地高辛精标记大鼠代谢型谷氨酸受体第5亚型RNA探针的制备研究

为制备用地高辛精标记的大鼠代谢型谷氨酸受体第 5亚型 c RNA探针 ,本实验用分子生物学技术重组质粒 p GEMm Glu R5 ,经限制性内切酶酶切分析 ,证实其确有 m Glu R5基因片段插入且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化得到线性DNA片段 ,用 T7RNA聚合酶体外转录合成带有地高辛精标记的高比活性的单链 RNA探针 ;经斑点杂交实验证实该探针具有较高的敏感性和可靠性 ,可用于代谢型谷氨酸受体第 5亚型有关的研究     

谷氨酸钠致痫大鼠海马mGluR_5的表达变化

本研究目的为探讨谷氨酸钠 (Glu Na)诱导大鼠癫痫发作时海马 m Glu R5的表达变化。将动物随机分为正常对照组、Glu-Na致痫组及 D-AP-5 (非竞争性 NMDA受体拮抗剂 ) + Glu Na组。通过免疫组织化学方法观察了多克隆抗体抗 m Glu R5在海马各区及齿状回的免疫反应阳性细胞的变化 ,同时观察并记录各组大鼠的行为变化。结果证明 :Glu Na注射后的大鼠均出现严重的癫痫发作。正常组大鼠海马中有丰富的 m Glu R5表达 ,以齿状回颗粒细胞层和 CA1 锥体细胞层的表达为最高 ,而 Glu Na致痫组海马各区 m Glu R5表达明显下调。D-AP-5 + Glu Na组海马各区 m Glu R5表达较之 Glu Na致痫组又上调。同时观察到三个组的m Glu R5的表达主要集中在细胞膜上。结果提示 m Glu R5在癫痫发作后表达下降可能在癫痫诱导过程中具有重要作用 ,其作用机制可能为 NMDA受体依赖性的     

代谢型谷氨酸受体在基底神经节功能中的作用

代谢型谷氨酸受体 (m etabotropic glutamate receptors,m Glu Rs)是与 G蛋白耦联的受体 ,目前已克隆出 8种不同编码的基因 [1 - 5 ] 。根据它们氨基酸序列的同源性、信号转导的机制以及对激动剂的选择性 ,可将其分为 G- 、 G- 和 G- 三组。 G - 组包括 m Glu R1 和 m Glu R5 ;G - 组包括m Glu R2 和 m Glu R3;G- 组包括 m Glu R4、m Glu R6 、m Glu R7和 m Glu R8。目前研究表明 ,代谢型谷氨酸受体与神经突触传递的调控、突触发育的可塑性、长时程增强效应 (L TP)、长时程抑制效应 (L TD)、学习记忆、神经元退化和保护等…     

肿瘤中扩增基因的筛选策略

肿瘤基因组中常有大片段的 DNA扩增 ,鉴定这些扩增片段中的基因是寻找与特定肿瘤发生发展密切相关癌基因的策略之一。通过微阵列比较基因组杂交和限制性内切酶标记位点基因组扫描分析等 ,可以发现肿瘤中扩增的 DNA片段 ,其中所包含的扩增的基因及其 m RNA和蛋白水平的变化可采用定量 PCR和组织芯片免疫组织化学等方法加以检测。筛选出与特定肿瘤相关的扩增基因后 ,使用细胞转染、RNA干扰、c DNA芯片或逆转录多重连接依赖的探针扩增等方法进一步研究将有助于明确目的基因在特定肿瘤发生发展中所起的作用。     

GDNF在人脑胶质瘤细胞中表达的检测及其cDNA的克隆

为研究人脑胶质细胞源性神经营养因子在脑胶质瘤中的表达及其在治疗神经系统疾病中的作用 ,本研究克隆了其前体蛋白及其成熟多肽的 c DNA序列 ,将之用于真核及原核细胞表达。提取我国自建的脑胶质瘤细胞系 BT32 5总 RNA,设计两对引物用逆转录 PCR法扩增上述两种长度的 c DNA片段 ,然后重组于 p GEM-T载体 ,酶切鉴定插入片段正确后测序。结果表明 ,脑胶质瘤细胞中只扩增出 5 5 8bp的胶质细胞源性神经营养因子全长 c DNA片段 ,未见 6 36 bp片段 ;且扩增效率较成熟多肽 c DNA甚低。提示 ,该细胞合成的胶质细胞源性神经营养因子可能还存在不含有信号肽而只能在细胞内潴留的成熟多肽形式。作为自泌性生长因子 ,它可能调节瘤细胞生长等生物学行为 ;同时克隆到的胶质细胞源性神经营养因子全长及其成熟多肽的 c DNA片段 ,可分别用于真核及原核细胞表达     

小鼠PGRP-L编码区基因的克隆及序列分析

目的：获得小鼠长型肽聚糖识别蛋白（mPGRP—L）全长编码区基因。方法：采用RT—PCR技术，从BALB／c鼠肝组织总RNA中扩增PGRP-L编码区基因片段，将其插入pUCm-T载体，以PCR和测序进行鉴定。结果：从BALB／c小鼠肝脏cDNA中，分别以Primer—F和Primer—R1、Primer—F1和Primer—R为引物对进行PCR，扩增得到约1050bp的上游基因片段和约540bp的下游基因片段。以纯化的上、下游片段为模板，Primer—F和Primer—R为引物进行PCR，扩增获得约16aHDbp的DNA片段，并将其克隆至pMD18-T载体获得重组质粒pMD18-mPGRP-L。鉴定结果表明，mPGRP—L编码区基因全长1593bp，与GenBank中mPGRP—LcDNA比较仅2个位置的核苷酸不同，两者的同源性为99．87％。结论：成功地克隆了mPGRP—L的cDNA，为mPGRP—L分子的研究奠定了一定基础。     

以人类前列腺癌细胞构建全长的cDNA文库的方法

目前使用的构建 c DNA文库的方法要求几千个细胞和较长时间用于逆转录步骤 ,限制性酶切 ,连接头和载体克隆 ,而且常因为丢失稀有 c DNA难以保证所构建文库的完整性。而对体内研究工作来说 ,在多种细胞混杂的组织中研究某一种特定种类细胞的表达情况是很重要的 ,这里我们介绍一种全新的 c DNA文库的构建方法 ,它简便快速 ,几十个细胞就可用来构建完整的 c DNA文库。该法以 5′端偶连 T7RNA多聚酶启动子序列的 Oligo- d T作为引物 ,逆转录反义 RNA,提高了从有限的 c DNA模板上 m RNA转录的拷贝数。为防止 m RNA在操作过程中降解 ,…     

寡聚核苷酸微阵列技术应用于脉动流剪应力作用下人体动脉平滑肌细胞基因差异表达的研究

采用本实验室自行设计和研制的 Flow Cham ber血液流动剪切装置 ,从细胞生物力学的角度 ,采用寡聚核苷酸微阵列技术 ,探讨人体脐动脉平滑肌细胞 (VSMC)在脉动流剪应力作用下的基因差异性表达 ,以及相关基因表达的调控 ;比较脉动流和定常流两种剪应力作用下 VSMC基因表达的差异。通过提取细胞总 RNA ,逆转录合成单链 c DNA,双链 c DNA,体外转录合成生物素标记的 c DNA与基因进行芯片杂交 ,经抗体的检测标记荧光染料Cy3,用基因芯片扫描仪进行基因芯片的图像扫描。结果发现 ,与对照组比较 ,经脉动流剪应力作用后 ,血管平滑肌细胞有 1330个基因出现差异表达 ;经定常流剪应力作用后 ,与对照组比较 ,有 2 6 76个基因出现差异表达 ;比较定常流和脉动流两组的血管平滑肌细胞基因 ,有 2 2 97个基因存在表达差异。实验表明 ,近生理状态的脉动流与定常流两种剪应力 ,对体外培养的人体血管平滑肌细胞的基因表达 ,在数量、范围和调控水平上有着很大的差异。提示在生理或病理情况下 ,血液流体力学的变化 ,可诱导血管平滑肌细胞基因在 m RNA表达水平出现不同的应力响应。     

大鼠睾丸AQP7 的启动子结构和活性分析

目的 :分析AQP7的启动子结构和活性 ,明确调控AQP7基因转录的启动子片段 ,探讨AQP7的表达调控机制 ,研究AQP7基因 5′非编码区 (NCR)在细胞内对AQP7翻译启动功能的作用。方法 :从大鼠基因文库克隆大鼠AQP7基因 5’旁侧区 (flank ingregion)片段 ,大鼠AQP7基因 5’旁侧区片段的纯化、亚克隆及测序鉴定 ,用BLASTN 2 2 4软件将AQP7基因 5’旁侧区片段与GenBank大鼠的基因组数据库匹配比较分析 ,进而分析大鼠AQP75’旁侧区片段中包含的启动子长度、结构、转录起始位点及调节因子框架 ,以此设计 4对引物 ,以大鼠基因组DNA为模…     

原发性肉碱缺乏症一家系的SLC22A5基因突变检测与产前诊断

目的对原发性肉碱缺乏症(PCD)病患者及一家系进行致病基因SLC22A5突变鉴定,为家系提供遗传咨询和产前诊断,同时研究c.394-1 GT突变所导致的SLC22A5基因剪接形式的改变。方法收集患者及父母的外周血标本,提取基因组DNA,采用Sanger法对家系中各成员进行SLC22A5基因的所有外显子进行测序,同时对发现的突变在100名正常对照中进行测序,以排除多态性位点;使用QIAGEN血液RNA提取试剂盒抽提患儿总RNA,通过RT-PCR和测序技术分析c DNA序列特征。对先证者母亲的羊水标本进行产前诊断。结果 Sanger法DNA测序检测出该家系中先证者为SLC22A5基因的两个杂合突变:c.394-1 GT,c.760CT(p.R254X),在100名正常对照中均未发现这两个位点的突变。先证者父亲、母亲分别携带SLC22A5基因c.394-1 GT、c.760 CT(p.R254X)杂合突变。先证者母亲的羊水标本的基因型与先证者一样。先证者的特定片段RT-PCR产物电泳时较非携带者的正常人多出一条小的亮带,经测序确认是由c.394-1 GT突变导致SLC22A5基因c DNA外显子2完整序列的缺失。结论 c.394-1 GT突变位点在国内外仅一例报道,本研究证实该突变的存在,同时证明该突变导致SLC22A5基因c DNA外显子2完整序列的缺失。这一发现丰富了SLC22A5基因突变谱,为原发性肉碱缺乏症(PCD)病的防治提供新的参考,Sanger测序等技术可为原发性肉碱缺乏症家系提供遗传咨询和产前诊断服务。     

趋化因子受体CCR5反义RNA在真核细胞中的表达

目的 构建趋化因子受体CCR5反义RNA真核表达载体并获取重组假病毒颗粒以用于抗HIV-1研究，方法 用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞（PBMCs)中获得趋化因子受体CCR5翻译起始区的基因片段，并以正、反两个方面定向插入到真核表达载体pLXSN上，重组载体用脂质体转染剂（lipofectAMINE)转染PA317包装细胞，抗-G418克隆的细胞上清经逆转录后用荧光定量PCR（FQ-PCR）测定假病毒滴度，进一步感染NIH/3T3细胞。结果 CCR5正、反义RNA的真核表达载体。经PA317细胞包装形成的假病毒颗粒已成功地感染NIH/3T3细胞，目的基因在该细胞中得到整合与表达。结论 从PBMCs中获得的趋化因子受体CCR5基因片段通过逆转录病毒载体可转移至真核细胞中并得到表达，为进一步研究CCR5反义RNA的抗HIV-1作用奠定了基础。     

HOXa-10基因在小鼠胚胎着床过程中的作用

目的探讨HOXa-10基因在小鼠胚胎着床过程中的作用。方法应用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)分别检测未孕及早孕小鼠第1、2、3、4、57、d HOXa-10基因表达量的变化规律;同时用可以持续表达HOXa-10的DNA/脂质体复合物质粒和HOXa-10反义寡脱氧核糖核酸分别转染到受孕2d小鼠子宫角内,观察胚泡着床数。结果FQ-PCR结果显示,随着小鼠妊娠天数的增加,HOXa-10基因表达量也逐渐增高,在孕4d达到峰值,孕5d开始下降,孕7d时表达量已接近未孕状态;在用HOXa-10 DNA质粒/脂质体转染孕2d小鼠子宫角后,小鼠的胚泡着床数明显增加;用HOXa-10反义寡脱氧核糖核酸/脂质体转染孕2d小鼠子宫角后,小鼠的胚泡着床数明显减少(P<0.05)。结论在胚泡植入窗口期,子宫内膜HOXa-10基因表达上调,其可能参与了胚泡着床过程。     

反义HLA-A2和GDNF共表达逆转录病毒载体的构建和鉴定

为构建GDNF和反义HLA -A2共表达的逆转录病毒载体,将人GDNF酶切片段(XhoI/SalI)克隆于逆转录病毒载体pLNCX2 的XhoI位点,再将HLA A2cDNA片段反向克隆于上述重组载体的HindIII/SalI位点,对其作酶切鉴定和测序后转染PA317包装细胞系进行病毒的包装。收获重组病毒感染的NIH3T3并进行病毒滴度的测定,GDNF及HLA- A2表达的RT -PCR检测,进一步感染人胚肺成纤维细胞,观察GDNF分泌情况。结果表明:GDNF和反义HLA -A2两片段的序列和插入方向完全正确,包装后获得的重组病毒的平均滴度为5×105 CFU/ml。RT PCR显示:在小鼠源性的PA317细胞中有人GDNF和HLA A2的表达,ELISA法测得病毒感染人胚肺成纤维细胞上清液中GDNF含量为450pg/ml。通过本实验,我们获得能共表达GDNF和反义HLA -A2的重组逆转录病毒,其转染的人成纤维细胞具有合成GDNF的能力。     

反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建及其对反应性星形胶质细胞的作用

目的　构建反义 GFAP逆转录病毒表达载体 ,评价其对培养正常及损伤星形胶质细胞 (Ast)形态及GFAP基因表达的影响。　方法　用定向克隆技术 ,将 1.1kb的 GFAP基因片段反向插入逆转录病毒载体 p L XSN上 ,获得重组体 PL Bsk G,经病毒包装、抗性克隆筛选、滴度测定等 ,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩展培养 ,收获病毒上清液感染体外培养的 Ast,通过免疫组织化学、原位杂交、RT- PCR、Southern blot和流式细胞仪分析等方法 ,研究 PL Bsk G对正常及损伤 Ast的生长、细胞增殖周期、细胞形态结构、GFAP基因表达的影响。　结果　插入PL Bsk G中的 GFAPc DNA片段序列、方向完全正确 ,Southern杂交及 RT- PCR分析表明 ,PL Bsk G成功整合入PA317细胞中 ,并实现了在 NIH3T3细胞中的表达。PL Bsk G使正常及反应性 Ast生长抑制 ,G1期阻滞 ,Ast胞体变圆、胞浆减少、突起变细、回缩 ,核浆比例增大。GFAP免疫组织化学染色减弱 ;GFAP m RNA表达水平降低。　结论　获得了构建正确的反义 GFAP逆转录病毒表达载体 ,并证实其对正常及反应性 Ast形态结构、GFAP表达水平等均有明显的影响 ,为深入研究 Ast反应及 GFAP基因的功能创造了条件。     

大鼠碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆

为获取碱性成纤维细胞生长因子基因将之用于对帕金森病的实验治疗,本研究克隆了大鼠的碱性成纤维细胞生长因子的ｃＤＮＡ。实验用６ 周龄ＳＤ 大鼠卵巢提取的总ＲＮＡ,采用特异引物逆转录ＰＣＲ 获取目的ｃＤＮＡ 片段并将其连入克隆载体ｐＧＥＭ ３ｚｆ（＋ ）中,经ＡＢＩＰＲＩＳＭ ３７７ 测序仪双链测序后显示,目的片段长４５８ ｂｐ,与文献报道的碱性成纤维细胞生长因子序列相比存在一处碱基序列差异,无内含子。所克隆目的片段应为大鼠碱性成纤维细胞生长因子基因。     

NADH-细胞色素b5还原酶在视网膜色素变性rds小鼠中的差异表达

目的:寻找遗传性视网膜色素变性动物模型rds小鼠发病时差异表达的基因。方法:采用差异显示技术比较25drds小鼠和正常对照小鼠的视网膜mRNA。对差异表达的基因片段进行克隆、测序和同源性比较。用基因特异引物RT-PCR观察其在不同日龄两种小鼠中的表达情况。结果:rds小鼠与同龄正常对照小鼠相比,视网膜存在相当明显的基因表达差异。其中一个差异片段克隆的序列与大鼠NADH-细胞色素b5还原酶(b5R)的cDNA序列有91%的同源性,可以认为是小鼠b5R的cDNA片段。基因特异引物RT-PCR证实12d、25d和37drds小鼠视网膜中b5RmRNA水平高于同龄正常对照小鼠。结论:可能由于某种氧化因素使b5R表达增高,大量消耗NADH并生成NAD⁺,促进视网膜细胞凋亡。     

人GDNF在原代培养的大鼠成纤维细胞中的表达

目的：研究人脑胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在治疗神经系统疾病中的作用，克隆其前体蛋白cDNA序列，并用于真核细胞表达，方法：提取我国自建的脑胶质瘤BT325细胞总RNA，用逆转录PCR法扩增GDNF全长cDNA并构建其真核表达载体pCI-neo-GDNF，然后转染原代培养的成纤维细胞，免疫组织化学及原位杂交检测GDNF在细胞中的表达。结果：从国人脑胶质瘤细胞中扩增到558bp的GDNF全长cDNA，并在GDNF转基因原代成纤维细胞中检测到重组GDNF的转录和表达。结论：克隆到的GDNF全长cDNA片段，可用于真核细胞表达，其转基因细胞脑内移植后应能治疗包括帕金森病的内的神经系统变性疾病。     

人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的克隆人Flt3配体（Flt3 LIg and，FL），并在CHO细胞中进行表达。方法从健康人外周血中提取总RNA，通过RT-PCR技术，扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段，经DNA测序证实后，将得到的片段基因插入pcDNA3．0表达载体，构建了pcDNA3．0-FL真核表达载体；将重组质粒pcDNA3．0-FL转染CHO细胞．经G418筛选出阳性细胞克隆，扩大培养，提取细胞总蛋白，用SDS—PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24000处有一显色条带。结果FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3．0中并在CHO细胞中成功表达。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3．0-FL并在CHO细胞中成功表达，为FL的相关研究和应用开发奠定了基础。     

胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体穿梭质粒的构建及鉴定

构建含大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)cDNA的重组腺病毒穿梭载体。提取新生大鼠纹状体总RNA,RTPCR克隆大鼠GDNFcDNA,产物回收后经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,插入重组腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV中,氯化钙法转染入大肠杆菌DH5α中,酶切、PCR及测序分析对重组质粒做进一步鉴定。结果显示大鼠GDNFcDNA被成功克隆,所克隆的GDNFcDNA与基因库注册的相同,以上结果说明本实验成功构建了GDNFcDNA重组腺病毒载体。