胶原/羟基磷灰石支架负载软骨细胞修复兔膝关节骨软骨缺损

目的 探讨胶原复合梯度羟基磷灰石(Col/HA)双相支架负载软骨细胞修复兔膝关节骨软骨缺损的可行性及疗效.方法 构建Col/HA双相支架,将软骨细胞种植于支架培养1周,再将软骨细胞-支架复合体移植修复兔膝关节股骨髁的骨软骨缺损,并对骨软骨缺损的修复进行检测.结果 光镜及扫描电镜观察显示软骨细胞在Col/HA支架中贴附良好,表型维持稳定,分泌胞外基质.大体观察和组织学检测显示,植入体内16周后实验组软骨层呈透明软骨样修复,软骨下骨缺损有新骨构建;对照组骨软骨缺损修复不良,组织学检测以纤维性组织或纤维软骨组织形成.Wakitani评分显示实验组修复组织优于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 双相Col/HA复合支架可作为骨软骨组织工程支架,负载软骨细胞可修复兔膝关节骨软骨缺损,重建关节软骨的结构和功能.     

胶原/羟基磷灰石骨软骨一体化支架的生物学特性研究

[目的]对体外条件下胶原/羟基磷灰石一体化复合材料的生物学特性进行评价,探讨其作为骨软骨组织工程支架的可行性。[方法]以胶原和羟基磷灰石为原料,研制出由胶原逐层过渡到羟基磷灰石为主的一体化支架材料,其软骨层主要成分为胶原,骨层主要成分为羟基磷灰石。通过扫描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率。将材料与兔骨髓基质细胞复合培养,MTT法测定细胞的生长曲线,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况。[结果]胶原/羟基磷灰石一体化复合支架具有疏松多孔结构,其中软骨层孔径大小(90±15)μm,骨层孔径大小(120±20)μm,孔隙率(75±5.0)%。细胞在材料上生长良好。[结论]胶原/羟基磷灰石一体化复合材料具有适宜的孔隙结构和良好的生物相容性,可用作骨软骨组织工程支架材料。     

Ⅰ型胶原半月板支架负载纤维软骨细胞体外培养

[目的]观察Ⅰ型胶原半月板支架对纤维软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为半月板组织工程支架的可行性及价值。[方法]构建Ⅰ型胶原半月板支架，将体外培养的兔半月板纤维软骨细胞吸附于该支架上三维立体培养，通过相差倒置显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对半月板纤维软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。[结果]Ⅰ型胶原能制成理想大小、形状的三维立体多孔半月板支架，纤维软骨细胞在支架孔壁贴附良好，维持表型稳定，分泌胞外基质。[结论]Ⅰ型胶原半月板支架细胞相容性良好，但力学性能相对较差，通过与其它生物材料复合以提高其机械力学强度，可望制得理想的半月板组织工程支架。     

骨骺干细胞复合壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架体外培养的实验研究

目的 探讨免疫磁珠分选的骨骺干细胞(PSCs)经诱导后向软骨细胞方向分化的性能,及其与壳聚糖/纳米羟基磷灰石(CS/nHA)支架材料复合培养构建组织工程化软骨的可行性.方法 用显微手术器械剪取新生24 h内的清洁级SD大鼠股骨下端骺板两端的La Croix环处组织,应用免疫磁珠分选系统分离纯化PSCs,免疫荧光染色观察PSCs成纤维细胞生长因子受体-3(FGFR-3)的表达情况.体外培养并诱导PSCs向软骨细胞特性方向分化,免疫细胞化学、甲苯胺兰及番红O染色检测诱导后细胞Ⅱ型胶原及软骨基质的表达情况.以诱导后接种于CS/nHA支架培养的PSCs为实验组,以诱导后未接种支架的细胞为对照组.扫描电镜观察细胞的黏附及形态学改变,MTT法检测细胞增殖情况,阿辛蓝法测定细胞合成的糖胺多糖(GAG)情况.对两组间不同培养时间的吸光度值及GAG进行比较.结果 免疫磁珠分选的PSCs体外培养增殖迅速,免疫荧光染色显示FGFR-3阳性表达.诱导后的PSCsⅡ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺兰染色及番红O染色均旱阳性.细胞接种CS/nHA支架后1、4 d,实验组与对照组吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05),而7 d实验组与对照组吸光度值比较筹异有统计学意义(t=-2.786,P=0.024).培养14 d后培养液GAG含量为(89.66±6.52)μg/106个细胞,高于对照组[(78.62±4.63)μg/106个细胞)],差异有统计学意义(t=-3.084,P<0.05).结论 免疫磁珠分选的PSCs经诱导后可向软骨细胞功能方向分化,诱导后的PSCs与CS/nHA分层支架复合有望构建组织工程化软骨.     

胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石仿生支架材料的制备及其生物相容性检测

目的制备胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石(collagen-chitosan/nano-hydroxyapatite-collagen-polylactic acid,Col-CS/nHAC-PLA)仿生支架材料,检测生物相容性,为其在骨软骨缺损修复中的应用奠定基础。方法以1,4二氧六环为溶剂,按8%质量浓度加入PLA和等量nHAC溶解,制备nHAC-PLA;用2%醋酸溶液配制浓度为2%的CS纯溶液及1%的Col纯溶液,以质量比(M/M)20∶1混合,倒入含nHAC-PLA的模具中,冷冻干燥成形制备Col-CS/nHAC-PLA仿生支架。行急性全身毒性实验、皮内刺激实验、热源实验、溶血实验、体外细胞毒实验、骨植入实验,评价其生物相容性。结果 Col-CS/nHAC-PLA仿生支架无急性全身毒性;皮内刺激实验示原发刺激指数为0分,为极轻微刺激;热原实验示3只实验动物体温升高均<0.6℃,体温升高总和<1.3℃,符合规定标准;溶血实验示平均溶血率为1.38%,符合≤5%标准。体外细胞毒性实验示材料浸提液不影响兔BMSCs增殖,毒性分级为Ⅰ级。骨植入实验显示支架材料与周边组织相容性好。结论 Col-CS/nHAC-PLA仿生支架材料具有良好生物相容性,有望成为较理想的组织工程骨软骨支架。     

胶原-透明质酸支架的制备及其与软骨细胞复合培养的实验研究

目的制备胶原-透明质酸支架,评价其与兔髁状突软骨细胞的生物相容性,探讨其应用于关节软骨组织工程的可行性。方法冷冻干燥法制备胶原-透明质酸复合多孔海绵支架材料,将其与碳化二亚胺[1-ethyl-3-（3-dimethyl aminopropyl）carbodiimide,EDC]进行化学交联。分别采用体积法和体外酶解实验测定支架材料孔隙率和降解率,扫描电镜观察交联前后支架材料的形态变化。取3周龄新西兰兔髁状突软骨细胞,体外培养5d后,甲苯胺蓝染色,倒置相差显微镜下观察行细胞鉴定。取消化后第2代软骨细胞接种至支架材料复合培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。复合培养1、3、5、7和10d后,PBS液清洗3次,置入24孔板并以0.25%胰酶和0.1%EDTA消化细胞,采集细胞进行细胞计数并绘制细胞生长曲线。另取部分样本继续培养5d,行组织学和扫描电镜观察。结果胶原-透明质酸支架材料经化学交联后,具有合适的三维多孔结构,孔隙率为83.7%,孔径100-120μm;交联后抗酶解能力显著增加。髁状突软骨细胞在其表面和内部贴附良好,形成细胞-材料复合体,细胞增殖实验显示,复合培养1d,材料中细胞数为3.7×104/支架,10d后增至8.2×104/支架。电镜观察见细胞周围有基质分泌。结论EDC交联后的胶原-透明质酸支架具有良好空间结构和生物相容性,可作为支架材料用于髁状突软骨组织工程的研究。     

胶原与羟基磷灰石复合移植材料的研究及应用

本文着重从组织学、免疫学、临床等方面归纳、综合、分析了近４年内胶原与羟基磷灰石复合移植材料在国外的动物实验研究及临床应用的最新动向。     

胶原复合羟基磷灰石修复下颌骨缺损的组织学观察

在小型猪的下颌骨建立基准骨缺损模型，于缺损区植入胶原复合羟基磷灰石移植材料，用自体骨移植和空白作对照。术后４，８，１２，２４和４８周，分别处死动物取材。光镜下观察动态的组织学变化。结果显示，全部实验动物均存活至观察时间，手术部位无感染及坏死，胶原复合羟基磷灰石移植物与宿生骨融为一体难以分辨。镜下见二者间无纤维组织间隔，成骨活跃，修复过程与自体骨基本一致。未见异物巨细胞及骨坏死所致空泡。认为，胶原复合羟基磷灰石移植材料较自体骨来源广泛，制作方法简便，易于操作，无颗粒游走及移位，对组织无毒、无刺激，不引起机体排斥反应，并可使患者免于因供骨所致的手术创伤，是一种经济、实用及生物相容性好的骨代用品。     

胶原-透明质酸-硫酸软骨素复合三维支架体外构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨以胶原(collagen,Col)透明质酸(hyaluronic acid,HA)硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)为支架材料构建组织工程软骨的可行性.方法以乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐为交联剂通过冷冻干燥的方法制备Col-HA-CS复合支架及单纯Col支架.通过扫描电镜、HE染色对Col-HA-CS复合支架材料形态进行观察.分离培养幼兔关节软骨细胞,将体外扩增的软骨细胞接种在两种支架上,通过组织学、扫描电镜观察软骨细胞在支架上的生长形态;通过生物化学功能检测细胞-支架复合物中DNA、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;RTPCR方法检测在Col HA CS复合支架上的软骨细胞ColⅡ的表达情况.结果软骨细胞在Col-HA-CS复合支架材料上增殖分化良好,并保持软骨细胞特异的分化ColⅡ表型,培养21 d后已有软骨样组织形成,出现软骨陷窝.DNA和GAG含量测定显示软骨细胞在复合支架上随时间增加逐渐扩增并分泌大量的GAG,含量明显高于单纯Col支架材料,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Col-HA-CS复合支架材料可为软骨细胞生长分化及组织形成提供一个良好的环境,在软骨组织工程的支架材料领域有较广泛的应用前景.     

仿生增强型纳米羟基磷灰石-聚乳酸复合支架研究现状

骨组织工程是修复骨缺损最有前途的方法,寻找理想的支架材料是目前骨组织工程研究的热点之一。近年来采用仿生学原理制备的增强型纳米羟基磷灰石聚乳酸复合支架材料因具有良好的生物相容性和生物降解性而广泛研究。该文就纳米羟基磷灰石-聚乳酸复合支架材料的制备、力学性能及影响因素、与骨髓间充质干细胞复合构建组织工程化骨、与骨形态发生蛋白复合构建活性人工骨的成骨性能研究现状作一简要综述。     

骺板软骨细胞复合三维支架体外构建组织工程软骨的研究

目的探讨将骺板软骨细胞复合三维支架经体外培养,构建组织工程软骨的效果及其生物学特点. 方法将3周龄幼兔第1代骺板软骨细胞与液态的生物凝胶混合,接种于聚磷酸钙纤维/L-聚乳酸(CPPF/PLLA)三维支架材料,构建组织工程软骨组织块,连续培养4周.行大体、倒置显微镜及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组织化学光镜观察,定量检测硫酸糖胺多糖(GAG)含量. 结果构建的组织工程软骨块在培养过程中能保持其初始外形,种子细胞呈稳定的三维均相分布,外观逐渐呈乳白色、半透明,硬度亦不断增加.培养1周有软骨细胞陷窝形成,2周后形成富含Ⅱ型胶原和蛋白聚糖、具有典型软骨组织结构的工程化软骨,且Ⅰ型胶原逐渐转为阴性.4周时构建软骨的组织结构与天然骺板软骨相类似,硫酸GAG含量平均为天然骺板软骨的34%以上. 结论骺板软骨细胞复合三维支架体外培养可生成典型软骨,且可形成类似天然骺板软骨的组织结构,能满足修复骺板缺损的基本要求.体外培养1～2周可能是植入体内修复骺板缺损的较佳时机.     

蚕丝在软骨细胞立体培养中的应用

目的 观察蚕丝对软骨细胞的吸附作用及蚕丝对软骨细胞形态和功能的影响。方法 从家蚕蚕茧中抽丝所得的蚕丝经胰蛋白酶消化和聚乳酸包埋,制成三维支架,软骨细胞与蚕丝三维支架进行复合培养,利用相差倒置显微镜、扫描电镜观察软骨细胞生长情况。结果 蚕丝三维支架上滴加软骨细胞悬液后,软骨细胞在不规则轻微漂动和缓慢下沉过程中粘附在蚕丝上,１～２天后完全贴壁。培养３天后软骨细胞开始分裂;５天后,细胞生长增殖十分活跃;     

骨髓基质细胞与关节软骨细胞生物学特性的比较研究

目的观察兔骨髓基质细胞(MSCs)诱导和基因修饰后的主要生物学特性,并与关节软骨细胞进行比较. 方法抽取成年雄性新西兰大白兔髂骨骨髓,密度梯度离心获得骨髓基质细胞,培养传至第5代,按处理方法分为常规培养液组(A组)、条件培养液组(B组)及重组缺陷型腺病毒携带肝细胞生长因子cDNA转染组(C组).条件培养液为常规培养液中含转化生长因子-β1(10 ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(25 ng/ml)和地塞米松(10-7 mol/L).切取兔膝关节软骨,3 mg/ml Ⅱ型胶原酶消化传代培养至第3代(D组).观察原代MSCs及第5代MSCs(体外培养8～10周后)细胞形态,对第5代MSCs及第3代软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,MTT法检测细胞增殖情况.阿利新蓝法检测细胞培养上清液中糖胺多糖(GAG)含量.提取各组培养细胞总RNA,RT-PCR检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达. 结果原代MSCs为短梭形、簇状生长,传代细胞呈长梭形、旋涡样生长.A组细胞爬片Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阴性,GAG含量低,与D组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).B组细胞爬片Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,GAG含量升高,与D组比较差异无统计学意义(P＞0.05);C组转染后第4天增殖率降低,与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05),其余时间点各组间无统计学意义(P＞0.05).RT-PCR表明A、B、C组均表达Ⅰ型胶原,B、D组可表达Ⅱ型胶原,C组有较弱的Ⅱ型胶原表达. 结论 MSCs体外培养过程中自然转归趋向于成骨.传代后经向成软骨方向诱导,具有向软骨分化的能力;体外传代培养的MSCs具有干细胞自我增殖和定向分化的特性,可作为靶细胞接受外源目的基因转染并能有效表达.     

骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白封闭剂体内构建可注射性组织工程软骨

目的 探讨利用人骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）与可注射性纤维蛋白封闭剂（fibrinsealant，FS）复合，在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。方法 体外分离扩增健康人MSCs，以含有转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF—β1）、地塞米松、维生素C的培养基进行成软骨诱导，诱导第7、14天分别检测软骨细胞特异的生物学特性。将诱导7d的MSCs与FS复合，接种于裸鼠背部皮下作为实验组，同时设单纯只注射FS或MSCs的支架对照组和细胞对照组。分别于接种后6、12周取材进行大体观察，行HE、阿尔新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色评价其成软骨能力。结果 MSCs以特定的培养基诱导后由纺锤形变为多角形，并表达软骨细胞分泌的基质。复合物接种6和12周后，实验组均可形成软骨样组织块，6周时形成的组织块较小而质地柔韧，陷窝清楚，可检测到阳性阿尔新蓝及Ⅱ型胶原表达；12周形成的组织块较大，质地较硬，表面光滑，软骨细胞位于成熟的陷窝中，阿尔新蓝及Ⅱ型胶原免疫组化阳性染色较6周增强。两个对照组均无软骨样组织块形成。结论 MSCs复合FS可以作为一种较优良的可注射性组织工程软骨的构建方法。     

体外培养软骨细胞凋亡与caspase-3表达的实验研究

目的探讨软骨细胞体外培养过程中凋亡发生以及caspase-3的表达. 方法采用Annexin Ⅴ和TUNEL法检测第1～4代软骨细胞在体外正常培养体系中第3天和第7天的凋亡率;RT-PCR和Western blot分析caspase-3表达水平;ELISA检测caspase-3蛋白酶活性. 结果第1～4代软骨细胞在体外培养过程中均存在不同程度的凋亡现象,各代次软骨细胞第7天的凋亡率15.7%±0.3%,明显高于第3天的8.9%±0.6%,有统计学意义(P＜0.01).caspase-3 mRNA和蛋白质在整个培养过程中都有表达,随着时间延长表达上调,第7天的表达水平高于第3天.体外培养7天后caspase-3被激活,可检测到分子量为20 ku的裂解片段.caspase-3蛋白酶活性随着培养时间延长也逐渐增高,与细胞凋亡程度基本一致. 结论软骨细胞在体外培养过程中存在凋亡,caspase-3参与了凋亡事件并发挥着重要作用.     

壳聚糖在软骨组织工程中的应用

目的 对高分子生物材料壳聚糖在软骨组织工程中的应用现状进行综述。方法 广泛查阅近年来有关壳聚糖在组织工程中应用的文献，综合分析，讨论 其生物相容性、可降解性及其应用。结果 壳聚糖具有良好的生物相容性、可降解性，除能提供细胞生长所需的三维支架作用外，还能提供类似软骨基质的细胞外环境，维持细胞表型及功能。结论壳聚糖在软骨组织工程中具有良好的应用前景。     

异体软骨细胞复合Pluronic修复关节软骨缺损

目的 探讨运用同种异体软骨细胞复合Pluronic修复关节软骨缺损的可行性，并应用^3H—TdR放射自显影方法鉴别软骨缺损修复的细胞来源。方法 取同种异体软骨细胞体外培养至第2代，用^3H—TdR标记后复合Pluronic植入兔关节软骨缺损区作为实验组，并采用单纯Pluronic植入作为材料对照组，不作任何处理组为空白对照组，分别于4、8及16周取材，观察其修复效果，并应用放射自显影方法鉴别修复组织的细胞来源。结果 实验组术后8周，缺损表面可见新生软骨形成，术后16周缺损完全修复，表面光滑，与周围界限模糊，放射自显影证实所修复组织的细胞来源于植入细胞。材料对照组及空白对照组缺损均未见明显修复。结论 ①同种异体软骨细胞复合Pluronic修复关节软骨缺损是可行的；②^3H—TdR标记细胞可作为鉴别细胞来源的一种简便可行的方法。     

以L929细胞为滋养层的尿道黏膜上皮细胞体外培养

目的 探索尿道黏膜上皮细胞体外培养的技术和方法，为进一步采用组织工程技术构建尿道黏膜组织奠定基础，并为尿道黏膜的生理、药理、毒理学及微生态研究提供实验模型。方法 取刚离乳的雄性新西兰幼兔尿道黏膜组织，分别以DispaseⅠ消化液和混合消化液消化成单细胞悬液，以差速贴壁法排除成纤维细胞，接种后以L929细胞为滋养层细胞进行培养，定期换液，细胞生长、增殖至80％～90％融合时传代。细胞进行常规HE染色、流式细胞仪检测，以扫描电镜、透射电镜观察其超微结构。再分别设立实验组(n=20)、阳性对照组(正常尿道黏膜组织石蜡切片，n=20)及阴性对照组(成纤维细胞铺片，n=20)行免疫组织化学染色。结果 原代培养10天左右细胞逐渐生长融合成片，如铺路石状，细胞大小均一。上皮细胞为二倍体细胞，生长期内均为单一的上皮细胞，无成纤维细胞混杂生长，细胞可传11～13代，成活50～60天。结论 新西兰幼兔尿道黏膜上皮细胞可在体外进行培养，在一定时间内保持增殖活力，为构建组织工程化尿道奠定了基础，且为尿道黏膜的体外研究提供了实验模型。