共固定化肿瘤坏死因子和干扰素的协同抗癌作用

研究重组人干扰素（IFN-γ）和重组人肿瘤坏死因子（TNF-α）的共固定化对体外培养的人宫颈癌细胞（Hela）生长的影响。利用光固定化方法将IFN-γ、TNF-α共固定在24孔聚苯乙烯培养板（PSt）上，培养Hela细胞，分别设为：共固定（IFN-γ＋TNF-α）、单固定（IFN-γ、TNF-α）、游离（IFN-γ、TNF-α、IFN-γ＋TNF-α）各组培养，研究癌细胞生长抑制曲线，透射电镜、流式细胞仪检测Hela细胞的增殖和凋亡。结果表明共固定化干扰素和人肿瘤坏死因子对Hela细胞的抑制作用显著，最高达82％，显示IFN-γ对TNF-α具有良好的协同抗宫颈癌作用。     

HBV转染对TWEAK诱导凋亡的影响及IFN-γ对凋亡的调节

目的：探讨新型凋亡分子TNF-likeweakinducerofapoptosis(TWEAK)对乙型肝炎病毒(HBV)转染的人肝癌细胞系的凋亡诱导作用及γ-干扰素(IFN-γ)对该凋亡过程的影响。方法:以稳定转染了pCDNA3/1.1HBV的肝癌细胞系BEL-7402-pCDNA3/1.1HBV为模型,并以稳定转染空载体的肝癌细胞BEL-7402/pcDNA3作为对照,经CCK-8法检测HBV转染前后TWEAK对细胞生长的抑制效应,terminaltransferasedUTPnickendlabeling(TUNEL)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性检测试剂盒检测HBV转染前后TWEAK诱导肝癌细胞的凋亡情况及IFN-γ对TWEAK诱导细胞凋亡的调节作用。结果:HBV转染促进TWEAK诱导的细胞凋亡,IFN-γ可以增强HBV转染细胞对TWEAK诱导凋亡的敏感性。结论:机体感染HBV后,TWEAK可能参与HBV感染肝细胞的清除过程;IFN-γ在调节TWEAK诱导的病毒感染细胞凋亡中发挥重要作用。     

槲皮素诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的作用

目的:检测槲皮素体外对人宫颈癌Hela细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用,并探讨线粒体在诱导凋亡机制中的作用.方法:采用酸性磷酸酶法检测细胞增殖抑制率;丫啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)荧光染色观测细胞形态结构变化;流式细胞仪检测线粒体膜电位（△ψm）.结果:槲皮素对人宫颈癌Hela细胞有明显的增殖抑制作用,且呈浓度和时间依赖性.经槲皮素作用48 h后,AO/EB染色可见细胞呈凋亡形态学改变.100 μmol/L槲皮素作用Hela细胞24、48 h后,与对照组相比线粒体膜电位下降.结论:槲皮素体外能抑制人宫颈癌Hela细胞生长,引起线粒体膜电位下降,诱导细胞凋亡.     

肿瘤坏死因子与细胞凋亡

肿瘤坏死因子具有多种生物学活性,其与细胞膜上特异性受体结合后,能诱导某些非肿瘤细胞和大多数肿瘤细胞凋亡,对清除病理状态下机体受损的细胞及杀灭肿瘤细胞,起着重要的作用。ＤＮＡ? 转录和蛋白合成抑制剂可增强其诱导的凋亡效应,其他协同因素也得到进一步的研究     

hTERT启动子驱动的TRAIL诱导宫颈癌细胞的凋亡作用

目的：探讨端粒酶（hTERT）启动子驱动的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）对宫颈癌细胞生长抑制的作用。方法：脂质体转染将hTERT-TRAIL转染至宫颈癌细胞HeLa,RT-PCR检测TRAILmRNA的表达;通过MTT、流式细胞术检测稳定转染细胞的生长情况,电镜观察转染细胞的超微结构。结果：转染真核表达载体hTERT-TRAIL组细胞中TRAILmRNA细胞表达量高于对照组（P〈0.05）;hTERT-TRAIL组细胞对宫颈癌细胞的抑制率高于CMV-TRAIL组和对照组（P〈0.05）;hTERT-TRAIL组细胞对宫颈癌细胞的凋亡率明显高于转染CMV-TRAIL组和对照组（P〈0.01）;电镜结果显示,hTERT-TRAIL对细胞作用是以细胞凋亡为主。结论：hTERT启动子驱动的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对人宫颈癌细胞的生长有明显的抑制作用和诱导凋亡作用,为宫颈癌的研究奠定基础和临床治疗提供思路。     

人截短型凋亡诱导因子的表达对HeLa细胞的促凋亡作用

目的：观察人截短型AIF基因的表达对HeLa细胞的促凋亡作用。方法：用RT-PCR法分段克隆全长人AIF基因，经改造截去其N-端线粒体定位信号及部分Spacer区域（1-120位氨基酸）的编码序列，从而获得人截短型AIF（AIF△1-120）基因。将其克隆入pIRES2-EGFP绿色荧光蛋白（EGFP）共表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过荧光显微镜观察。免疫组织化学检测，间接免疫荧光检测，电镜观察等方法。检测目的基因在转染细胞中的表达，以及对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果：成功地构建了人截短型AIF（AIF△1-120)基因的真核表达载体。转染HeLa细胞后，可检测到人截短型AIF分子的表达，随着转染后时间的延长，可观察到表达人截短型AIF分子的HeLa细胞呈现典型的凋亡特征。结论：人截短型AIF基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡。     

Hsp90抑制TNFα诱导的细胞凋亡及线粒体细胞色素c的释放

目的应用热休克蛋白90(Hsp90)过表达系统探讨Hsp90是否抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的细胞凋亡及线粒体细胞色素c的释放。方法采用电穿孔技术建立稳定过表达Hsp90的细胞克隆,应用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察TNFα和放线菌酮(CHX)诱导的细胞凋亡。应用W estern b lotting方法检测细胞色素c的变化。结果相差显微镜观察Hsp90过表达细胞与对照细胞相比悬浮细胞较少(分别为18%和41%),PBS冲洗后剩余黏附细胞较多。应用共聚焦显微镜进行TUNEL测定结果显示大部分对照细胞发生凋亡,相对较少的Hsp90细胞发生凋亡。W estern b lotting检测Hsp90细胞中细胞色素c的表达与对照组相比明显减少。结论Hsp90过表达抑制TNFα诱导的细胞凋亡及线粒体细胞色素c释放,提示其在凋亡信号传导通路线粒体水平发挥抑制作用。     

GM-CSF对TNF-α诱导白血病细胞凋亡的抑制作用

通过TNFα以及TNFα+GM-CSF对18例白血病患者髓性白血病细胞凋亡的影响研究,发现加TNFα组凋亡细胞数明显高于TNFα+GM-CSF组,两者比较有显著性差异（P<0.01）。本结果提示TNFα有捉进肿瘤细胞凋亡作用,而 GM-CSF则可抑制这种作用。     

超抗原SEB对CD8+T细胞凋亡诱导配体表达的影响

为了探讨超抗原SEB对CD8 T细胞凋亡诱导配体在细胞胞内和膜表面表达的影响,以SEB及PHA刺激PBMC,用免疫荧光染色结合三色流式细胞术,分析比较刺激前后PBMC中CD8 T细胞三种主要的凋亡诱导配体TRAIL、FasL和TNF-α在细胞胞内和膜表面表达的变化.结果表明,SEB上调FasL在CD8 T细胞胞内(34.8%至42.5%)和TRAIL在CD8 T细胞膜表面(7%至20.7%)的表达,SEB还可同时上调TNF-α在CD8 T细胞膜表面(7%至45.7%)及胞内(23.9%至88.7%)的表达.说明SEB能上调不同凋亡诱导配体在CD8 T细胞膜表面或胞内的表达,这可能是SEB影响CD8 T细胞效应功能的方式之一.     

槲寄生凝集素蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究

目的研究从中药槲寄生中制备的槲寄生凝集素蛋白诱导肿瘤细胞凋亡机制。方法用经典的染色技术：流式细胞术、MTT法分析经分子生物学方法分离纯化的槲寄生凝集素蛋白诱导肿瘤细胞凋亡形态特征,AP峰值和抑制肿瘤细胞增殖的抑制率以研究其诱导肿瘤细胞凋亡机制。结果槲寄生凝集素蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡和显著抑制和阻断肿瘤细胞增殖且以Caspase依赖的方式发挥其生物学作用的。结论槲寄生凝集素蛋白具有直接抗肿瘤作用,在肿瘤免疫学的基础和临床应用研究中具有前景。     

吗啡对培养新生大鼠心肌细胞凋亡影响的实验研究

目的利用体外原代培养的新生大鼠心肌细胞，研究吗啡对血清饥饿诱导的心肌细胞凋亡的影响。方法体外原代培养新生大鼠心肌细胞，分组给药后，用MTr法测心肌细胞的活力；用流式细胞仪分析心肌细胞周期；用Annexin V—FITC／PI双标记法测心肌细胞的凋亡率；用Westernblot法测Caspase-3蛋白的表达；用Fura-2双波长荧光法测心肌细胞内游离钙。结果体外原代培养的新生大鼠心肌细胞经无血清饥饿作用48h后，心肌细胞可出现明显的凋亡现象；给予不同浓度的吗啡作用于心肌细胞后，心肌细胞的这种凋亡现象可被抑制，其在1umol·L^-1处最为明显，表现为：心肌细胞凋亡率降低、Caspase-3蛋白表达减少、细胞内Ca^2＋离子浓度降低；给予10umol·L^-1纳洛酮（Naloxone）后，吗啡的这种抑制心肌细胞凋亡作用可被完全阻断；并且给予1umol·L^-1纳曲吲哚（Naltrindole）后，吗啡抑制心肌细胞凋亡的作用亦在一定程度上降低。结论吗啡可激活心肌细胞膜上的阿片受体，对血清饥饿诱导的心肌细胞凋亡具有抑制作用，且可被Naloxone阻断。     

恒磁场对金属离子钻、铬作用下人单核细胞分泌肿瘤坏死因子和细胞凋亡的影响

目的 探讨恒磁场对金属离子钴、铬作用下人外周血单核细胞分泌肿瘤坏死因子的影响,并探讨其对细胞凋亡的动态变化与Caspase-3活性的影响.方法 将CoCl2粉末与CrCl3粉末溶于无菌注射用水配制成CoCl2溶液和CrCl3溶液,从健康人外周血提取单核细胞,将金属离子Co2+Cr3+分别与人单核细胞在不同的磁场强度(10Gs、100Gs、1000Gs)下共培养.实验分8组:Co2+Cr3+组(对照组)、Co2+、Cr3+分别+不同磁场强度(10Gs、100Gs、1000Gs)组,各组细胞于培养12、24、48小时用ELISA法检测上清液中肿瘤坏死因子(TNF-a)的含量:脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况,比色法测定Caspase-3酶活性.结果 经磁场暴露12h之后,各磁场处理组TNF-a量均低于非磁场处理组(P＜0.05),并呈现强度时间依赖性.在100Gs和1000Gs磁场处理组,细胞凋亡率显著高于对照组(P＜0.05),并随着磁场强度的逐渐增大,Caspase-3酶活性逐渐增强.而10Gs磁场组对细胞凋亡及Caspase-3酶活性的改变无明显影响(P＞0.05).结论 一定强度的恒磁场町拮抗金属离子钴、铬刺激人外周血单核细胞分泌TNF-a并且促进其凋亡,为磁场疗法防治假体周围骨溶解提供了理论依据.     

化学合成2’-氧-甲基鸟嘌呤核苷(P6)诱导HeLa细胞凋亡及其机制的研究

研究化学合成2’-氧-甲基鸟嘌呤核苷(P6)在体外诱导HeLa细胞凋亡的作用,观察其是否同天然提取的P6具有相同的抗肿瘤作用。首先采用形态学观察、MTT实验及流式细胞术的方法观察P6对HeLa细胞的增殖抑制作用。然后采用DNA Ladder检测、流式细胞术、RT-PCR技术及化学发光检测技术观察P6对HeLa细胞的促凋亡作用。结果表明,化学合成的P6可以抑制HeLa细胞的增殖,机制是由于细胞被阻滞于S期。化学合成的P6也可以促进HeLa细胞的凋亡,其机制在于下调了抗凋亡基因Bcl-2的转录,并促进了Caspase-3的激活。因而化学合成的P6有望成为一种新的抗肿瘤药。     

柯萨奇病毒B3通过caspase依赖途径诱导HeLa细胞凋亡

目的 评价柯萨奇病毒B3（CVB3）致HeLa细胞死亡的方式及分子机制。方法 用CVB3作用于HeLa细胞,在不同时间收集细胞,通过相差显微镜、电子显微镜、流式细胞仪以及分子生物学手段,HeLa细胞的病变及caspase-3基因mRNA和蛋白质的表达。结果 CVB3作用于HeLa细胞后,细胞很快发生变性和坏死,24h后较多细胞凋亡;caspase基因在病毒作用早期即被活化,表现在caspase-3 mRNA在病毒作用后6h内,迅速增高达峰值。在24h内,又降至接近病毒作用前的水平。caspase-3蛋白表达在42h内逐渐增高。结论CVB3可诱导HeLa细胞发生坏死和凋亡两种反应,坏死早于凋亡,细胞凋亡与caspase-3的表达密切相关。     

Targeting enteroviral 2A protease by a 16-mer synthetic peptide: Inhibition of 2A-induced apoptosis in a stable Tet-on HeLa cell line

Enteroviridae such as coxsackievirus are important infectious agents causing viral heart diseases. Viral protease 2A (2A^pro) initiates the virus life cycle, and is an excellent target for developing antiviral drugs. Here, to evaluate the validity of the 2A^pro as a proper therapeutic target, and based on the existing information and molecular dynamics, a 16-mer peptide was designed to specifically target the active site of protease 2A^pro in order to block the activity of CVB3 2A^pro. We showed that the peptide could compete with endogenous substrate in a concentration-dependent manner. Further, we established a HeLa cell line that expressed 2A^pro. Expression of 2A^pro resulted in significant morphological alteration and eventual cell death. Western blot and viability assay showed that the 16-mer peptide (200 μg/ml) could significantly block 2A^pro activity and its cytotoxic effect. Future modification of the 16-mer peptide can improve its affinity for 2A^pro and therefore develop effective antiviral drug.     

Neural Cell Apoptosis Induced by Microwave Exposure Through Mitochondria-dependent Caspase-3 Pathway

To determine whether microwave (MW) radiation induces neural cell apoptosis, differentiated PC12 cells and Wistar rats were exposed to 2.856GHz for 5min and 15min, respectively, at an average power density of 30 mW/cm². JC-1 and TUNEL staining detected significant apoptotic events, such as the loss of mitochondria membrane potential and DNA fragmentation, respectively. Transmission electron microscopy and Hoechst staining were used to observe chromatin ultrastructure and apoptotic body formation. Annexin V-FITC/PI double staining was used to quantify the level of apoptosis. The expressions of Bax, Bcl-2, cytochrome c, cleaved caspase-3 and PARP were examined by immunoblotting or immunocytochemistry. Caspase-3 activity was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay. The results showed chromatin condensation and apoptotic body formation in neural cells 6h after microwave exposure. Moreover, the mitochondria membrane potential decreased, DNA fragmentation increased, leading to an increase in the apoptotic cell percentage. Furthermore, the ratio of Bax/Bcl-2, expression of cytochrome c, cleaved caspase-3 and PARP all increased. In conclusion, microwave radiation induced neural cell apoptosis via the classical mitochondria-dependent caspase-3 pathway. This study may provide the experimental basis for further investigation of the mechanism of the neurological effects induced by microwave radiation.     

感染柯萨奇病毒B3诱导人心肌纤维细胞因子的产生

目的：CVB3感染可导致严重的心脏病，其机制尚不清楚，细胞因子可能有重要作用，但确切来源细胞尚不清楚，心肌纤维细胞是主要间质分子，感染CVB3后检测其细胞因子的产生。方法：采用ELISA方法检测了感染CVB3心肌纤维细胞培养上清液IL－6、IL－8、IL－1α、IL－1β和TNF－α的产生，结果：发现感染CVB3 24小时后IL－6和IL－8即明显升高（P＜0．01），96小时后IL－1α有所升高（P＜0．05），IL－1β和TNF－α无明显变化，结论：IL－6、IL－8、IL－1α在CVB3心肌炎中可能有一定作用。     

利拉鲁肽对缺氧诱导的心肌细胞凋亡蛋白Caspase-3和Bcl-2表达的影响

目的 检测胰高血糖素样肽-利拉鲁肽对氯化钴(cobalt chloride, CoCl2)诱导缺氧条件下的心肌细胞中凋亡蛋白Caspase-3和Bcl-2表达量的影响.方法 将原代培养的心肌细胞分为6组:空白对照组,CoCl2诱导化学缺氧组,缺氧+不同剂量利拉鲁肽处理组(1、10、100、1000nmol/L利拉鲁肽).结果 缺氧能诱导心肌细胞中凋亡蛋白Bcl-2表达的增高并抑制Caspase-3蛋白的表达(P<0.05);利拉鲁肽能抑制缺氧诱导的心肌细胞中凋亡蛋白Caspase-3的表达并增加Bcl-2的表达,且利拉鲁肽对凋亡蛋白的影响具有剂量依赖性.结论 利拉鲁肽抑制缺氧诱导的心肌细胞中凋亡蛋白Caspase-3的表达,并促进凋亡蛋白Bcl-2的表达.     

Apoptosis of Merkel cells in neurotrophin-3 null mice

Postnatal mice lacking neurotrophin-3 (NT3) are deficient in Merkel cells of touch domes and whisker follicles. We examined the mechanism of Merkel cell loss by immunocytochemistry and electron microscopy. Merkel cell of whisker follicles of NT3 null newborns exhibited decreased immunoreactivity for cytokeratin 8 and contained apoptotic bodies that were positive for cleaved caspase-3, a marker of active apoptosis. By electron microscopy, the Merkel cells displayed aggregation of chromatin along the nuclear membrane, with the marginated chromatin forming caps at the periphery of the nucleus. Ribosomes aggregated in the cytoplasm, while dense core granules characteristic of Merkel cells were still discernible. Finally, the Merkel cells and their nuclei fragmented into apoptotic bodies. None of the apoptotic Merkel cells were contacted by nerve fibers, and their desmosomal contacts with surrounding keratinocytes disappeared. After postnatal day 6 apoptotic Merkel cells were no longer observed, and the number of surviving Merkel cells was severely reduced. They were flat and contained few osmiophilic granules. We conclude that perinatal apoptosis is responsible for the loss of Merkel cells lacking innervation in NT3 null mice.