共聚焦显微镜下直接观察RFP-MCPIP表达可见在293T细胞中主要为细胞质中点状分布.结论 本研究成功构建了MCPIP真核表达载体,检测到MCPIP在巨噬细胞中高表达.并成功证实其细胞质点状定位的特征.     

巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）融合EGFP真核表达载体的构建及表达

目的 构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并鉴定其在小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞能否正确表达。方法 PCR扩增M-CSF基因，定向克隆入带有EGFP报告基因的真核表达载体，构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，脂质体介导将pEGFP-CSF转染人NH3T3细胞，以一步法RT-PCR检测其在NIH3T3细胞中的表达情况。结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建真核表达重组体pEGFP-M-CSF，并在NIH3T3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白，RT-PCR检测结果显示RT～PCR扩增产物与M～CSF目的基因片段大小相符，确实源于重组质粒转录后的。nRNA。结论 真核表达重组体pEGFP-M-CSF的成功构建及在体外真核细胞中有效表达，为进一步研究M-CSF在真核细胞中的信号调控奠定了一定的实验基础。     

重组质粒pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-hERG的构建及其在细胞内的表达和定位

目的分别构建先天性长QT综合征(LQTS)相关HERG基因和E637K突变基因与红色和绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-bERG,观察其在细胞内的表达和定位情况。方法将克隆在pcDNA3上的HERG和E637K片段分别亚克隆到红色荧光蛋白载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1上,转染HEK293T细胞,24 h后利用western blot技术和荧光显微镜观察重组质粒蛋白表达和细胞内定位情况。结果重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误。转染pmCherry-WT-hERG野生型质粒的细胞可以检测到135 kD和155 kD 2条蛋白质条带,而转染pEGFP-E637K-bERG突变型质粒的细胞仅显示1条135 kD蛋白质条带,155 kD处条带缺失。融合蛋白发出的红色和绿色荧光表明,突变型蛋白分布于胞浆中,而野生型蛋白主要位于胞膜上。结论成功构建了pmCherry-WT-hERG和pEGFP-E637K-hERG不同荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中得到有效表达,为LQTS突变基因的进一步功能研究奠定了基础。     

绿色荧光蛋白标记HIV融合蛋白基因表达载体

目的利用基因工程技术，构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的HIV（ENV-6C）基因的表达载体。并在E.coli BL21中高效表达。方法经核酸内切酶酶切、连接，构建重组表达载体pRSETB-HIV（ENV-6C）-GFP，通过十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Western印迹杂交技术（Western blot）分析重组结果．转化到E．roli BL21中，荧光分光光度计检测含有重组质粒的大肠埃希菌培养物中重组蛋白的表达情况。结果成功构建重组原核表达载体pRSETB、HIV（ENV-6C）-GFP，并在E．coli BL21中实现高效表达，检则到发绿色荧光的融合蛋白GFP-HIV（ENV-6C）。结论融合蛋白具有人类免疫缺陷病毒（HIV）外壳蛋白的抗原活性，可用绿色荧光蛋白标记抗原，对制备HIV抗体及免疫诊断新技术有一定价值。     

靶向hTERT的siRNA对卵巢癌SKOV3细胞增殖及化疗敏感性的影响

目的:探讨RNA干扰沉默人端粒酶反转录酶(hTERT)的表达后对卵巢癌SKOV3细胞增殖及化疗药物敏感性的影响。方法:化学合成hTERT siRNA及Control siRNA,用EntransterTM-R转染试剂将hTERT siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞。采用Real time-PCR法及Western blot法检测SKOV3细胞中hTERT mRNA及对应蛋白的表达;流式细胞术(FCS)检测细胞凋亡率;并分别用顺铂、阿霉素作用于SKOV3细胞,WST-1法检测细胞存活率及两种化疗药物的IC50。结果:与对照组相比,转染hTERT siRNA后,hTERT mRNA及蛋白表达量明显降低(P<0.05),细胞凋亡率明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),同时该组细胞的顺铂、阿霉素IC50显著下降。结论:hTERT siRNA不仅可以显著抑制卵巢癌SKOV3细胞中hTERT基因的表达,同时提高细胞对化疗药物的敏感性。     

多发性骨髓瘤恶性相关基因MYEOV2对NIH/3T3细胞生长的影响

目的　分析多发性骨髓瘤恶性相关基因MYEOV2对NIH/ 3T3细胞生长的影响。方法　将MYEOV2基因克隆到真核表达载体pcDNA3 1( +)上 ,并将阳性重组子通过脂质体转染入NIH/ 3T3细胞中 ,G418筛选获得转染阳性克隆并用RT -PCR检测MYEOV2基因的表达。运用流式细胞分类法、细胞生长曲线分析MYEOV2基因对NIH/ 3T3细胞生长的影响。结果　成功获得转染pcDNA3 1( +) /MYEOV2的细胞阳性克隆。流式细胞分析显示转染pcDNA3 1( +) /MYEOV2、转染空载体及未转染的NIH/ 3T3细胞的S期细胞分别为 3 0 9%、2 0 1%、16 1% ,前者较后两者S期细胞增多 ,有显著性差异 (P <0 0 5 )。细胞生长曲线显示转染pcDNA3 1( +) /MYEOV2、转染空载体、未转染的NIH/ 3T3细胞的倍增时间分别为 13 6h、2 5 3h、2 7 4h ,前者细胞倍增时间较后两者缩短 ,有显著性差异 (P <0 0 5 )。结论　MYEOV2基因的表达增加促进DNA合成增加 ,细胞增殖加快 ,是多发性骨髓瘤瘤细胞恶性增殖的一个重要因素     

DNA聚合酶β基因表达对NIH3T3细胞增殖影响

目的 观察不同类型DNA聚合酶B(DNA Polymerase β,DNA pol β)在小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)的表达及细胞增殖特性的变化.方法 用脂质体转染的方法,将野生型(wild type,wt)和食管癌缺失突变型(delete mutional type,dmt)的pol β重组荧光载体pEGFP-C3-pol β转染NIH3T3细胞,建立稳定表达pol β的细胞系,通过荧光倒置显微镜观察其定位,四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法绘制生长曲线,流式细胞仪测定其细胞周期.结果 转染2种类型pol β的NIH3T3细胞株中,均有外源基因mRNA水平和蛋白水平的表达;荧光倒置显微镜结果显示,野生型的以细胞胞核为主,缺失突变型的pol β表达以细胞胞浆为主,从第3 d开始,缺失突变型的细胞生长速度较野生型和对照组明显增快(P<0.05);转染缺失突变型NIH3T3细胞的S期细胞比例为68.29%,明显高于野生型的57.18%、对照组的58.12%和未转染NIH3T3细胞的57.35%(P<0.05).结论 外源野生型pol β基因表达后对NIH3T3细胞的增殖速度无明显影响,而缺失突变型则使其增殖速度加快.     

小鼠 Tox3 基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3~N克隆人慢病毒表达载体pCDH—MCS—T2A—copGFP—MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染HEK293FF细胞,包装重组慢病毒LV—Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测Tox3mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Westernblot）法检测T0x3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV—Tox3;RT—PCR及Westernblot结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV—Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

Rap2b基因表达对NIH3T3细胞集落形成及细胞伤口愈合能力的影响

目的了解Rap2b基因对NIH3T3细胞集落形成及细胞伤口愈合能力的影响,为探讨该基因在人肺癌发生中的作用提供实验依据。方法以人肺CDNA为模板克隆出Rap2b基因片段,构建pcDNA3.1-Rap2b真核表达载体,稳定转染NIH3T3细胞,利用集落形成试验和细胞伤口愈合试验,观察细胞集落形成及细胞伤口愈合能力的改变。结果与转染空质粒的细胞对比,转染pcDNA3.1-Rap2b质粒的细胞集落形成数目明显增加(P0.01),损伤修复愈合增快。结论 Rap2b基因表达可显著增加NIH3T3细胞集落形成,并增快该细胞的损伤愈合速度。提示Rap2b基因表达可能具有促进NIH3T3细胞增殖和恶性转化功能。     

脆性X智力低下蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中对脆性X智力低下蛋白(FMRP)进行重组表达,获得高产量及高纯度的可溶性重组蛋白。方法:以人脑cDNA文库为模板,PCR扩增FMR1基因后将其克隆至融合表达载体pGEX-6P-1中,重组载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,并用IPTG进行诱导表达。应用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B进行亲和层析纯化GST-FMRP融合蛋白,并以SDS-PAGE电泳和Westernblot对融合蛋白的表达进行检测。结果:亲和纯化后的融合蛋白经FMRP及GST单抗分别进行Westernblot鉴定为GST-FMRP融合蛋白。结论:大肠杆菌中FMRPISO10的重组表达产量高,纯化得到可溶性重组蛋白,为FMRP抗体的制备及FXS检测试剂盒的开发奠定基础。     

稳定表达HBx的人肝星形细胞系的建立及其生物学特性初探

目的建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）的LX-2细胞系,并初步研究HBx对于肝星形细胞（HSC）的增殖及其I型胶原蛋白表达的影响。方法构建包含HBx基因的重组慢病毒载体LV5-X,并转染LX-2细胞,同时用对照质粒转染LX-2细胞,经嘌呤霉素筛选后获得HBx稳定表达的LX-2-X和对照LX-2-C细胞系。荧光显微镜下观察感染效率,Western印迹检测细胞株中HBx的表达。在LX-2细胞系的生物学特性探索方面,应用CCK_8法检测细胞的增殖;Real—timePCR检测细胞中I型胶原蛋白mRNA的表达;ELISA法愉测细胞培养上清中I型胶原蛋白的表达。结果成功构建重组慢病载体LV5-X,感染LX-2细胞后建立细胞系LX-2-X和LX-2-C,嘌呤霉素筛选3d后,荧光显微镜显示近100％细胞发出绿色荧光,Western印迹证实LX-2-X细胞稳定表达HBx。培养72h和96h后LX-2-C细胞增殖明显高于LX-2和LX-2-C细胞组（P〈0．05）;PCR证实LX-2X细胞I型胶原蛋白mRNA合成高于LX-2和LX-2-C细胞组（P〈0．05）;ELISA结果显示LX一2一X细胞I型胶原蛋白表达高于LX-2和LX-2-C细胞组（P〈0．05）。结论成功构建了稳定表达HBx的LX-2细胞系;HBx能够促进HSC的增殖,并增加I型胶原蛋白的表达。     

大肠杆菌肠毒素ST_1—LT_B融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１，回收０．８４ｋｂ的ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因，再将载体ｐＥＴ—２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将其与ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因连接，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒，得到了理想重组质粒ｐＸＥＴ－ＳＬＴ１。重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以高效表达ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白，该融合蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％，而且无天然ＳＴ１生物毒性