诱导hBMSCs成骨分化中微小RNA和靶基因表达水平的变化

目的明确萎缩性骨不连组织中表达上调的数种微小RNA(micro RNA,miRNA)与其相应靶基因mRNA、蛋白在hBMSCs成骨分化过程中的表达变化趋势和生物学功能。方法取自体髂骨植骨手术患者的髂骨骨髓血,采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs。取第4代hBMSCs以成骨诱导培养液诱导成骨分化,分别提取0、12 h,1、2、4、7、14 d时的细胞总RNA和蛋白,进行miRNA的实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、相应靶基因mRNA的qRT-PCR和蛋白Western blot检测。结果诱导hBMSCs成骨分化时,成骨性靶基因碱性磷酸酶(alkalinephosphatase liver/bone/kidney,ALPL)、PDGF-α多肽(PDGF-αpolypeptide,PDGF-A)和BMP-2的mRNA和蛋白表达在多数时间点同对照(0 h)相比增加(BMP-2在12 h和1 d时下降),1～7 d变化最为显著。不同时间点的miRNA、靶基因mRNA和蛋白表达水平存在差异,其中hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p miRNA含量的变化趋势与各自靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白表达水平总体上成负相关(P<0.05),hsa-miRNA-221与其靶基因PDGF-A的变化趋势无明显负相关关系(P>0.05)。结论诱导hBMSCs成骨分化过程中,hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5p对其相应靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白存在密切调控关系。     

塞来昔布抑制骨髓间充质干细胞的增殖和成骨诱导分化

目的 探讨非甾体类抗炎药塞来昔布对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖和分化成骨的影响.方法 骨髓取自1名健康男性,采用Ficoll-Paque密度梯度离心分离hBMSCs,并进行体外扩增.在细胞增殖和诱导过程中加入不同浓度(12.5、25.0、50.0、100.0 μmol/L)的塞来昔布,采用细胞计数试剂盒(CCK8)方法测定塞来昔布对hBMSCs增殖的影响.使用地塞米松、维生素C等试剂诱导hBMSCs分化成骨,在hBMSCs成骨过程中加入100 μmol/L塞来昔布,通过碱性磷酸酶(ALP)活性分析、钙定量分析等方法测定塞来昔布对hBMSCs成骨的影响,通过Western blot方法检测塞来昔布对hBMSCs分化成骨关键转录因子Runx2表达的影响.结果 塞来昔布的作用呈现剂量依赖性.12.5～100.0 μmol/L塞来昔布对hBMSCs细胞增殖均有抑制作用,该作用随着药物浓度的增加而增强.大剂量的塞来昔布抑制hBMSCs分化成骨中的碱性磷酸酶和钙沉积,并抑制转录因子Runx2的表达.结论 塞来昔布抑制hBMSCs增殖和成骨分化,并与剂量成正相关.长时间使用,尤其是大剂量使用塞来昔布的患者应考虑到其对成骨分化的抑制作用.     

成骨细胞特异性钙黏蛋白基因转染对人骨髓基质干细胞成骨分化影响的研究

目的 观测成骨细胞特异性钙黏蛋白(Cad-Ⅱ)基因转染对人骨髓基质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响. 方法把脂质体介导的Cad-Ⅱ cDNA转染体外分离培养的hBMSCs,检测Cad-Ⅱ蛋白表达变化,并对比观测转染组和单纯成骨诱导组在培养3,7、14、21 d时,hBMSCs碱性磷酸酶(ALP)和骨钙索的表达变化. 结果 转染组和成骨诱导组3 d后开始有ALP的阳性染色,呈棕黑色,7 d开始有骨钙索的阳性染色并随培养时间延长逐渐增多,但各时间点转染组ALP浓度(P=0.008)和骨钙素染色阳性数(P=0.023)均显著高于单纯成骨诱导组.转染组和成骨诱导组从14 d后开始有红色的刚件染色矿化结节出现,结节数目随时间推移而增多. 结论 Cad-Ⅱ基因转染可促进hBMSCs向成骨细胞的分化.     

地塞米松对人骨髓间充质干细胞成脂分化的基因调控

目的观察地塞米松对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）内成脂转录因子PPARγmR—NA和成骨基因Osteocalcin mRNA表达的影响。方法取健康自愿者骨髓，通过梯度离心、贴壁分离培养获得hBMSCs。传代培养第2代hBMSCs8d，随机分为两组，实验组给予10^-7mol／L地塞米松，对照组不给予地塞米松，5d后收集细胞，采用逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测两组细胞中PPARγmRNA和Osteocalcin mRNA的表达。结果用地塞米松处理细胞5d，RT-PCR检测结果显示，实验组hBMSCs内PPARγmRNA呈高表达，对照组hBMSCs内PPARγmRNA呈低表达，两组差异有统计学意义（P〈0．01）。实验组hBMSCs内Osteocalcin mRNA呈低表达，对照组hBMSCs内Osteocalcin mRNA呈高表达，两组间差异有统计学意义（P〈0．01）。结论地塞米松能够调控hBMSCs内成脂转录因子高表达，而抑制其成骨表达，这可能与激素性骨坏死的发生机制有关。     

人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达

目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs,取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定;应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90,具有成脂和成骨分化潜能。成骨相关基因在诱导早期部分表达,中期均有表达,基因表达大部分在14天达高峰,与矿化相关的基因表达在21天达高峰。结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达,其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。     

瘦素对hBMSCs成骨分化的作用及机制研究

目的 探讨瘦素(leptin,LEP)对hBMSCs成骨分化的作用及机制. 方法 采用全骨髓法培养hBMSCs,取第3代hBMSCs分为A、B、C、D、E、F组,待细胞贴壁后各组分别加入400、200、100、50 ng/mL LEP、100 ng/mL BMP和普通培养基2 mL进行培养.于培养后7 d行ALP染色、21 d行矿化结节染色,倒置相差显微镜观察染色结果 ;并于培养后7、14、21 d,检测各组ALP活性、骨钙素(osteocalcin,OCN)水平,筛选LEP的最佳诱导浓度;B、E、F组细胞培养7 d后,采用RT-PCR检测成骨相关基因:核心结合因子(core-binding factor α1,Cbfα1)、ALP、Col Ⅰ、OCN mRNA的表达. 结果 诱导培养7 d,ALP染色结果 显示,A、B、C、D、E组细胞胞浆均呈蓝色阳性着色,F组呈弱阳性;诱导培养21 d,矿化结节染色结果 显示,A、B、C、D、E组细胞染色呈阳性,F组呈阴性.B组培养后7、14、21 d,ALP、OCN活性低于E组,但显著高于其余各组,差异均有统计学意义(P<0.05),200 ng/mL LEP为最佳浓度.B、E、F组细胞培养7d,F组Cbfα1、ALP、Col Ⅰ、OCNmRNA均不表达;B、E组各产物mRNA均有表达,但B组低于E组. 结论 LEP可促进hBMSCs成骨分化,其机制可能为LEP促进了成骨相关基因的表达.     

不同血清对成人骨髓基质干细胞成骨诱导分化的影响

[目的]探讨三种不同来源血清对体外培养成人骨髓基质干细胞(hBMSCs)向成骨诱导分化的作用.[方法]将体外第3代hBMSCs向成骨诱导分化培养,分为胎牛血清组(对照组)、AB 血清组和自体血清组.对比观察细胞碱性磷酸酶(ALP)染色、钙结节染色.诱导培养后4、7、14 d 和 21 d,各血清组分别进行钙黄绿素法荧光显微镜动态观察矿盐沉积,检测 ALP 活性,实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)法检测成骨基因(ALP)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)的表达.[结果]ALP 染色和钙结节染色结果显示,与自体血清(AS)组、胎牛血清(FBS)组相比,AB 血清(ABS)组明显提高了 hBMSCs 的染色阳性率.荧光显微镜下观察诱导 21 d 的 hBMSCs,ABS 组较 FBS 组、AS 组呈现更多的钙盐沉积.ALP 活性结果显示,同一时间点 ABS 组的 ALP 活性均明显高于 FBS 组和 AS 组,差异有统计意义(P<0.05).RT-qPCR 结果显示,在7、14 d 和 21 d,ABS 组 ALP、OPN 和 OCN 成骨基因表达均明显高于 FBS 组、AS 组,其中,ALP 基因表达在 7 d 出现峰值,OPN 基因表达在 14 d 出现峰值,OCN 基因表达在 21 d 出现峰值,差异均有统计学意义(P<0.05).[结论]ABS 对 hBMSCs 成骨分化作用较 FBS、AS 明显增强.ABS 有望替代 FBS 建立符合骨组织工程临床应用要求的体外 hBMSCs 培养体系.     

激素对人骨髓间充质干细胞神经肽受体mRNA表达的影响

目的 观察激素对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)内神经肽受体降钙素基因相关肽受体(CGRPR)、P物质受体(SPR)及过氧化物酶体增殖子活化受体γ(PPARγ)、成骨转录因子Runx2等基因表达的影响.方法 密度梯度离心联合贴壁分选法体外分离培养hBMSCs,流式细胞仪鉴定后传至第3代,随机分为两组,实验组细胞给予1 ×107 mol/L地塞米松干预9d,对照组正常培养.观察细胞形态、生长趋势,油红O染色脂肪细胞,实时定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)分析mRNA表达的变化.结果 分离培养的贴壁细胞呈纤维状、漩涡样生长,CD29、CD44表达率为(91.4 ±0.7)％、(93.8±0.5)％,CD34表达率为(2.7±0.8)％.实验组细胞生长缓慢、出现大量肪细胞,对照组细胞增殖旺盛、未见脂肪细胞.RT-qPCR发现实验组CGRPR mRNA、SPR mRNA、Runx2 mRNA的表达显著降低,2△△Ct分别为0.10±0.03、0.16±0.04、0.23±0.05(P均＜0.01).实验组PPARγmRNA表达量2△△Ct是对照组的(5.08±3.37)倍,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 激素能够诱导hBMSCs成脂分化,下调细胞中CGRPR mRNA、SPR mRNA、Runx2 mRNA表达,抑制细胞成骨分化与生长增殖,使骨修复能力不足,这可能与激素性骨坏死的发生机制有关.     

核转录因子κB配体受体激动因子对脑缺血后骨髓间充质干细胞移植神经分化的影响

目的 观察核转录因子(NF)-κB配体受体激动因子(RANKL)在大鼠局灶性脑缺血后人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)移植中对神经功能恢复以及向神经细胞分化的影响.方法 制备SD大鼠左侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,24 h后行BrdU标记hBMSCs和RANKL协同移植,移植后1、7、14、21、28 d观察大鼠神经功能恢复情况,检测移植细胞在体内胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达情况.结果 移植7～21 d,RANKL和hBMSCs协同移植组神经功能恢复明显好于单纯hBMSCs组;21 d时,协同移植组中NSE(4.39%)和GFAP(9.06%)阳性率明显高于单纯hBMSCs组(2.93%和8.03%).结论 RANKL和人骨髓间充质干细胞协同移植可提高大鼠局灶性脑缺血后神经病学预后,提高hBMSCs在宿主体内向神经细胞的分化.     

膝关节后交叉韧带断裂治疗临床分析

目的 对35例膝关节后交叉韧带断裂治疗进行临床分析,重点探讨了有关交叉韧带断裂的治疗问题。方法 经明确诊断后,分析采用胫骨附着处撕脱骨折复位固定手术治疗26例、早期髌韧带中1／3移植重建3例、单纯长腿石膏固定6例。结果 本组病例全部进行随访,随访时间13个月－5年,胫骨附着处撕脱骨折复位固定及髋韧带中1／3移植重建29例为优良、单纯长腿石膏固定6例为差。结论 后交叉韧带断裂后应该及时给予手术修复;膝后外侧手术入路,操作简单,暴露充分;少于3个月的陈旧性病例仍适应手术治疗。     

不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效分析

目的：探讨不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效。方法：2008年3月-2013年2月收治指尖离断患者80例,38例吻合指侧方静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1或1：2或2：2,平均1：2;22例吻合指腹静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1;20例未吻合静脉,术中仅吻合1条动脉,行侧切口或甲床放血。观察各组治疗效果。结果：吻合指侧方静脉组手指全部成活,无一例发生回流障碍;吻合指腹静脉组19例发生静脉危象,其中4例手指坏死;未吻合静脉组20例均发生回流障碍,其中6例手指坏死。58例获随访,随访时间6~28个月。吻合指侧方静脉组32例,指尖外形佳、指腹饱满;吻合指腹静脉组14例,指体轻度萎缩,指甲生长不平整;未吻合静脉组12例,指体萎缩明显。吻合指侧方静脉组指甲生长近平整,长度长于其他两组[（14.4±3.2）mm比（12.5±2.3）mm和（12.2±2.2）mm],远侧指间关节活动度大于其他两组[（63±5）°比（48±3）°和（45±7）°],两点分辨觉小于其他两组[（4.6±0.4）mm比（7.1±1.2）mm和（7.3±0.6）mm],感觉级别高于其他两组[S（3.45±0.39）级比S（2.57±0.42）级和S（2.55±0.49）级],差异均具有显著性（P〈0.05）。吻合指腹静脉组和未吻合静脉组在指甲长度、运动和感觉方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：吻合指侧方静脉能有效解决指尖再植静脉回流问题,可避免回流障碍,成活率高,促进指甲生长,可恢复 DIPJ 活动度及感觉。     

胫骨干骨折的手术治疗对策

目的：明确不同固定器械在胫骨干不同骨折类型固定中的特点，以指导临床应用。方法：68例胫骨干骨折，行加压钢板螺钉、交锁髓内钉、单侧外固定架固定后，作临床疗效分析。结果：加压钢板固定组42例，感染5例，骨不连1例，平均愈合时间3．8个月；交锁髓内钉固定组13例，无感染及骨不连，平均愈合时间5．4个月；单侧外固定架组13例，骨不连1例，踝关节背伸受限3例，平均愈合时间4．5个月。结论：胫骨骨折交锁髓内钉固定并发症少，功能恢复好，适用范围广，但要注意及时进行动力加压。加压钢板及外固定架固定应选择各自的最佳适应证，以达到理想的疗效。