丙型肝炎病毒C区部分基因的克隆表达及抗原性

目的 研究丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）不同长度Ｃ蛋白片段在大肠杆菌中的表达和纯化及其抗原性。方法 应用核酸及蛋白分析软件对Ｃ蛋白的抗原决定簇预测分析,以ＰＣＲ方法扩增３段长度分别为２０１ｂｐ,４０２ｂｐ及５９１ｂ;ｐ的Ｃ基因片段,通过基因体外重组技术克隆到ｐＧＥＸ－３Ｘ表达质粒中,用所获重组蛋白免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠并应用ＥＬＩＳＡ法对银川市动物系列稀释血清进行抗体测定和     

突变乙型肝炎病毒核心蛋白的克隆及表达

目的 克隆并表达发生长片段缺失的HBV核心蛋白(HBV-C)基因,并对其进行DNA序列、蛋白质结构和抗原性分析.方法 采用PCR方法从1株野生型HBV基因组中扩增得到发生长片段缺失的HBV-C基因,克隆至pUCm-T质粒,进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析;再将基因编码区克隆至原核表达载体pET-28a,构建含HBV-C基因的重组表达质粒,转化至大肠埃希菌BL21中进行诱导表达并检测其抗原性.结果 PCR扩增出的HBV-C基因长度经序列分析表明,其核苷酸序列缺失了220 bp至317 bp之间的98个碱基,造成从第74个氨基酸起发生移码突变并失去了抗原性.结论 成功克隆和表达了发生长片段缺失的HBV-C基因.     

丙型肝炎病毒F蛋白抗原性及患者血清F抗体流行率的研究

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白的抗原性及患者血清F抗体的流行率。方法利用11条引物延伸获处HCV f基因,以此为模板经聚合酶链反应扩增得到截短型f65基因片段,定向克隆至pET32a(+),重组子转化大肠杆菌Plyss菌株,异丙基β半乳糖苷诱导后用镍离子树脂纯化HCV F65蛋白。以F65蛋白为抗原,酶联免疫吸附法检测HCV感染者血清中F抗体。应用F65蛋白免疫新西兰大白兔制备多克降F抗体,再用葡萄球菌A蛋白树脂纯化兔血清中F抗体。结果成功构建了pET32a(+)f65重组子,表达并纯化了分子量为3．2×10~4的HCV F65蛋白。30份HCV患者血清F抗体的A_(450)为0．125+0．061．F抗体阳性率为63．3%。获得了兔源性F抗体,该抗体与HCV F65蛋白发生特异性结合反应,滴度为1：30000。结论HCV F65蛋白具有抗原性,可用来检测血清中F抗体。HCV患者血清中存在F抗体。兔源性F抗体可用来检测HCV F蛋白。     

鼠疫菌特异基因的克隆表达和抗原性分析

目的 在大肠埃希菌中克隆表达鼠疫菌特异基因(YPO1089.pst、ymt),分析重组蛋白的抗原性.方法 利用PCR技术扩增目的 基因,PCR产物经纯化、双酶切后,与质粒载体pET-30a(+)相连接并转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞.经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达目标蛋白,并进行10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白免疫印迹分析其特异性,最后采用亲和层析法纯化诱导表达的融合蛋白.结果 成功构建了pET-YPO1089、pET-pst和pET-ymt 3个重组表达质粒,经优化诱导表达条件,重组的rYP01089、rPst和rYmt在大肠埃希菌中均得到了稳定高效地表达;免疫印迹结果表明重组的rPst可与鼠疫阳性血清发生特异性的免疫反应;目标蛋白经纯化后纯度可达95%以上.结论 鼠疫菌的特异性抗原能够在原核蛋白表达系统中获得高效表达,rPst具有敏感且特异的免疫学特性,实验结果为开发新型鼠疫诊断试剂奠定了基础.     

JC病毒t抗原的融合蛋白表达及抗体制备

目的 构建JC病毒t抗原的原核融合蛋白表达载体,表达并纯化该融合蛋白.方法 采用PCR方法 从患者脑脊液中扩增JC病毒t抗原,测序正确后再克隆入pET32a(+)质粒,构建pET32a(+)-t表达重组体,并诱导表达t抗原融合蛋白.大量制备该融合蛋白并以镍柱亲和层析纯化.然后以纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果pET32a(+)-t表达出相对分子质量为41 000左右的重组蛋白.十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示,异丙基-βD-硫代半乳糖苷诱导后3.5～20.0 h融合蛋白均高水平表达.Western印迹证实具有良好的抗原性,免疫BALB/c小鼠后,成功制备了鼠多克隆抗体.结论 成功构建原核表达载体pET32a(+)-t,表达纯化t抗原融合蛋白,成功制备了JC病毒小包膜蛋白t的抗体,为进一步流行病学调查及该基因的功能研究奠定了基础.     

不同基因型丙型肝炎病毒Core蛋白HLA-DRBl^＊0311、0401表位预测

目的预测各型丙型肝炎病毒（HCV）Core区的人类白细胞抗原（HLA）-DRB1＊0311及0401抗原表位。方法从NCBI数据库中检索出十条包含六种分型的HCV完整氨基酸序列,使用生物信息学工具剪切Core区氨基酸序列并对其二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数进行预测,选择可能区域预测HLA-DRB1＊0311及0401的抗原表位。结果 HCV Core区二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数预测分析可认为16～28、60～74、98～120区域或为抗原表位区域。HLA-DRB1＊0311预测中,HCV-1a/b、4a、6a预测评分高的区域为28～36,HCV-2a/b为63～71,HCV-3a为29～37,HCV-5a为94～102。HLA-DRB1＊0401中,HCV-1a、2b、4a、6a预测评分高区域为84～92,HCV～5a为120～128,HCV-1b中120～128可以预测到表位但评分低。结论 HCV Core区HLA-Ⅱ类分子抗原表位具有型间差异。     

重组分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32的表达及其抗原性

目的 重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT 6的融合蛋白及卡介苗（BCG）CFP32,分析其抗原性。 方法 用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因。经克隆和测序分析后,分别亚克隆至表达载体pQE-30和pET-23a(+),在大肠埃希菌BL21中表达重组蛋白,予以纯化、 鉴定,Western blot和间接ELISA分析重组蛋白的抗原性。 结果构建了重组表达质粒pQE30-cfp10-esat6和 pET-cfp32,表达了CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32。CFP10-ESAT6蛋白表达量约占菌体总蛋白的15.2%,纯化后蛋白纯度约为92%,浓度为0.456-g/L;CFP32蛋白表达量约占菌体总蛋白的10.6%,纯化后蛋白纯度约为90%,浓度为0.310-g/L。纯化CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32检测结核病的敏感性分别为85.7%和71.4%,特异性均为100%。 结论 重组表达获得具有良好抗原性的重组融合蛋白CFP10-ESAT6和重组蛋白CFP32。     

乙肝病毒核心蛋白的结构与功能及其在抗病毒治疗中的应用

目前，干扰素和5种核苷（酸）类似物被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于慢性乙型肝炎（CHB）的治疗。但干扰素的低应答率和多种不良反应限制了其使用，核苷（酸）类似物的长期应用又具有明显的耐药性。     

人胰腺细胞cDNA文库中丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因的筛选

目的 为进一步研究HCV影响糖、脂代谢机制奠定研究基础.方法 扩增人胰腺cDNA文库并经纯化鉴定后,将文库质粒转化酵母菌株Y 187.诱饵质粒pGBKT7-core转化酵母菌株AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合,在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序,测序结果进行序列比对.结果 筛选出11种与HCV核心蛋白相结合的蛋白基因,包括胰凝乳蛋白酶原B1前体、羧肽酶A1,胰蛋白酶原2、胰凝乳蛋白C、胰蛋白酶1,羧肽酶B1、驱动蛋白家族3B、胰蛋白酶2,线粒体蛋白基因、弹性蛋白酶3A,辅脂肪酶.结论 在筛选出的HCV核心蛋白结合的人胰腺细胞蛋白基因中,部分与糖,脂代谢密切相关.     

丙型肝炎病毒NS3基因酵母表达载体构建及表达

目的　为探讨丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3的功能 ,在真核生物酵母细胞中表达HCVNS3基因。方法　用聚合酶链反应 (PCR)的方法以HCV全长质粒pBRTM/HCV 1为模板扩增HCVNS3基因 ,克隆到 pGEM T载体中 ,双酶切后回收连接到酵母表达质粒 pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质 ,进行十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western免疫印迹分析。结果　成功构建HCVNS3基因酵母表达载体 ,Western免疫印迹显示了HCVNS3在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在 ,相对分子质量为 70 0 0 0。结论　HCVNS3蛋白在酵母中表达成功。     

丙型肝炎病毒F蛋白研究新进展

丙型肝炎病毒(HCV)基因组长度约9.6kb,仅含有单个开放阅读框架(ORF),编码一个由约3010个氨基酸残基(aa)组成的多蛋白.在宿主细胞和病毒蛋白酶的作用下,多蛋白被加工成至少10个成熟的HCV蛋白质:C,E1,E2,p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A和NS5B.HCV C蛋白由191个aa组成,相对分子质量为23000,称为p23蛋白.p23羧基端aa被蛋白酶降解,就得到相对分子质量为21000的成熟C蛋白,称为p21蛋白.p21是HCV的重要结构蛋白,它与HCV RNA结合后形成病毒核心.Xu等[1]证实HCV C基因还可以编码产生一个新的蛋白--F蛋白.近年来F蛋白成为HCV研究的热点之一.     

丙型肝炎病毒F蛋白研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)是世界范围内慢性肝炎的主要病原，约有1．7亿人被感染，常导致严重肝病，包括肝硬化和肝细胞癌(HCC)。HCV是1989年Choo等^[1]应用分子生物学技术克隆成功的一个RNA病毒，属黄病毒科，基因组为正链RNA，长度约为9．6kb，该病毒的基因组含有一个长的开放阅读框架(ORF)，编码一个约3010个氨基酸残基(aa)组成的多蛋白，该多蛋白被细胞和病毒蛋白酶切割产生至少10个病毒基因产     

T-cell antigenic determinants within hepatitis C virus nonstructural protein 3 and cytokine production profiles in hepatitis C

summary . The aim of this study was to further investigate the role of T-helper cells in hepatitis C virus (HCV) infection, focusing on the T-cell antigenic determinants and cytokine profiles of nonstructural 3 (NS3) protein-stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of HCV patients. A total of 12 recombinant proteins of theNS3 region were purified and used to test T-cell proliferative response and antigenic determinants of HCV-seropositive patients. In addition, cytokines produced by antigen stimulated PBMCs were measured. Our data showed that PBMCs from 55.7% (34/61) of HCV patients proliferated to at least one antigen, but PBMCs of HCV seronegative patients did not. In addition, PBMCs from about 82.0% (32/39) HCV-seropositive patients produced significant amounts of cytokines (10 pg/mL). Interestingly, PBMCs from 66% of patients produced TH₂-related cytokines such as interleukin (IL)-4 and IL-5. In mappingexperiments, the data showed multiple T-cell antigenic determinants. Our data demonstrated that NS3 antigen-stimulated PBMCs of HCV patients recognized multiple T-cell antigenic determinants and produced significant amounts of TH₀ or TH₂-related cytokines, which might play a critical role in the chronicity of HCV infection.     

Cloning of the non-structural gene 3 of hepatitis C virus and its inducible expression in cultured cells

ＭＥＴＨＯＤＳＴｈｅｎｓ３ｇｅｎｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｐｌａｓｍｉｄｐＢｎｓ３ｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｐＧＥＭＴ．Ｔｈｅｎ,ｔｈｅｎｓ３ｗａｓｓｕｂｃ...     

Antigenic relevance of F protein in chronic hepatitis C virus infection

The hepatitis C virus (HCV) F protein is a recently described, frameshift product of HCV core encoding sequence of genotype 1a. Its function and antigenic properties are unknown. Using enzyme-linked immunosorbent assay, we assessed the prevalence of anti-F antibodies in 154 patients chronically infected with HCV, 65 patients with other liver diseases, and 121 healthy controls. For this purpose, we expressed a highly purified HCV F recombinant protein from HCV genotype 1a in Escherichia coli. Because the F protein shares the 10 first amino acids with the core protein, the anti-HCV F response was also assessed by a F recombinant protein deleted of its 10 first amino acids [Delta(1-10)-F]. Ninety-six (62%) of the 154 HCV serum samples reacted with the complete F recombinant protein, whereas 39 (25%) showed a weaker anti-Delta(1-10)F reactivity and 150 (97%) had anti-core antibodies. No reactivity against F, Delta(1-10)F, or core was detected in any of the controls. To exclude a potential cross-reaction of anti-F antibodies with anti-core antibodies, a specific enzyme-linked immunosorbent assay was performed for anti-core antibodies. The specificity of anti-F antibodies was confirmed using an F synthetic peptide. The prevalence of anti-F antibodies did not correlate with HCV RNA serum level, genotype, or stage of liver disease. Sequence analysis from 8 anti-F-positive and 5 anti-F-negative serum samples did not reveal any particular difference potentially accounting for their respective anti-F responses. In conclusion, the F protein elicits specific antibodies in 62% of individuals chronically infected with HCV; such anti-F response does not seem to be affected by the F sequence heterogeneity.     

丙型肝炎病毒核心蛋白、Bcl-2、P21Waf1在丙型肝炎中的表达及相互关系

目的　调查丙型肝炎、肝硬化病人组织中的丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白、P2 1、Bcl 2的表达以及相互间关系 ,探讨HCV核心蛋白是否抑制P2 1和促进Bcl 2表达。方法　收集 2 3例HCV表达阳性的肝炎、肝硬化组织 ,采用免疫组化Envision法检测核心蛋白、P2 1、Bcl 2表达 ,并用统计学方法分析三者间的表达关系。结果　HCV核心蛋白和突变P2 1的阳性表达主要位于细胞核中 ,Bcl 2的阳性表达主要位于细胞质 ;HCV核心蛋白表达阳性组织中 ,P2 1阳性表达率仅 13 % ,Bcl 2阳性表达率则达 95 .7% ,三组间比较差异有显著性 (P =0 .0 12 )。HCV核心蛋白和Bcl 2二组间比较差异无显著性 (P =0 .5 61) ;HCV核心蛋白与Bcl 2、p2 1阳性强度两者间P值分别为 0 .0 12和 0 .2。结论　三种蛋白的表达有相关性 ,HCV核心蛋白可能促进Bcl 2蛋白的表达 ,抑制P2 1蛋白表达     

乙型肝炎病毒B和C基因型全基因组的克隆与真核细胞表达

目的 构建B和C基因型重组HBV表达载体,检测其在Huh7细胞内的DNA复制和HBsAg、HBeAg的表达.方法 扩增B和C基因型HBV全基因组,并将其连接于真核表达载体pHY106,将这2个载体分别转染Huh7细胞,以pHY106空载体转染作对照.Southern印迹法检测转染72 h后HBV DNA的复制,实时定量PCR检测转染后24、48、72、96和120 h Huh7细胞内HBV DNA水平,ELISA检测转染后24、48、72、96和120 h细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的表达.结果 成功构建了B和C基因型HBV表达载体.转染Huh7细胞后72 h,Southern印迹法检测到细胞内HBV核心颗粒内的HBV复制中间体,包括松弛环状DNA、双链DNA和单链DNA.实时定量PCR检测发现病毒DNA复制水平可达8 lg拷贝/mL、ELISA结果显示HBsAg和HBeAg的表达于转染后72 h达高峰,然后逐渐下降.结论 成功构建B和C基因型重组HBV真核表达载体,并能在Huh7细胞内高水平复制和表达,为进一步研究HBV的结构与功能、基因表达与调控,以及抗HBV药物的筛选等提供了良好的平台.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS4B蛋白反式激活相关基因.方法以HCV NS4B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交分析.将富集的二次PCR产物与T/A载体连接,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到33个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中28个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析显示,12种已知基因编码蛋白,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS4B反式激活靶基因.结论成功构建了HCV NS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS4B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.