LightCycler实时监测PCR定量分析血清HBV DNA

目的 检验LightCycler实时监测PCR（real-time detection PCR,RTD-PCR)对血清中HBV DNA定量检测的灵敏性和可重复性，探讨HBV血清标志物与HBV DNA定量的关系。方法 HBV定量按深圳匹基公司乙肝PCR荧光检测试剂盒使用说明，对乙肝标志物已明确的773例血清中HBV DNA定量结果进行统计分析。结果 实时监测PCR对血清中HBV DNA定量检测的灵敏性高，可检测低至1000拷贝／ml血清；可重复性好，批间误差＜20％；各种标志物类型的血清HBV DNA含量分布情况表明，HBV血清标志物中HBeAg与HBV DNA含量有明显的关系，一般HBeAg阳性血清HBV DNA含量较高，但也有相当一部分例外。结论 LightCycler实时监测PCR对血清中HBV DNA定量检测灵敏性高可重复性好；仅根据HBV血清标志物往往不能确定乙肝患者HBV DNA复制水平的高低，HBV DNA定量检测具有十分重要的临床意义。     

实时定量聚合酶链反应技术研究进展

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是通过对基因的选定片段进行体外高效的扩增,实现对目的基因的检测。传统的PCR定量方法,如溴乙锭染色,测定的是PCR的终产物,而不是初始模板拷贝数,由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终的PCR产物量不能计算     

实时荧光定量PCR在结节病与不典型结核鉴别诊断中的临床应用

目的验证和评价实时荧光定量PCR（polymerase chain reaction）的方法检测结核分枝杆菌DNA在结节病与不典型结核病鉴别诊断中的实际应用价值。方法以2008年6月至2009年6月期间,经病理活检证实为肉芽肿性疾病,但无法确定为结节病或结核病的49例患者为研究对象。运用我科前期建立的实时荧光定量PCR的方法检测上述患者石蜡包埋病理组织标本中的结核分枝杆菌DNA（Tuberculosis polymerase chain reaction,TBPCR）,以1.14×10~3拷贝/ml作为鉴别结节病与不典型结核病的最佳cutoff值,结合临床、影像、病理和其他检查结果帮助临床鉴别诊断并指导用药。随访所有患者至2009年8月1日,通过临床表现、影像学、治疗效果等变化来验证和评价本方法的实际应用价值。结果 49例患者定量TB-PCR结果中,10例患者结核分枝杆菌DNA为阳性（2.01×10~3～7.98×10~4拷贝/ml）（阳性率20.41%）,39例为阴性。结合患者临床资料及TB-PCR结果确定诊断,33例为结节病,2例结核病,诊断明确率达到72%（35/49）。诊断明确患者治疗后随访（2～14个月）,33例结节病和2例结核病患者经相应治疗均达到稳定或不同程度好转,无1例出现病情恶化。结论实时定量PCR法检测石蜡包埋组织中结核菌DNA能灵敏而高效地检出不典型结核病肉芽肿中的结核杆菌DNA,可作为鉴别结节病和不典型结核病的有效方法之一。     

实时定量PCR检测自然流产患者HLA-G mRNA的表达

目的:检测HLA-G mRNA在自然流产患者绒毛组织中的表达,探讨HLA-G与自然流产的关系。方法:取8例正常妊娠早孕人工流产(对照组)与6例自然流产绒毛组织(实验组),采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测对照组和实验组绒毛组织HLA-G mRNA表达水平。结果:自然流产组HLA-G mRNA的相对表达量(0.026±0.012)明显低于正常妊娠早孕人工流产组的HLA-G mRNA的相对表达量(1.883±1.774),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HLA-G mRNA在绒毛组织的表达异常可能与自然流产的发病有关。     

实时荧光定量PCR法检测肾移植术后BK病毒感染及意义

目的检测肾移植患者术后BK病毒DNA并探讨其临床应用价值。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)对86例同种异体肾移植患者术后血液及尿液标本进行BK病毒DNA检测。结果 86例肾移植患者中,尿BK病毒DNA阳性12例(14.0%),血液BK病毒DNA阳性6例(7.0%)。BK病毒DNA血、尿均为阳性5例患者中有4例经肾脏穿刺病理活检确证为BK病毒相关性肾病(BKVAN)。结论尿液BK病毒检测能够早期发现BK病毒感染,结合血液BK病毒检测为早期诊断、治疗并预防肾移植术后BKVAN提供重要的依据。     

HCV-RNA实时荧光定量的临床价值

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-RT-PCR)检测丙型肝炎病毒(HCV-RNA)在临床中的应用价值。方法用RFQ-RT-PCR检测325例肝炎病人标本,并同时采用ELISA检测抗-HCV,了解样本中HCV-RNA含量与抗-HCV的相关性。结果325份标本中有15例HCV-RNA含量高于1000拷贝/ml,18例抗-HCV阳性。经统计分析,两者有明显的相关性。结论RFQ-RT-PCR技术检测HCV-RNA特异性强,灵敏度高,具有良好的应用价值。     

多通道实时荧光定量PCR检测HPVDNA结果分析

目的探讨多通道实时荧光定量PCR检测HPVDNA的效果,并应用于日常检测工作。方法对临床1100例宫颈分泌物标本采用多通道实时荧光定量PCR仪进行8种高危HPVDNA分型及定量检测。8种高危HPV型别为主要高危型HPV16、18、45、31和次要高危型HPV33、52、58、67。结果在1100例标本中排除了14例B球蛋白为阴性的标本,剩余1086例标本总体的内标平均值为3．71×10^6IU／ml。随机重复性试验和对每个型别的各浓度标本进行的重复性试验每次扩增均为阳性,型别符合率为100％。共检测出阳性标本287例,HPV16、HPV18／45、HPV31、次要高危型和合并感染各有46、17、14、146和64例,分别占总阳性标本的16％、6％、5％、51％和22％。所有标本绝对定量值的分布近似于正态分布。结论多通道荧光定量PCR检测HPVDNA灵敏度高、复性好,可用于临床HPV感染的筛查与宫颈病变程度预测以及患者术后疗效观察。     

影响HBV DNA荧光实时定量PCR测定的标本因素

目的 :探讨影响HBVDNA荧光实施定量PCR测定的标本因素。方法 :按不同要求收集特定的临床标本 ,用沉淀煮沸裂解法提取DNA模板 ,用荧光实时定量PCR法测定HBVDNA的含量。结果 :经EDTA、中等含量肝素、枸橼酸钠抗凝血浆标本与相应血清标本测定HBV DNA的含量差异无显著性 (F值分别为 2 .13、3.94、0 .76 ;P均 >0 .0 5 ) ,但高浓度肝素 (10 0 0U/ml)抗凝管则显著性减低 (F =2 5 .96 ,P <0 .0 5 ) ;溶血、高血脂标本对HBVDNA含量测定无显著影响 (F值分别为 0 .6 5、0 .0 1;P均 >0 .0 5 ) ;标本反复冻融对HBV DNA含量无明显变化 ,血浆 (清 )样本可在室温下短期储存 (4 8h内 ) ,对HBV DNA含量无明显影响 (F值为 3.5 3和 0 .76 ;P >0 .0 5 )。结论 :不同样本收集、储存条件对HBVDNA定量结果准确性的影响有重要意义 ,而提取DNA会间接决定收集、储存条件对定量结果的干扰。用沉淀煮沸裂解法可使抗凝剂及其他PCR反应抑制物质对HBVDNA测定结果影响减到最低 ,从而降低对标本采集的要求。     

实时定量PCR检测Bcl-2/IgH融合基因在淋巴瘤中的应用

Bcl-2/IgH融合基因是淋巴瘤的肿瘤特异性标志,见于85%～90%的滤泡性淋巴瘤及30%的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者。大量研究表明,该融合基因与滤泡性淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤有很好的相关性,对Bcl-2/IgH的定量检测能反应淋巴瘤的临床进程。现就实时定量PCR技术对Bcl-2/IgH融合基因的检测在淋巴瘤的分期、疗效评价、预测复发和预后评估等方面的临床意义进行综述。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测人c-myc基因方法的建立

目的构建含有c-myc基因的重组质粒并以其为模板,建立以SYBR GreenⅠ染料为荧光指示剂的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测c-myc的标准曲线,为FQ-PCR准确检测c-myc奠定基础。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人食管鳞癌组织的总mRNA中反转录扩增c-myc cDNA,将纯化的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后挑选阳性克隆重组质粒,分别用PCR扩增、限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切进行鉴定并测序分析。用紫外分光光度计测质粒浓度,计算拷贝数制备FQ-PCR浓度梯度标准品。最后对质粒标准品进行FQ-PCR检测。结果PCR扩增、酶切鉴定及测序分析均证实c-myc重组到pGEM-T Easy载体上。建立了人c-myc标准曲线,其对数与相应的Ct值(循环阈值)具有良好的相关性,相关系数r2=-0.99～-1,斜率为-3.1～-3.6。结论所构建的人c-myc质粒标准品应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏性和特异性高,准确可靠,此方法可作为FQ-PCR检测c-myc基因的标准方法。     

实时荧光PCR检测胃癌石蜡组织中Her-2表达的研究

目的探索胃癌石蜡块组织中Her-2的表达状态及其检测新方法。方法统计2009～2011年行免疫组化检测其Her-2蛋白表达情况的71例胃癌组织蜡块的病理数据,并用实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测其样本中的Her-2基因的扩增情况,将两种检测方法的结果进行比较。结果胃癌组织中Her-2的过表达率:免疫组化法为22.5%,荧光PCR法为19.7%,Her-2的过表达与胃癌的部位、有无淋巴结转移及TNM分期比较有显著的相关性(P<0.05),与年龄、性别、分化程度、大体分型、浸润深度比较无显著相关性(P>0.05)。两种方法的检测结果无明显差异(P>0.05)。结论Her-2在胃癌组织表达增高与胃癌的发生、发展密切相关。实时荧光PCR简便、客观、高效,可望成为胃癌石蜡组织中除免疫组化、荧光原位杂交外检测Her-2变化的一种备选方案。     

实时荧光定量PCR法分析结核分枝杆菌耐药性的价值观察

目的 探究实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法在结核分枝杆菌(MTB)耐药性中的应用价值.方法 选择2018年10月至2020年11月我院收治的结核病患者84例,采用FQ-PCR法分析,以罗氏药敏比例法作为检测MTB耐药性的"金标准",分析FQ-PCR法在MTB耐药性中的应用价值.结果 FQ-PCR法分析MTB耐...     

实时荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒

目的探讨实时荧光定量PCR（FQ—PCR）技术检测丙型肝炎病毒（HCV）RNA载量与抗-HCV及丙氨酸氨基转移酶（ALT）异常的相关性。方法用FQ—PCR检测115份疑似HCV感染的病人血清HCV—RNA，ELISA法检测抗-HCV，全自动生化分析仪测定ALT。结果以80拷贝／ml血清为标准，115份标本中HCV—RNA阳性率为54．8％（63／115）；抗-HCV阳性率为53．9％（62／115）；ALT异常率为40．9％（47/115）。HCV—RNA载量与抗-HCV（＋）例数呈正相关（r=0．986，P〈0．01）。HCV—RNA载量与ALT异常例数（r=0．94，P〈0．01）、含量（r=0．624，P〈0．01）呈正相关。结论HCV—RNA载量升高，抗-HCV阳性率相应增加，ALT高于正常值（40U／L）的异常率和浓度也增高，均呈正相关。FQ—PCR法可作为临床检测丙型肝炎的确诊方法之一。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测对结核病的诊断价值

目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)(Gene-xpert)检测对结核病的诊断价值.方法 随机选取我中心在2019年4月至2020年2月就诊的结核病患者共100例作为研究对象,将给予涂片抗酸染色法视为对照组,将给予实时荧光定量PCR检测视为研究组,研究观察2组患者的检出率、灵敏度和特异度、实时荧光定量PCR检测...     

实时定量PCR的应用进展及常见问题对策

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)具有较高的敏感性和特异性,能够对核酸分子进行定性和定量检测,随着分子生物学技术的不断进步,PCR技术取得了前所未有的发展.     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

实时荧光定量PCR法检测肾移植术后BK病毒和JC病毒感染及临床意义

目的检测肾移植患者术后BK病毒DNA和JC病毒DNA并探讨其临床应用价值。方法应用实时荧光定聚合酶链反应(PCR)对广东省第二人民医院125例同种异体肾移植患者术后血液及尿液标本分别进行BK病毒DNA和JC病毒DNA检测。结果 125例肾移植患者中,病毒尿症阳性共35例(28.0%),其中尿BK病毒DNA阳性25例(20.0%)、尿JC病毒DNA阳性10例(8.0%);病毒血症有20例(16.0%),其中血液BK病毒DNA阳性20例(16.0%)、JC病毒血症未检出;BK病毒DNA血液和尿液均为阳性有5例(4.0%),并经肾脏穿刺病理活检确证为BK病毒相关性肾病(BKVAN)。结论尿液、血液中的BK病毒和JC病毒检测能够早期发现BK、JC病毒感染,为预防肾移植术后多瘤病毒相关性肾病(PVAN)提供重要的依据。     

运用实时荧光定量PCR技术研究孕妇TORCH感染情况

目的：运用实时荧光定量PCR技术（Real0time fluorogenic quantitative PCR)研究孕妇早期合并TORCH感染情况及其对胎儿和新生儿的危害，方法：采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ－PCR）技术对166例早中孕妇女（小于20孕周）进行TORCH病原体检测（包括RV，CMV，TOX，HSV－I，Ⅱ）。结果：166例孕妇中TORCH的阳性率分别为：RV＝1．81％（3／166），HSV．7．23％（11／166），CMV＝4．22％（7／166），TOX＝15．66％（26／166），部分病例在羊水中检测到病原.结论：（1）实时荧光定量PCR技术是一项简便快速准确的检测病原体的方法，与传统PCR法相比有独特的优越性，在临床上具有广泛的应用前景；（2）孕妇TORCH感染是不容忽视的生物致畸因子，各地妇保机构应加强孕妇及育龄妇女的筛查和管理，以减少畸形儿出生。     

DNA印迹法和实时定量PCR法在端粒长度测定中的应用比较

目的：分析并比较测量端粒长度的DNA印迹法和实时定量PCR法在细胞衰老实际研究中的性能。方法：从不同代数（population doublings,PDs）的正常人成纤维细胞（2BS）中提取基因组DNA作为测试样本;对测量端粒长度的DNA印迹法和实时定量PCR法进行优化,以点杂交的方式分析地高辛配基标记检测系统的特异性和灵敏度;分别用两种方法反复测定同一样本的平行样或不同样本并分析比较两种方法测量端粒的分辨率和精确度。结果：实际测量端粒时,地高辛配基标记检测系统虽可检测出小于1 μg的基因组DNA,但最优样本量为4~5 μg;DNA印迹法的分辨率约为150 bp,实时定量PCR法的分辨率约为300~400 bp,前者可分辨代龄相差少至2 PDs的2BS细胞端粒长度的差异,而后者只能分辨代龄相差5 PDs以上的端粒差异;实时定量PCR法重复测量误差超过10%,远大于DNA印迹法的2.5%（P<0.001）。结论：地高辛配基标记的DNA印迹检测系统完全适用于测量端粒长度,且性能优于实时定量PCR法,但后者方便快捷,可高通量处理样本,所以在细胞衰老研究中,应根据具体情况合理选择相应方法。     

荧光定量PCR技术及其在肿瘤研究中的现状

自Mullis1 985年发明PCR技术以来 ,PCR技术已广泛应用于生命科学研究的各个领域 ,荧光定量PCR(fluorescencequantitativepolymerasechainreaction,FQ PCR) [1] 是 1 995年由美国PE(PerkinElmer)公司研制出来的一种核酸定量技术。该技术较常规PCR具有简便、灵敏、准确等优点 ,在临床具有广阔的应用前景。本文就其原理、特点及在肿瘤研究方面的应用简要综述如下。1　荧光定量PCR技术原理及过程FQ PCR的分子生物学基础是按常规PCR方式进行体外基因扩增 ,即在PCR反应体系中加入一荧光标记的探针 ,该探针能与扩增基因的某一区域的…