急性SIVmac感染猴模型评价中药1号体内抗病毒效果

采用ＳＩＶｍａｃ感染剂量（１～１０ＭＩＤ５０）和先给药后感染方式，中药Ⅰ号能１００％保护动物不发生活动性ＳＩＶ感染，表现在感染治疗后从血浆分离病毒阴性，无可检出的抗体，ＰＣＲ检测ＰＢＭＣＳＩＶｍａｃＤＮＡ阴性，但巢式—ＰＣＲ检测２／３猴阳性。对照组３／４猴建立了真正感染，病毒分离阳性，抗体上升。中ＳＩＶｍａｃ感染剂量（１０～１００ＭＩＤ５０和先感染后给药方式，中药Ⅰ号未能抑制感染后２周的血浆病毒水平，但与对照组比较明显降低感染２周后的血浆病毒水平。表明中药Ⅰ号有抗猴体内病毒的作用。本模型亦可应用于中药方剂猴体内抗病毒的效果评价。     

结核分支杆菌DNA的单管巢式聚合酶链反应检测

目的探讨单管巢式聚合酶链反应（ＳＮＰＣＲ）检测石蜡包埋组织结核分支杆菌ＤＮＡ的特异性和敏感性。方法应用普通ＰＣＲ（ＧＰＣＲ）、双管巢式ＰＣＲ（ＤＮＰＣＲ）和ＳＮＰＣＲ对结核分支杆菌ＢＣＧ和３０例结核性淋巴结炎石蜡包埋组织进行结核分支杆菌复合群ＩＳ６１１０特异插入序列片段ＤＮＡ检测。结果ＤＮＰＣＲ和ＳＮＰＣＲ检测ＢＣＧＤＮＡ均于１５ｆｇ以上呈现阳性结果，其敏感性明显优于ＧＰＣＲ（４８０ｆｇ）。ＧＰＣＲ、ＤＮＰＣＲ和ＳＮＰＣＲ检测３０例结核性淋巴结炎阳性率分别为４３％、１００％和１００％，抗酸染色阳性率（１０％）与３种ＰＣＲ法相比差异有非常显著意义（均Ｐ＜０．０１）。ＧＰＣＲ阳性率与ＤＮＰＣＲ和ＳＮＰＣＲ相比差异亦具非常显著意义（均Ｐ＜０．０１）。ＳＮＰＣＲ阳性率与ＤＮＰＣＲ相同。结论巢式ＰＣＲ检测淋巴结石蜡包埋组织结核分支杆菌的敏感性显著高于ＧＰＣＲ，其中ＳＮＰＣＲ具有与ＤＮＰＣＲ相同的特异性和敏感性，并具有更大的实用价值。     

慢性乙型肝炎患者血清及肝组织中乙型肝炎病毒核心基因的研究

３６例肝穿刺诊断为慢性乙型肝炎患者的肝组织及血清，用ＨＢＶ全基因核酸杂交法及聚合酶链反应（ＰＣＲ）法扩增了病毒的ＰｒｅＣ／Ｃ区基因片段。发现ＰＣＲ法扩增后再经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ吸印转移及核酸杂交（ＰＣＲ－ＳＢＨ）可显著提高检出ＨＢＶ基因的敏感性。对５例无任何血清ＨＢＶ标记者证实在其肝内存在ＨＢＶ基因。用ＡｖａⅡ，ｓａｕ３ＡＩ，ＸｍｎＩ，ＢｓｔＮＩ及ＴａｑＩ酶切图谱分析上述病例的ｃ基因，与ｐＡＤＲ－１Ｃ基因比较，有４例（５份标本）有Ｓａｕ３ＡＩ的异常酶切位点，提示ＨＢＶ不仅ＰｒｅＣ区存在变异株，Ｃ基因中亦可有变异。     

应用长片段PCR扩增全长HIV— 1DNA的研究

目的 探讨长征段ＰＣＲ（ＬＤ－ＰＣＲ）扩增特点,并将它用于对全长ＨＩＶ ＤＮＡ的研究。方法 应用ＬＴＤ（Ｕ５）／ＬＴＤ（Ｒ）,ＣＬ－ＮＳＣ／ＣＬ－ＮＥＦ和ｇａｇＡｌ／ｇａｇＡ２等不同引物,＾３２Ｐｇａｇ,ｐｏｌ,ｎｅｆ和ｔａｔ等为片段探针,对克隆有ＨＩＶ－１完整基因片段,部分基因片段的质粒和ＨＶＩ感染者外周血单核细胞（ＰＢＭＣ）中的ＨＩＶ－１ ＤＮＡ进行扩增。结果 ＬＤ－ＰＣＲ对０．４－９ｋｂ的第     

新疆维吾尔族人群中CCR5△32,B—64I和SDF1—3‘A等位基？…

目的 调查ＨＩＶ－１感染相关的等位基因ＣＣＲ５△３２、ＣＣＲ２ｂ－６４Ｉ和ＳＤＦ１－３’Ａ在我国新疆维吾尔族人群中的频率和多态性分布。方法 随机采集血样，提取基因组ＤＮＡ。经ＰＣＲ或ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析，计算突变基因频率；并对其群体分布、性别分布和三者的相关性进行统计分析。结果 ＣＣＲ５△３２频率为３．４８％，ＣＣＲ２ｂ－６４Ｉ为１９．４５％，ＳＤＦ１－３’Ａ为２０．４１％。三种突变等位基因群体分     

病毒性心肌炎心内膜心肌活检石蜡包埋标本中巨细胞病毒基因的原位多聚酶链反应

对２５例病毒性心肌炎（ＶＭＣ）心内膜心肌活检（ＥＭＢ）石蜡包埋标本，用原位多聚酶链反应（ＩＳＰＣＲ）方法进行了巨细胞病毒（ＣＭＶ）的原位检测，心肌细胞内阳性检出率为４４％，明显高于对照组（Ｐ＜０．０１），但病毒基因与心肌病理学改变的关系尚不能确定。提示在心肌内ＣＭＶ基因检测中，ＩＳＰＣＲ是一种迅速、敏感和特异的方法，与原位杂交方法相比，其阳性检出率虽略有提高，但差异不具有统计学意义。     

SRV1感染和未感染Raji细胞的某些同工酶的比较研究

为了观察猴艾滋病Ｄ型逆转录病毒Ⅰ型（ＳＲＶ１）感染和未感染的Ｒａｊｉ细胞同工酶活性的变化，用超声波破碎细胞，提取细胞内总蛋白，然后用垂直薄层聚丙烯酰胺凝胺凝胶等电聚焦电泳对其进行酶谱分析。以α－醋酸萘酯和／或β－醋酸萘酯为底物时，ＳＲＶ１感染的Ｒａｊｉ细胞近酸性端酯酶Ｅｓｔ １１－１４的活性是未感染Ｒａｊｉ细胞的２．２倍，提示酯酶活性的变化与病毒感染有关。ＳＲＶ１感染和未感染Ｒａｊｉ细胞系的酸性磷     

聚合酶链反应－冷单链构象多态性快速检测结核分支杆菌rpoB基因突变

目的评估ｒｐｏＢ基因突变检测在结核分支杆菌利福平耐药性测定中的应用价值。方法采用聚合酶链反应－冷单链构象多态性（ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ）方法对８７株结核分支杆菌临床分离株及有药敏结果的２２份相应肺结核患者痰标本进行分析。结果ＰＣＲ扩增ｒｐｏＢ基因的敏感性为１００ｐｇＤＮＡ及５０００个菌体，属于分支杆菌特异。所有分离菌的ｒｐｏＢ基因ＰＣＲ扩增均为阳性。采用套式ＰＣＲ可使扩增敏感性提高１００倍。与传统药敏试验方法相比，ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ对８７株结核分支杆菌临床分离菌利福平耐药性的检测敏感性和特异性分别为８９．６％及１００％。２２份涂阳培阳痰标本中套式ＰＣＲ扩增阳性的６份均为高度利福平耐药，其ＳＳＣＰ结果也与相应分离株的药物敏感性试验相符。结论ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ检测结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变快速、简便、易行，适用于结核分支杆菌分离株利福平耐药性的快速测定。如进一步提高引物增特异性及敏感性，该技术可望用于临床标本直接检测     

巢式PCR检测血液病血清中HCV RNA

巢式ＰＣＲ检测血液病血清中ＨＣＶ　ＲＮＡ仉红刚，张秋菊，王景明通过输血途径感染丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）是血液病治疗中的一个长期潜在的并发症。为难确、及时地检测ＨＣＶ的近期感染，采用巢式ＰＣＲ技术对４６例血液病患者血清中ＨＣＶＲＮＡ进行了检测研究，现将有...     

应用多重聚合酶链反应法检测并鉴别结核分支杆菌与非结 …

目的 提高聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测分支杆菌ＤＮＡ的特异性和敏感性、以检测和鉴别结核分支杆菌与非结核分支杆菌ＤＮＡ。方法 应用三对具有特异性的寡核苷酸引物，进行多重ＰＣＲ扩增。这三对引物分别对应于分支杆菌６５０００表面抗原、结核分支杆菌插入序列ＩＳ６１１０及人类β－珠蛋白基因的部分序列，其扩增产物分别为３８３ｂｐ、１２３ｂｐ和２６８ｂｐ。结果 此多重ＰＣＲ电泳检测的灵敏度为０．６ｐｇ。经多重ＰＣＲ     

PCR快速克隆猴免疫缺陷病毒核心蛋白基因

SIV为猴艾滋病的病原，其核心蛋白基因保守性强，它编码的27kD蛋白是病毒颗粒的主要结构蛋白，可做为SIV感染的主要诊断依据。我们根据SIV基因序列，设计合成了一对含有两个合适酶切位点的特异性PCR引物；PCR法直接从SIVmac毒株感染的恒河猴外周血淋巴细胞基因组DNA中扩增分离SIV病毒核。心蛋白编码区段，扩增产物经纯化和EcoRI、Sall双酶切后与相同酶切位点的质粒载体pBV220连接，转化大肠杆菌DH52，经巢式PCR快速筛选，获得了SIV核心蛋白基因重组质粒pBVSG；核苷酸序列测定发现了7处碱基点突变，作者分析这是由于SIVmac毒株在中国恒河猴体内感染适应后发生基因突变所致。     

Prevention of HIV-2 and SIV infections in cynomolgus macaques by prophylactic treatment with 3'-fluorothymidine.

The aim of this study was to determine the usefulness of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) for in vivo evaluation of antiviral drugs in monkeys and to study if prophylactic treatment with 3'-fluorothymidine (FLT) could prevent infection against a low challenge dose of HIV-2 or simian immunodeficiency virus (SIV). Protection against infection was assessed by virus isolation and polymerase chain reaction (PCR) on monkey peripheral blood mononuclear cells (PBMC) as well as by antibody and viral antigen assays. Prophylactic treatment with FLT 3 x 5 mg/kg/day, starting 8 h prior to virus inoculation, prevented HIV-2 infection in 3 of 8 monkeys. In another experiment 2 of 4 monkeys resisted 2-10 monkey infectious doses (MID50) of SIV with the same prophylactic treatment. All control animals (HIV-2 n = 8, SIV n = 4) became infected. Thus, FLT treatment prevented HIV-2 and SIV infection in 5 of 12 animals.     

附红细胞体套式PCR方法的建立及其在交叉感染研究中的初步应用

目的建立一种快速、准确检测附红细胞体的套式PCR方法,并在交叉感染研究中初步应用。方法根据Gen-Bank收录的猪附红细胞体16S rRNA基因序列为例,设计两对特异引物,建立套式PCR诊断方法。结果所建立的套式PCR检测方法,具有极高的敏感性和特异性。结论将猪附红细胞体人工感染小白鼠、家兔、犬及鸡,利用所建立的套式PCR进行检测,证明了猪附红细胞体在3种实验动物之间存在交叉感染。     

荧光定量聚合酶链反应检测肺炎支原体方法的建立

目的建立检测肺炎支原体的荧光定量PCR法,并与市售试剂盒和传统巢式PCR法的检测性能进行比较。方法设计针对肺炎支原体社区获得性肺炎呼吸窘迫综合征毒素基因的特异性引物,构建含相应目的片段的质粒作为标准品,采用SYBR Green染料法进行实时定量PCR,并绘制标准曲线。通过检测其他细菌和170例儿童临床咽拭子样本,比较新建荧光定量PCR法、市售试剂盒和传统巢式PCR法在临床应用中的差异。结果新建荧光定量PCR法和巢式PCR法能够检出的肺炎支原体标准株DNA最低模板量为10拷贝,市售试剂盒检出最低模板量为102拷贝。在特异性实验中3种方法均可区分肺炎支原体和其他菌种。在检测的170例儿童临床咽试子样本中,新建荧光定量PCR法、市售试剂盒和传统巢式PCR法的阳性率分别为60.00%、50.00%和53.53%。新建荧光定量PCR法与市售试剂盒的结果具有高度相关性(r=0.953),2种方法的总符合率为86%,Kappa值为0.729。新建荧光定量PCR法与传统巢式PCR法的结果总符合率为90%,Kappa值为0.797。结论新建荧光定量PCR法与市售试剂盒相比灵敏性更高,特异性相同,成本低;与传统巢式PCR法相比操作简单,耗时短且污染少,具有良好的科研和临床应用前景。     

检测肺孢子菌巢式PCR方法的建立及其敏感性和特异性研究

目的建立检测肺孢子菌基因的特异性mtLSU巢式PCR方法,研究其在实验动物肺孢子菌感染模型的检测效果及其敏感性和特异性,以期为临床提供检测肺孢子菌定植或感染的新方法。方法依据肺孢子菌线粒体大亚基保守序列设计巢式PCR内、外引物,建立并优化检测肺孢子菌基因的巢式PCR体系。以免疫抑制诱导肺孢子菌感染大鼠模型为检测对象,比较mtLSU巢式PCR与六亚甲基四胺银（GMS）染色法检测肺孢子菌的阳性率及符合率。对阳性标本进行DNA纯化,构建分子克隆,采用倍比稀释法检测mtLSU巢式PCR的敏感性;以呼吸道感染常见的8种病原体（光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、白色念珠菌、克柔假丝酵母菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、支原体）为对照,检测方法的特异性。结果肺印片GMS染色镜检实验组大鼠,14只查到肺孢子菌包囊,检出率为70.0%（14/20）,对照组检出率为0（0/20）。用mtLSU巢式PCR均能检测实验组大鼠肺孢子菌基因,阳性率为100%（20/20）,对照组均为阴性。mtLSU巢式PCR法阳性率与GMS染色法比较差异有统计学意义（P〈0.05）。敏感性检验结果表明,mtLSU巢式PCR检测最小量为366fg的肺孢子菌基因。特异性检测显示,其他8种呼吸道常见病原体的mtLSU巢式PCR的扩增结果均为阴性。结论成功建立了检测肺孢子菌基因的mtLSU巢式PCR方法,动物模型检测结果表明该方法的敏感性高、特异性强,有望应用于临床患者标本中肺孢子菌的基因检测。     

孕妇及新生儿巨细胞病毒感染的聚合酶链反应及限制酶分析

目的 建立套式-聚合酶链反应（Nested-PCR)加限制性酶切分析方法检测入巨细胞病毒（HCMV）。方法 在HCMV直接早期蛋白EcoRIJ DNA片段内,自行设计两对引物,建立Nested-PCR检测HCMV DNA,同时结合病毒分离检测临床标本。结果 23例新生儿肝炎综合征患儿中,10例病毒分离及Nested-PCR均阳性;1例病毒分离阴性,但Nested-PCR阳性。对58例妊娠早期孕妇血标本进行检测,Nested-PCR阳性率为9%,病毒分离阳性率则为7%。结论 Nested-PCR加限制性酶切分析是一种临床检测HCMV的快速有效手段。     

Recombinant simian immunodeficiency virus expressing green fluorescent protein identifies infected cells in rhesus monkeys

We engineered recombinant derivatives of simian immunodeficiency virus (SIV) to express enhanced green fluorescent protein (EGFP). Replacement of vpr sequences with EGFP resulted in a genome that did not produce detectable levels of replication-competent virus. Replication-competent virus and bright fluorescence of infected cells were obtained with two other constructs, one in which SIV nef sequences were replaced by EGFP and another in which EGFP was inserted into the SIV nef locus and HIV-1 nef sequences were expressed by downstream placement of an internal ribosomal entry site. These strains were infectious in rhesus monkeys and green fluorescing cells were detected in the tissues of infected monkeys by FACS analysis and by direct microscopic visualization. EGFP sequences were absent from recovered virus by 8 weeks following infection. We conclude that recombinant SIV that is engineered to express EGFP can be used to directly detect productively infected cells and aid in the immunophenotypic characterization of these cells within the first 2 weeks of infection of rhesus monkeys.     

Human Cytomegalovirus DNA Is Not Detectable with Nested Double Polymerase Chain Reaction in Healthy Blood Donors

The PCR method was introduced to detect cytomegalovirus (CMV) DNA from 189 peripheral blood samples of volunteer donors. We adopted the nested double PCR method with primers specific for immediate early gene 1 followed by electrophoresis and ethidium bromide staining. This nested double PCR method was sensitive enough to detect approximately a single copy of CMV DNA. However, we failed to obtain positive amplification of CMV DNA from any of these donor samples. In contrast, CMV DNA could be detected in all 3 tested immunocompromised patients who had undergone bone marrow transplantation. These results support our previous report that the frequency of CMV DNA is of an order lower than 1 copy/10⁵ leucocytes in the peripheral blood of healthy seropositive individuals.