新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养及鉴定

目的从新生大鼠大脑皮质中分离、培养并鉴定星形胶质细胞。方法分离出生1-3d的大鼠大脑皮质细胞加入含有10％马血清、10％小牛血清以及10ng／mL EGF的MEM培养基培养，于第3-4周将细胞固定后采用免疫细胞化学技术检测特异性星形胶质细胞抗原GFAP的表达。结果从新生大鼠大脑皮质分离的细胞生长旺盛。星形胶质细胞形态典型，并表达星形胶质细胞特异性抗原GFAP，未见其他种类细胞生长。结论笔者建立了一种简单、可靠的大鼠星形胶质细胞的体外培养方法，为应用胶质细胞饲养层与其他细胞联合培养奠定了基础。     

ASK1在损伤的大鼠脊髓星形胶质细胞增生中的作用

目的 探讨细胞凋亡信号调节蛋白1 (ASK1)在损伤的大鼠脊髓星形胶质细胞增生中的作用.方法 原代培养得到高纯度(＞96％)大鼠脊髓星形胶质细胞,建立星形胶质细胞损伤模型.星形胶质细胞损伤后立即给予生理盐水(损伤模型组)、ASK1特异性抑制剂(Trx组)、ASK1特异性抗体(抗体中和组)处理;对照组为原代大鼠脊髓星形胶质细胞,不作任何处理.应用蛋白质印迹法检测星形胶质细胞标志蛋白胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和波形蛋白(Vimentin)的表达情况,应用免疫荧光标记技术检测星形胶质细胞划痕宽度的变化,应用CCK-8法检测星形胶质细胞增殖活性.结果 损伤后24 h及72 h损伤模型组GFAP和Vimentin蛋白的表达均显著高于对照组、Trx组和抗体中和组(P＜0.01);损伤后24 h及72 h损伤模型组星形胶质细胞划痕平均宽度明显小于对照组、Trx组和抗体中和组(P＜0.01);损伤后12h、24 h、72 h对照组、Trx组和抗体中和组星形胶质细胞增殖活性明显低于损伤模型组(P＜0.05).结论 大鼠脊髓星形胶质细胞损伤后阻断ASK1可抑制其细胞增生.     

鞘内注射经外源性BDNF活化的星形胶质细胞对正常大鼠痛觉的影响

目的探讨外源性脑源性神经营养因子(BDNF)对星形胶质细胞的活化作用,分析活化的星形胶质细胞鞘内注射与正常大鼠痛觉过敏的关系。方法体外培养的原代星形胶质细胞以外源性BDNF(100 ng/mL)分别孵育0(基线)、15、60、120 min,Western blotting检测细胞内纤丝酸性蛋白(GFAP)的表达。24只雄性SD大鼠经鞘内置管后随机分为活化细胞注射组(鞘内注射经BDNF孵育15 min的星形胶质细胞)、阴性对照组(鞘内注射未经BDNF孵育的星形胶质细胞)、安慰剂注射组(鞘内注射PBS)和空白对照组(未行鞘内注射),每组6只;分别于单次注射前和注射后0.5、2、4和8 h时间点,von Frey纤维丝法测定各组大鼠50%机械痛缩足阈值(50%PWT)。结果经BDNF孵育15、60和120 min的星形胶质细胞内GFAP蛋白表达均显著高于基线值(P0.01)。活化细胞注射组大鼠注射后各时间点的50%PWT均较注射前显著降低(P0.01);阴性对照组大鼠50%PWT仅在注射后30 min时间点呈现一过性下降,与注射前比较差异有统计学意义(P0.01);安慰剂注射组和空白对照组大鼠注射前和注射后各时间点50%PWT比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论外源性BDNF可活化体外培养的星形胶质细胞,鞘内注射经外源性BDNF活化的星形胶质细胞可直接诱发正常大鼠的痛觉过敏。     

Effects of intrathecal injection of exogenous BDNF-activated astrocytes on pain sensation of normal rats

目的 探讨外源性脑源性神经营养因子(BDNF)对星形胶质细胞的活化作用,分析活化的星形胶质细胞鞘内注射与正常大鼠痛觉过敏的关系.方法 体外培养的原代星形胶质细胞以外源性BDNF (100 ng/mL)分别孵育0(基线)、15、60、120 min,Western blotting检测细胞内纤丝酸性蛋白(GFAP)的表达.24只雄性SD大鼠经鞘内置管后随机分为活化细胞注射组(鞘内注射经BDNF孵育15 min的星形胶质细胞)、阴性对照组(鞘内注射未经BDNF孵育的星形胶质细胞)、安慰剂注射组(鞘内注射PBS)和空白对照组(未行鞘内注射),每组6只;分别于单次注射前和注射后0.5、2、4和8h时间点,von Frey纤维丝法测定各组大鼠50％机械痛缩足阈值(50％ PWT).结果 经BDNF孵育15、60和120 min的星形胶质细胞内GFAP蛋白表达均显著高于基线值(P＜0.01).活化细胞注射组大鼠注射后各时间点的50％ PWT均较注射前显著降低(P＜0.01);阴性对照组大鼠50％PWT仅在注射后30 min时间点呈现一过性下降,与注射前比较差异有统计学意义(P＜0.01);安慰剂注射组和空白对照组大鼠注射前和注射后各时间点50％ PWT比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 外源性BDNF可活化体外培养的星形胶质细胞,鞘内注射经外源性BDNF活化的星形胶质细胞可直接诱发正常大鼠的痛觉过敏.     

肿瘤坏死因子致惊厥大鼠海马胶质原纤维酸性蛋白的变化

目的 观测肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α,TNFα)致惊厥大鼠海马星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达的变化。方法 正常SD大鼠侧脑室注射TNFα(500ng),观察大鼠行为学表现及海马脑电图的变化,应用免疫组织化学ABC法观察大鼠海马胶质细胞的形态学改变及GrrAP的表达情况。结果 ①TNFα注射后10～30min大鼠出现Ⅱ～Ⅲ级癫痫样发作,可持续达2h;②大鼠海马脑电图呈现阵发性痫样放电;③侧脑室注射TNFα2h,注射侧海马槽星形胶质细胞首先呈现激活反应,随后整个海马结构呈现胶质细胞功能活跃的形态学表现;GF、AP-IR阳性细胞胞体增大,分枝突起增粗、增多,GFAP的表达水平显著上调,1周后与生理盐水对照组比较无显著性差异。结论 侧脑室注射外源性TNFα可引起大鼠癫痫样发作,此条件下海马星形胶质细胞GFAP表达上调。     

嗅鞘细胞对活化的星形胶质细胞的作用

目的:研究体外培养的大鼠嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell,OEC)对活化的星形胶质细胞(astrocytes,AST)的作用.方法:体外培养嗅鞘细胞和星形胶质细胞.星形胶质细胞经纯化传代,细胞融合后利用划伤法得到活化的星形胶质细胞,将嗅鞘细胞与活化的星形胶质细胞共培养24 h后,观察星形胶质细胞增殖能力的改变,以及其表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)的变化.结果:活化的星形胶质细胞与嗅鞘细胞共培养后,MTT实验表明其增殖能力增强;免疫荧光染色、RT-PCR和蛋白质印迹法测定结果表明共培养后活化的星形胶质细胞表达的GFAP和CSPG降低.结论:嗅鞘细胞作用于活化后的星形胶质细胞以后,能够促进星形胶质细胞的分裂增殖,同时能够减少星形胶质细胞胶质化,降低抑制性细胞因子的表达.     

缺氧条件下谷氨酸对鼠脑星形胶质细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的观察谷氨酸在缺氧条件下对星形胶质细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法原代培养SD大鼠星形胶质细胞,传代后分为4组:①对照组;②谷氨酸组(1μmol/L);③缺氧组;④缺氧+谷氨酸组。缺氧条件为:(94%N2,5%CO2和1%O2),每组包括6个时相点:0、2、4、6、8、12h(以缺氧后开始计时),②和④组加入1μmol/L的谷氨酸。在不同时间点提取细胞总RNA,用Real time FQ-PCR法检测VEGF mRNA表达变化;ELISA法检测培养上清液VEGF蛋白表达变化。结果对照组和谷氨酸组(1μmol/L)各实验时相点星形胶质细胞VEGF mRNA和蛋白表达无明显变化。而缺氧组和缺氧+谷氨酸组VEGF mRNA和蛋白表达却随实验时相逐步增高,分别在6和8h达最高,之后渐下降。缺氧+谷氨酸组VEGF mRNA和蛋白表达上调较单纯缺氧组更为显著。结论谷氨酸(1μmol/L)可在缺氧条件下增强星形胶质细胞VEGF mRNA和蛋白表达上调,这可能与缺氧状态下星形胶质细胞表面谷氨酸受体的表达变化有关。     

严重烫伤后脑内GFAP表达变化与血脑屏障功能的关系

目的:探讨严重烫伤后星形胶质细胞的形态学变化、GFAP表达与血脑屏障功能的关系。方法:建立严重烫伤大鼠模型。健康SD大鼠,随机分为正常组,假烫伤组,烫伤组,烫伤后又设3、6、12、24、48h5个时间点,用透射电镜观察血脑屏障超微结构变化;紫外分光光度计检测脑伊文蓝含量。免疫组化观察脑GFAP表达。结果:烫伤后星形胶质细胞线粒体肿胀、空泡化,胶质细胞有凋亡期表现。脑EB含量明显增高,GFAP表达增加(P<0.01)。结论:严重烫伤后星形胶质细胞活化、GFAP表达增加与血脑屏障通透性增高有关,提示GFAP在严重烫伤早期血脑屏障的损伤中起重要作用。     

右美托咪定对LPS诱导星形胶质细胞MCP-1分泌的影响

目的 研究右美托咪定对脂多糖(LPS)诱导大鼠星形胶质细胞MCP-1 mRNA分泌的影响.方法 培养原代大鼠星形胶质细胞,待诱导分化成熟,免疫组化检测α-2A肾上腺受体的表达;不同浓度LPS刺激星形胶质细胞,观察LPS浓度与MCP-1 mRNA表达的量效关系;随后将细胞随机分为6组:对照组(control组)、LPS(200 ng/ml)刺激组(LPS组)、右美托咪定(DEX)500 ng/ml孵育组(DEX组)、DEX(10、100、500 ng/ml)+LPS(200 ng/ml)组[DEX(10、100、500 ng/ml)+LPS组],荧光实时定量PCR检测各组MCP-1 mRNA的表达.结果 α-2A肾上腺受体在星形胶质细胞表达,与细胞标志物GFAP完全共标;不同浓度LPS刺激可引起MCP-1剂量依赖性的表达增加(F(6,41)=289.35,P<0.001),LPS刺激引起MCP-1 mRNA表达量增加的ED50为150.8 ng/ml,ED95为344.1 ng/ml,r=0.86;与LPS组相比,不同浓度右美托咪定均可抑制LPS刺激引起的星形胶质细胞MCP-1 mRNA升高(F(5,21)=454.15,P<0.001).结论右美托咪定可抑制LPS刺激大鼠星形胶质细胞MCP-1 mR-NA的表达,该作用可能是其减轻疼痛的机制之一.     

肝细胞生长因子对星形胶质细胞缺氧缺糖损伤的影响

目的：研究肝细胞生长因子(HGF)对缺氧、缺糖诱导的星形胶质细胞（As）损伤及凋亡的影响。方法：以缺氧、缺糖来诱导原代培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞损伤。用不同终浓度（20～100ng/mL）的HGF处理星形胶质细胞,以乳酸脱氢酶（LDH）漏出率作为细胞损伤指标,四甲基偶氮唑盐（MTT）还原试验检测细胞活力,流式细胞术检测凋亡细胞,透射电镜观察细胞超微结构。结果：缺氧缺糖引起LDH漏出率增高,细胞活力下降,细胞凋亡率增高。HGF处理后,LDH漏出率降低,细胞活力增高,同时细胞凋亡率降低（P＜0.05）,最大效应剂量为60ng/mL。结论： HGF对星形胶质细胞缺氧缺糖损伤具有保护作用,能减少星形胶质细胞凋亡,并呈一定的剂量依赖关系。     

TNP-470对肺腺癌细胞诱导的血管内皮细胞增殖和凋亡的影响及其与Flk-1表达的关系

目的：探讨TNP-470对肿瘤细胞诱导的血管内皮细胞增殖和凋亡的影响及其与血管内皮生长因子(VEGF)受体酪氨酸激酶受体（Flk-1）的关系。方法：培养肺腺癌AGZY-82A细胞株，并制备条件培养液，加入培养的血管内皮细胞，用免疫组化S-P法检测TNP-470对癌细胞诱导后内皮细胞增殖细胞核抗原（PCNA）、p53和VEGF受体Flk-1表达的影响。结果：TNP-470能抑制癌细胞诱导的内皮细胞表达PCNA，当TNP-470的浓度达10^3ng/ml，细胞增殖几乎停止；而凋亡相关基因蛋白p53的表达逐渐增加；并且TNP-470以剂量依赖方式抑制内皮细胞Flk-1的表达，当TNP-470浓度达10^4ng/ml时，Flk-1的表达几乎完全受到抑制。结论：TNP-470可以通过阻止肿瘤细胞诱导的内皮细胞表达VEGF受体，抑制内此细胞的增殖，促进其凋亡，而达到体内抑制肿瘤生长和转移的作用。     

Ad-hNGFβ转染原代培养的大鼠脊髓星形胶质细胞及其生物活性研究

目的:体外培养新生SD大鼠脊髓星形胶质细胞,观察携带人β神经生长因子基因的重组腺病毒(Ad-hNGFβ)对其存活及毒性作用,为Ad-hNGFβ在体研究打下基础。方法:分离新生SD大鼠的脊髓星形胶质细胞(Astrocyte,Ast),应用DMEM/F-121∶1培养基进行原代培养扩增鉴定。重组Ad-hNGFβ(MOI=25,50,100)转染Ast后,噻唑蓝(MTT)法检测病毒感染滴度与细胞存活的关系。ELISA方法测定培养3,6,9,12,15d时培养上清中hNGFβ的含量;用流式细胞仪对转染细胞进行倍体分析,观察转染Ad-hNGFβ对细胞周期和凋亡的影响;Western blot印迹法测定转染后表达产物的存在形式。结果:从新生SD大鼠的脊髓组织中成功分离培养出星形胶质细胞,GFAP免疫荧光阳性。经MTT法测定,当MOI=25,50,100时试验组的吸光值OD490与对照组比无显著差异,P>0.05。转染Ad-hNGFβ后试验组细胞培养上清中hNGFβ表达量与对照组同期相比有显著差异,P<0.01;且hNGFβ可持续表达至15d。Ad-hNGFβ转染细胞后所表达的活性产物以hNGFβ二聚体的形式存在。流式细胞仪测得细胞增殖指数与对照组比明显升高,P<0.01。结论:Ad-hNGFβ可有效介导hNGFβ基因转染原代培养的脊髓星形胶质细胞,并且成功表达有活性的hNGFβ,增加细胞活性。     

低氧对人脐带间充质干细胞活性和内皮分化能力的影响及VEGF的干预作用

目的: 探讨低氧对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的活性及向内皮细胞分化能力的影响,并进一步探索外源性VEGF对低氧损伤的保护作用。方法: 在体外对hUC-MSCs进行分离培养。对hUC-MSCs的形态学和表型特征进行分析。在添加/不添加50 ng/mL VEGF的情况下,对hUC-MSCs分别进行不同时间的低氧诱导后,对细胞凋亡率、ROS生成及细胞增殖能力进行检测,并对hUC-MSCs的内皮分化能力进行评估。结果: 低氧诱导早期(6, 12 h),hUC-MSCs的凋亡及ROS生成显著增加,增殖能力显著下降;晚期(24,72 h),细胞的增殖及凋亡水平与对照组间无明显差异;高浓度(50 ng/mL)外源性VEGF抑制低氧诱导早期出现的凋亡增加及增殖下降;外源性VEGF存在的情况下,低氧诱导14 d,hUC-MSCs表达早期内皮细胞表型,并能获得部分内皮细胞功能。结论: 低氧早期造成hUC-MSCs急性损伤,晚期通过逐步适应恢复细胞活性并保持了其分化潜能。VEGF能够保护急性缺氧对细胞的损伤,并能诱导其向内皮样细胞分化。     

星形胶质细胞条件培养液对缺氧损伤神经元的影响

目的分析星形胶质细胞(Ast)与腺苷对缺氧/复氧损伤神经元的保护作用,揭示腺苷对神经系统的保护机制。方法体外培养SD大鼠大脑皮层Ast和海马神经元及大脑皮层神经元,纯化后给予神经元缺氧/复氧处理,收集复氧18 h后的Ast条件培养液(ACM)和腺苷预处理的Ast条件培养液(ACMa),然后用ACM、ACMa及ACM+腺苷(ACM+含100μmol·L-1腺苷的DMEM液)以15的浓度培养缺氧损伤神经元;光镜观察神经元形态学变化,二甲氧唑黄比色法测定细胞活性。结果 ACMa组、ACM+腺苷组及ACM组的神经元缺氧损伤后的细胞形态较模型组得到明显改善,细胞活性较模型组也得到显著提高。不同条件培养液对缺氧/复氧后神经元活性的作用:ACMa>ACM+腺苷>ACM。结论 Ast条件培养液对缺氧/复氧损伤的神经元有重要的保护、修复作用,腺苷可通过Ast间接地保护和修复受损神经元。     

大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠脊髓组织星形胶质细胞体外培养、纯化和鉴定的方法。方法:于无菌条件下取新生1~2 d的SD大鼠脊髓组织,采用机械吹打及胰酶消化法制成细胞悬液,通过差速贴壁和恒温摇床震荡去除杂细胞,进行培养。用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色对所培养的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态,传至第3代细胞纯度达95%以上。结论:成功建立了大鼠脊髓星形胶质细胞体外培养方法,为脊髓星形胶质细胞的实验研究奠定基础。     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法建立及鉴定

目的：纯化和鉴定体外培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞.方法：取1~3天新生大鼠大脑皮层细胞进行体外培养,通过差速贴壁和传代去除成纤维细胞和神经元等,采用免疫组化法检测星形胶质细胞特异性蛋白—胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）鉴定星形胶质细胞.结果：培养的细胞具有典型的星形胶质细胞形态且生长旺盛,第3代95%以上为星形胶质细胞,特异性抗原GFAP表达阳性.结论：该方法操作简单,可靠,是一种有效的新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法.     

两种体外培养星形胶质细胞的比较

目的 对2种常用培养方法得到的星形胶质细胞进行生物学功能上的比较分析。方法 用啮齿类新生儿大脑星形胶质细胞分离培养方法培养原代星形胶质细胞,用胎牛血清分化神经干细胞制备分化星形胶质细胞。显微镜下观察2种星形胶质细胞的细胞形态并用免疫荧光染色检测星形胶质细胞特异性标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达量,10种细胞因子处理2种细胞后检测GFAP等的变化,用表达谱芯片检测GFAP、谷氨酸合成酶(GS)、转运蛋白(xCT)、神经调节蛋白-1(NRG)、谷氨酸受体蛋白(NMDA)、脂蛋白脂肪酶(LPL)等基因的表达并进行比较。结果 2种星形胶质细胞形态和GFAP表达量不同,表达谱芯片检测结果显示原代星形胶质细胞GFAP、GS、xCT、NRG、NMDA、LPL基因的表达均显著高于分化星形胶质细胞。10种细胞因子的处理均不能使原代星形胶质细胞GFAP表达升高,但转化生长因子-β(TGF-β)可以使分化的星形胶质细胞GFAP表达升高。结论 与分化的星形胶质细胞相比,原代培养的星形胶质细胞更类似于反应态星形胶质细胞,而TGF-β可促进分化细胞向反应态细胞过渡。     

ATP刺激培养脊髓背角星形胶质细胞P2X7受体表达上调

目的观察体外培养的脊髓背角星形胶质细胞P2X1-7受体表达，以及不同浓度三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）对P2X1-7受体及胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表达的影响。方法培养并纯化脊髓背角星形胶质细胞，采用免疫组织化学染色观察P2受体表达。随后在无血清培养条件下，加入不同浓度ATP（100μM，500μM，1mM，2mM）作用24h后，观察脊髓背角星形胶质细胞P2X1-7受体表达及GFAP表达的变化。对照组加入0．01M PBS处理24h。IPP图象分析软件得到P2X受体以及GFAP阳性细胞平均光密度。结果体外培养的大鼠脊髓背角星形胶质细胞表达P2X1，P2X2，P2X4，P2X5，P2X6和P2X7受体；在ATP（100μM，500μM，1mM，2mM）作用下，P2X1，P2X2，P2X4，P2X5，P2X6受体表达未见明显变化，而P2X7受体和GFAP表达逐渐上调，并具量效关系。结论体外培养的大鼠脊髓背角星形胶质细胞表达P2X1，P2X2，P2X4，P2X5，P2X6和P2X7受体，而ATP可以诱发星形胶质细胞GFAP及P2X7受体表达上调，这一结果提示，其中P2X7可能参与脊髓背角星形胶质细胞活性的调节。     

缺氧对体外培养的大鼠脑星形胶质细胞存活的影响

目的 研究缺氧对体外培养的大鼠星形胶质细胞活性及损伤的影响,确定星形胶质细胞体外培养的最佳缺氧时间点以对其进行深入研究。方法 体外培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞,纤维酸性蛋白免疫荧光染色鉴定。通以5%CO₂+95%N₂混合气体造成缺氧,分别观察缺氧不同时间段星形胶质细胞光镜下的形态变化,死亡细胞数目,培养上清液的氧分压、葡萄糖和乳酸盐的浓度及乳酸脱氢酶(LDH)活性的变化。结果 星形胶质细胞在缺氧条件下,随着时间延长,细胞逐渐出现肿胀、漂浮和坏死。与对照组相比,缺氧10h组死亡细胞数、葡萄糖和乳酸盐的浓度及乳酸脱氢酶(LDH)活性的变化均有明显差异(P<0.05),且与缺氧时间呈正相关,其中缺氧组细胞培养上清液中葡萄糖浓度比对照组明显降低,而乳酸盐浓度和LDH活性则明显升高,而缺氧8h组虽然葡萄糖和乳酸盐的浓度及LDH活性的变化明显,但星形胶质细胞保存着多突触的形态。结论 缺氧可致体外培养的鼠脑星形胶质细胞损伤甚至死亡,缺氧8h可作为以体外培养的鼠脑星形胶质细胞为研究对象的缺氧生物学研究的最佳时间点。