肝癌干细胞标志物及细小病毒H-1非结构蛋白NS-1对肝癌干细胞生长的影响

目的:研究肝癌细胞系SMMC7721肿瘤干细胞表面标志物,探讨细小病毒H-1非结构蛋白NS-1对肝癌细胞的生长抑制作用,以及其对肝癌细胞中具有干细胞特性群体的影响。方法:用流式细胞仪将肝癌细胞按细胞表面标志CD133、CD44进行分离,分为CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-4个群体,采用脂质体法将细小病毒H-1非结构蛋白NS-1质粒转染入人肝癌细胞SMMC7721,采用G418筛选稳定转染的细胞克隆,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞NS-1基因的表达。流式细胞仪分析SMMC7721转染前后肿瘤干细胞表面标志CD133、CD90、CD44的表达和细胞生长周期,检测细胞群体的变化。以裸鼠成瘤实验和软琼脂克隆形成实验评价具肿瘤干细胞性质的肝癌细胞表面标志物以及细小病毒H-1非结构蛋白NS-1转染对肝癌细胞生长的影响。结果:肝癌SMMC7721细胞分成CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-4组亚群的细胞存在着异质性,4组亚群细胞中均有少数肿瘤干细胞样细胞能在软琼脂上形成克隆,其中CD133+CD44+、CD133+CD44-亚群克隆形成率分别为3.5%和1.8%,CD133-CD44+、CD133-CD44-亚群克隆形成率为0.7%和0.5%。转染细小病毒H-1非结构蛋白NS-1后,4组亚群细胞克隆的形成率都显著下降。裸鼠成瘤实验提示,CD133+表型的细胞成瘤能力强于CD133-表型细胞,CD133-CD44+亚群细胞成瘤能力最弱。流式细胞仪分析显示转染NS-1后,CD133+群体细胞被明显抑制,由31.9%下降至6.3%,而CD90+和CD44+的表达未出现改变;转染NS-1后细胞S期百分率明显下降。结论:肝癌细胞表型为CD133+CD44+和CD133+CD44-亚群中富含肝癌干细胞,转染细小病毒H-1非结构蛋白基因NS-1的部分亚群SMMC7721细胞生长被抑制,提示其对肝癌细胞株中具有干细胞特性的CD133+群体有一定的抑制效应。     

干细胞样细胞在不同乳腺癌细胞系的标记研究

目的:观察不同乳腺癌细胞系中干细胞样细胞的分布特点.方法:采用免疫细胞化学双染法,检测乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-468、MDA-MB-231中干细胞样细胞标志MUC-1/ESA、CD44/CD24的表达情况.结果:MCF-7细胞系MUC-1-/ESA+细胞的表达率为100%、CD44+/CD24-为2%:MDA-MB-468细胞系MUC-1-/ESA+细胞的表达率为35%、CD44+/CD24-为5%;MDA-MB-231细胞系MUC-1-/ESA+细胞的表达率为1%、CD44+/CD24-为85%.结论:不同乳腺癌细胞系可能具有不同的干/祖细胞体系.     

Oct4和Nanog在胰腺癌干细胞中表达的研究

目的:研究Oct4和Nanog基因在人胰腺癌细胞系及干细胞中的表达情况.方法:用流式细胞仪,以CD44+CD24+和CD44+CD24+ESA+为表面标记,在胰腺癌Panc-1细胞中分选肿瘤干细胞,RT-PCR、定量PCR及免疫荧光法检测肿瘤干细胞中Oct4、Nanog基因的表达情况.结果:分选出的胰腺癌CD44+CD24+细胞约占细胞总量的1%～3%,CD44+CD24+ESA+约占细胞总量的0.1%～0.8%,Oct4及Nanog基因在两种分选出的细胞中表达均高于未分选细胞,在CD44+CD24+ESA+细胞中的表达高于CD44+CD24+细胞.结论:干细胞相关基因Oct4、Nanog高表达于胰腺癌干细胞中,其表达量与干细胞纯度成正相关.     

5,7-二甲氧基黄酮抑制人胰腺癌PANC-1细胞系胰腺癌干细胞特性的体外研究

[目的]探讨5,7-二甲氧基黄酮(DMF)对人胰腺癌干细胞特性的影响.[方法]体外培养人胰腺癌PANC-1细胞系得到微球细胞,流式细胞仪检测;划痕法分析不同浓度DMF对胰腺癌干细胞自我更新、体外细胞迁移和运动能力影响;Western Blot分析不同浓度DMF干预后PANC-1细胞系胰腺癌干细胞表面标志物CD133、CD44、ALDH1、Bmil、E-cad、N-cad蛋白表达变化.[结果]DMF以浓度依赖方式抑制人胰腺癌PANC-1细胞系胰腺癌干细胞肿瘤球形成能力及抑制细胞体外迁移能力;DMF以浓度依赖方式使胰腺癌干细胞标志物CD133、CD44、ALDH1、Bmi1、N-cad蛋白表达水平降低,而E-cad蛋白水平升高.[结论]DMF以浓度依赖方式显著抑制人胰腺癌PANC-1细胞系胰腺癌样干细胞自我更新、分化后细胞迁移、细胞标志物CD133、CD44、ALDH1、Bmi1、N-cadherin蛋白表达,而增强E-cadherin蛋白表达.     

小鼠骨髓间充质干细胞对脾细胞免疫反应的影响

目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞(mMSC)对脾细胞免疫反应性增殖的作用及机制.方法 分别采用有丝分裂原刀豆球蛋白A(ConA)(20 μg/ml)和异基因抗原(异基因小鼠脾细胞)作为刺激因素,观察不同比例mMSC对同基因和异基因脾细胞增殖的影响.MTT法测定脾细胞免疫反应性增殖水平;流式细胞术检测CD4+/CD8+细胞比值、CD4+CD25+细胞百分比;ELISA法检测IFN-γ、IL-2、TGF-β1.、IL-4水平.结果 ①ConA刺激时,mMSC对同基因和异基因(BALB/c)脾细胞的反应性增殖的抑制作用相似,呈细胞数量依赖性,当细胞比例为1:1时,抑制率为84.21%.在异基因抗原刺激下,mMSC对同基因和异基因脾细胞反应性增殖的抑制作用相似,细胞比例为1:10时,抑制率为88.07%,呈细胞数量依赖性.②在ConA刺激下,mMSC-S脾细胞比例为1:1组的CD4+/CD8+比值为2.61±0.24,CD4+CD25+细胞比例为(6.34±0.69)%,与对照组比较差异有统计学意义(P《0.05).在异基因抗原刺激下,1:10组CD4+/CD8+比值为2.49±0.14、CD4+CD25+细胞比例为(8.31±0.80)%,与对照组比较差异有统计学意义(P《0.05).③在共培养体系中mMSC可抑制IFN-γ、IL-2的分泌,促进TGF-β1、IL-4的分泌,其水平与mMSC的数量呈正相关.结论 在体外培养体系中,mMSC呈数量依赖性抑制同基因或异基因脾细胞对有丝分裂原和异基因抗原诱发的免疫反应性增殖;在mMSC作用下,脾细胞中CD4+/CD8+比值增高、CD4+CD25+细胞比例升高,致炎因子分泌降低、抗炎因子分泌升高,并呈mMSC数量依赖性.     

核小体结合蛋白调控CXCR4抑制前列腺癌PC-3细胞的侵袭作用

目的 探讨抑制人核小体结合蛋白1(NSBP1)基因后抑制非激素依赖性前列腺癌细胞系PC-3侵袭能力的作用机制.方法 通过慢病毒lentivirus-NSBP1转染非激素依赖性前列腺癌细胞系PC-3后,MTT法观察细胞活性变化,Transwell实验观察细胞侵袭能力的变化,应用Western-blot技术检测NSBP1、CXCR4蛋白的变化情况.结果 抑制NSBP1表达水平后非激素依赖性前列腺癌细胞系PC-3细胞活性降低,侵袭能力降低,同时伴有CXCR4蛋白的表达降低.结论 通过慢病毒转染抑制NSBP1的表达可以抑制非激素依赖性前列腺癌细胞系PC-3的侵袭能力,NSBP1可能是通过调控CXCR4蛋白的变化影响细胞侵袭能力的.     

PANTR1与慢性髓系白血病细胞K562对伊马替尼耐药的关系及其相关机制

目的:探讨长链非编码RNA(LncRNA)PANTR1与慢性髓性白血病细胞K562对伊马替尼耐药的关系及机制。方法:培养K562对照细胞(Control)及K562伊马替尼耐药细胞(ImR),采用慢病毒转染靶向PANTR1的2种siRNA载体及对照载体于K562-ImR细胞中,分别为ImR-siPA#1、ImR-siPA#2及ImR-siControl细胞;采用CCK-8实验检测各组细胞伊马替尼半抑制浓度(IC50);采用荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测PANTR1、BCR/ABL、MDR、CD44及CD133 mRNA表达水平;采用Western blot检测BCR/ABL、多耐药基因1(MDR)、CD44及CD133表达水平。结果:ImR细胞伊马替尼IC50显著高于Control细胞(P<0.01),ImR-siPA#1、ImR-siPA#2细胞伊马替尼IC50显著低于ImR-siControl细胞(P<0.01),但仍显著高于Control细胞(P<0.01);ImR细胞PANTR1、BCR/ABL、MDR、CD44及CD133 mRNA表达水平均显著高于Control细胞(P<0.01),ImR-siPA#1、ImR-siPA#2细胞PANTR1、MDR、CD44及CD133 mRNA表达水平显著低于ImR-siControl细胞(P<0.01),而BCR/ABL mRNA表达水平无显著差异(P>0.05);ImR细胞BCR/ABL、MDR、CD44及CD133蛋白表达水平明显高于Control细胞,而ImR-siPA#1、ImR-siPA#2细胞MDR、CD44及CD133蛋白表达水平明显低于ImR-siControl细胞。结论:LncRNA PANTR1可促进慢性髓系白血病细胞K562中MDR的表达及其干细胞标志物的表达,介导细胞对伊马替尼耐药。     

干细胞相关因子在大鼠卵巢颗粒细胞中的表达

背景：现有研究表明,人与大鼠卵巢优势卵泡中的颗粒细胞具有表达干细胞特性的现象。目的：探讨干细胞相关因子在大鼠卵巢颗粒细胞中的表达。方法：将大鼠卵巢组织制作石蜡切片后,使用免疫组化法检测CD34,CD133,ABCG2/Bcrp1,Pou5f1/Oct-4的表达。卵泡穿刺法获取颗粒细胞,并使用免疫组化法检测FSHR受体的表达以鉴定颗粒细胞的纯度。免疫组化法检测颗粒细胞 CD44, C-Kit 的表达情况, RT-PCR 检测卵巢组织与颗粒细胞 ABCG2/Bcrp1、Pou5f1/Oct-4、Nanog基因的表达情况。结果与结论：免疫组化法石蜡切片显示部分卵巢颗粒细胞CD34,CD133,ABCG2/Bcrp1,Pou5f1/Oct-4阳性表达,而Pou5f1/Oct-4蛋白的表达在卵泡发育的周期中逐步增多,并在黄体化的时候显著增强,形成白体后则消失,因而具有周期性表达的特点。卵泡穿刺法提取的原代颗粒细胞FSHR受体鉴定阳性率在95%以上。体外培养的颗粒细胞以长梭形或菱形为主,部分细胞有聚集生长现象,且 CD44,C-Kit 阳性表达。RT-PCR检测结果显示,卵巢组织与体外培养的颗粒细胞均不表达 Nanog,卵巢低表达 Pou5f1/Oct-4,强烈表达ABCG2/Bcrp1,颗粒细胞微弱表达Pou5f1/Oct-4,而ABCG2/Bcrp1表达较强。以上结果显示大鼠卵巢中的部分颗粒细胞具有干细胞的特性。     

结直肠癌组织中CD44+肿瘤细胞与S期标志物增殖细胞核抗原的关系

背景:目前尚未找到结直肠癌干细胞理想的标志物,结合周期蛋白能更精确的找到GO/G1期癌干细胞.目的:了解结直肠癌组织中CD44和增殖细胞核抗原PCNA的表达及CD44+肿瘤细胞与S期标志物增殖细胞核抗原PCNA的关系.方法:采用组织芯片检测、免疫组织化学和双重免疫组织化学染色技术检测61例结直肠癌组织、10例正常肠黏膜组织中增殖细胞核抗原PCNA和CD44表达情况.结果与结论:在结直肠癌组织中,PCNA+细胞数远多于CD44+细胞数,CD44+癌细胞形态有两种,一种核较大,染色质边集,呈空泡状,核膜核仁清晰,这些细胞大多数呈PCNA阳性;另一种核较小,染色质致密,呈小圆形,部分表达PCNA.在大多数病例中,CD44+细胞中90%以上的瘤细胞同时为PCNA阳性,只有(3.38±2.08)%细胞为单纯PCNA阳性.说明结直肠癌组织中大多数CD44+细胞呈现S期标志物PCNA阳性,处于S期;只有极少数CD44+/PCNA-处于G0/G1期的细胞可能为肿瘤干细胞.     

利用基因芯片分析碱性成纤维细胞生长因子诱导脐血干细胞CD34~+与CD133~+细胞基因表达的差异

背景:迄今为止,人们利用基因芯片对碱性成纤维细胞生长因子诱导CD34~+和CD133~+干细胞分化后细胞生物学性状、功能调控、基因变化及其表达差异等方面的认识尚不足,有待深入研究.目的:利用基因芯片比较脐血CD34~+和CD133~+细胞基因表达的差异,并探讨碱性成纤维细胞生长因子体外诱导脐血CD34~+和CD133~+造血干/祖细胞分化的基因表达变化,及其对碱性成纤维细胞生长因子反应性差异.方法:利用MiniMACS免疫磁珠法从脐静脉血单个核细胞中分离出CD34~+和CD133~+干/祖细胞,经含碱性成纤维细胞生长因子、B27的DMEM/F12细胞营养液培养10～15 d,提取培养前后细胞总RNA,利用Oligo GEArray(r)芯片和GEArray表达分析软件进行芯片数据分析.流式细胞仪检测CD34~+和CD133~+造血干细胞回收率.碱性成纤维细胞生长因子诱导前后CD34~+、CD133~+细胞形态变化.变性琼脂糖凝胶电泳测定RNA浓度和纯度.基因芯片检测结果.结果与结论:①对20份脐血分别进行CD34~+和CD133~+细胞分选,分选CD34~+细胞纯度为(77.52±5.06)%,回收率为(2.74±1.59)%;CD133~+细胞纯度为(79.16±3.37)%,回收率为(1.12±0.94)%.②新分选出的CD34~+细胞呈球形,经碱性成纤维细胞生长因子培养15 d后,多数细胞形态未发现显著变化,部分细胞出现贴壁生长,可见突起和梭形细胞.CD133~+细胞呈球形,经碱性成纤维细胞生长因子培养15 d后,细胞明显扩增,由圆球形变为不规则形,部分细胞出现贴壁生长.③CD34~+干细胞培养前后总RNA提取质量分别为2 236 ng和1 796 ng;CD133~+干细胞培养前后总RNA提取质量分别为2 518 ng和2 191 ng.④在所检测的263个干细胞相关基因中,脐血CD133~+细胞与CD34~+细胞基因表达差异2倍以上的基因有10种,其中5种基因表达前者高于后者,5种基因表达前者低于后者;碱性成纤维细胞生长因子诱导培养后,CD133~+细胞有32种基因表达显著高于CD34~+细胞,在检测的263个基因中,未见低于CD34~+细胞的基因.证实脐血中新分离的CD133~+细胞和CD34~+细胞基因表达仅有少数基因存在差异;CD133~+细胞对碱性成纤维细胞生长因子的反应性显著强于CD34~+细胞,表现为细胞周期调节、信号转导和分化等基因表达增强.