脓毒症小鼠肺微血管内皮细胞细胞因子基因表达

脓毒症及其并发症ＭＯＤＳ一直是外科ＩＣＵ病房的首要死亡原因［１］。目前对脓毒症的发病机制尚不完全清楚,但一般认为其发生与机体的免疫炎症反应密切相关,是过度的炎症反应与代偿性抗炎症反应失衡的结果。内皮细胞作为炎症反应的另一重要参与者,近年颇受重视［２］。本研究制造小鼠脓毒症模型后直接分离肺微血管内皮细胞,在不同时相对肺微血管内皮细胞促炎细胞因子ＴＮＦα、ＩＬ－１β和ＩＬ－６的基因表达进行了动态的观察和比较,以期为ＭＯＤＳ的防治提出可能的新途径。 材料与方法 １．脓毒症模型制作 选用雄性昆明小鼠２４只…     

内皮细胞凋亡在脓毒症小鼠肺微血管通透性改变中的作用

目的 探讨肺微血管内皮细胞凋亡在脓毒症小鼠肺微血管通透性改变中的作用。方法 ２４只雄性昆明小鼠随机分为２组,盲肠结扎穿孔组（ＣＬＰ组）和假手术组（ＳＯ组）;每组再分３ｈ和１２ｈ２个时间点。以流式细胞仪和原位凋亡检测试剂盒检测肺微血管内皮细胞的凋亡。用ＲＴ－ ＰＣＲ的方法检测肺微血管内皮细胞中ｂｃｌ－２基因的表达善况。同时还用尾静脉注射伊文蓝的方法检测了肺微血管通透性的改变。结果 在ＣＬＰ组１２ｈ点     

肝肺综合征大鼠血清对肺微血管内皮细胞Akt表达的影响

目的 探讨肝肺综合征(HPS)大鼠血清对肺微血管内皮细胞(PMVECs)丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)表达的影响.方法 健康3～4月龄SD大鼠30只,雌雄不拘,采用慢性胆管结扎法制备HPS模型.另取正常大鼠,原代培养、纯化及鉴定PMVECs.PMVECs接种于低糖DMEM培养基(10~6/,cm~2)或96孔培养板(200μl/孔),随机分为2组:对照组(C组)和HPS组,每组24皿或90孔,C组不予处理,HPS组加入HPS大鼠血清,血清终浓度为10%.于HPS大鼠血清中孵育24、48和72 h(T_(1～3))时分别采用RT-PCR法和Western blot法检测Akt_1 mRNA、Akt_2 mRNA和Akt_3 mRNA及其蛋白的表达,采用MTr法和~3H-TdR掺人法检测PMVECs增殖情况.结果 与C组比较,HPS组PMVECs增殖增强,Akt 蛋白及其mRNA表达水平上调(P<0.05);与T_1时比较,T_(2,3)时HPS组PMVECs增殖增强,Akt蛋白及其mRNA表达水平上调(P<0.05);与T_2时比较,T_3时HPS组PMVECs增殖增强,Akt蛋白及其mRNA表达水平上调(P<0.05).结论 Akt可能参与了HPS大鼠PMVECs增殖的调节.     

磁扭力刺激人肺微血管内皮细胞模型的建立

目的 观察人肺微血管内皮细胞在磁扭力刺激后肌动蛋白骨架的变化.方法 人工合成整合素胞外保守肽段序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)包被磁珠与人肺微血管内皮细胞孵育2 h后,放入磁扭力刺激仪,通过磁珠的运动牵拉细胞2 h,荧光探针鬼笔环肽(FITC-phalloidine)染色肌动蛋白纤维.结果 磁珠与细胞共孵育2 h后,两者紧密结合;磁扭力刺激后应力纤维形成.结论 磁扭力刺激人肺微血管内皮细胞模型是实施细胞牵拉的理想模型.     

烧伤大鼠血清对心脏微血管内皮细胞内皮素受体的影响

为进一步探讨内皮素参与烧伤后病理生理学改变的机制，分离和培养大鼠心脏微血管内皮细胞，分别用正常大鼠和烧伤在鼠伤后６小时的血清培养心脏微血管内皮细胞１２小时，用放射性配基结合受体分析法，观察烧伤血清对心脏微血管内皮细胞膜内皮素受体亲和及结合容量的影响。结果表明，大鼠心脏微血管内皮细胞膜上只有内皮素受体亚型Ｂ分布，该受体的最大结合容量为１４２±２７ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白，平衡解离常数为１１９±２２ｐｍｏｌ     

烧伤大鼠血清对心脏微血管内皮细胞内皮素受体的影响

为进一步探讨内皮素参与烧伤后病理生理学改变的机制,分离和培养大鼠心脏微血管内皮细胞。分别用正常大鼠和烧伤大鼠(30％TBSAⅢ度)伤后6小时的血清培养心脏微血管内皮细胞12小时,用放射性配基结合受体分析法,观察烧伤血清对心脏微血管内皮细胞膜内皮素受体亲和力及结合容量的影响。结果表明,大鼠心脏微血管内皮细胞膜上只有内皮素受体亚型B分布,该受体的最大结合容量(Bmax)为142±27fmol/mg蛋白,平衡解离常数(Kd)为119±22pmol/L。烧伤血清不影响该受体的Kd值,但使Bmax增加68％,表明烧伤血清上调内皮素受体亚型B。提示烧伤后微血管内皮细胞对内皮素作用的敏感性增加。     

烧伤大鼠血清对心脏微血管内皮细胞内皮素受体的影响

为进一步探讨内皮素参与烧伤后病理生理学改变的机制，分离和培养大鼠心脏微血管内皮细胞，分别用正常大鼠和烧伤大鼠（３０％ＴＢＳＡⅢ度）伤后６小时的血清培养心脏微血管内皮细胞１２小时，用放射性配基结合受体分析法，观察烧伤血清对心脏微血管内皮细胞膜内皮素受体亲和力及结合容量的影响。结果表明，大鼠心脏微血管内皮细胞膜上只有内皮素受体亚型Ｂ分布，该受体的最大结合容量（Ｂｍａｘ）为１４２±２７ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白，平衡解离常数（Ｋｄ）为１１９±２２ｐｍｏｌ／Ｌ。烧伤血清不影响该受体的Ｋｄ值，但使Ｂｍａｘ增加６８％，表明烧伤血清上调内皮素受体亚型Ｂ。提示烧伤后微血管内皮细胞对内皮素作用的敏感性增加。     

小鼠脊髓背根神经节细胞与人微血管内皮细胞共培养对细胞增殖的影响

目的 观察小鼠脊髓背根神经节细胞(DRGC)与人微血管内皮细胞(HMVEC)共培养对细胞增殖的影响,并探讨其机制.方法 分离培养小鼠DRGC,并与HMVEC进行共培养,设为DRGC组、HMVEC组、DRGC+ HMVEC组.噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)及Western blot检测血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)、增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白D1(Cyclin Dl) mRNA及蛋白的表达.结果 细胞培养24h后,DRGC+ HMVEC组相对于DRGC组和HMVEC组的细胞增殖率分别为136.29％和137.45％,细胞增殖能力显著提高(P＜0.05).VEGF、NGF、PCNA和Cyclin Dl mRNA和蛋白的表达在DRGC+HMVEC组中最高,与其他两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 共培养DRGC和HMVEC能够促进VEGF和NGF的表达,并可能通过调控PCNA和Cyclin D1的表达促进共培养体系细胞增殖能力.     

热打击联合脂多糖刺激对人肠上皮细胞SW480释放细胞因子的影响

目的：观察脂多糖（LPS）与热打击分别单独作用与联合作用对人肠上皮细胞SW480释放细胞因子的影响。方法：于37℃、5％CO2标准培养箱中培养人肠上皮细胞株SW480。实验分4组：空白对照组直接收集细胞上清;LPS单独刺激组（LPS组）分别使用0、0．01、0．1、1和10μg／ml的LPS刺激SW480细胞,24h后收集细胞上清;热打击组将SW480细胞进行热打击（42℃,1h）后在标准孵箱分别培养1h和24h后收集细胞上清;LPS＋热打击组将SW480细胞42℃热打击1h后给予上述浓度的LPS刺激,再重新置于标准孵箱中培养,24h后收集细胞上清。各组细胞上清用LiquiChip液相蛋白芯片系统分别检测粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）、7干扰素（IFN-7）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等10种细胞因子／趋化因子的表达分泌水平。结果：单独LPS刺激时呈剂量依赖性诱导SW480表达分泌IL-8,对其余9种细胞因子／趋化因子的表达分泌水平影响不明显。单纯热打击仅诱导SW480细胞表达分泌IL-8的水平升高,且与空白对照组比较,仅热打击24h后IL-8的水平显著增加（P〈0．01）。热打击联合不同浓度的LPS刺激SW480细胞,LPS浓度低时并不影响SW480表达分泌IL-8的水平（P〉O．05）,而高浓度LPS可以显著减少其表达分泌水平（P〈0．05）。结论：人肠上皮细胞SW480作为脏器实质细胞,对炎性刺激仅能产生单一种类的细胞因子,其中LPS单独刺激和一定强度的热打击均可上调SW480分泌IL-8;但高浓度LPS在热环境下可抑制SW480细胞的IL-8表达分泌水平。     

热打击对培养人脐静脉内皮细胞增殖能力的影响

目的：研究梯度热打击对体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的影响.方法：设置培养HUVEC细胞的温度梯度（39、41、43 ℃）进行热打击1 h,相差显微镜观察细胞形态学改变,CCK-8比较细胞增殖率,流式细胞术研究细胞周期改变.结果：与正常对照组比较,1 h热打击结束时,各热打击组均出现部分细胞形态变圆,伪足变短,细胞间隙增大,以43 ℃组为明显.随热打击程度加深,未伸展细胞占培养细胞百分比增加（P〈0.05）.细胞增殖实验显示,与正常对照组比较,热打击后24 h,41 ℃和43 ℃组增殖率显著下降（P〈0.01）,48 h时仅43 ℃组增殖率显著下降（P〈0.05）,至72 h,各热打击组与正常对照组无显著差异.流式细胞术检查显示,1 h热打击结束即刻,与正常对照组比较,各热打击组细胞呈现显著的G0/G1期阻滞,以43 ℃组最显著（P〈0.05）;至48 h时各热打击组细胞周期基本恢复正常.结论：热打击对HUVEC具有细胞毒效应,可抑制HUVEC的增殖,造成细胞周期G0/G1期阻滞.     

热打击对培养肠黏膜上皮细胞IEC-6细胞活性和增殖的影响

目的：研究梯度热打击对体外培养肠黏膜上皮细胞活性和增殖的影响。方法：肠黏膜上皮细胞株IEC-6经培养后分为正常对照组（37℃、5％CO2培养箱培养）及39℃、41℃、43℃热打击组（分别在相应温度培养箱中培养）,相差显微镜观察各组细胞培养1h的形态学改变,CCK8法比较各组细胞培养0、1、3、5、7h的细胞活性和24h增殖率,流式细胞术研究细胞周期的改变。结果：与正常对照组比较,各热打击组各个时相细胞形态变圆,伪足变短,细胞间隙增大,活力下降（P〈0．01）。24h细胞增殖实验显示,与正常对照组比较,39℃组7h及41℃和43℃组各时相增殖率显著下降（P〈0．01）,呈时间及温度依赖关系。流式细胞术检查显示,热打击组细胞呈现细胞周期G0／G1和G2／M期阻滞。结论：热打击对IEC-6细胞具有细胞毒效应,可抑制IEC-6细胞的增殖,造成细胞周期G0／G1和G2／M期阻滞。     

脂氧素A4改善肺微血管内皮细胞炎症损伤的体外实验研究

目的 观察脂氧素A4（lipoxin A4,LXA4）对肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs）炎症损伤的治疗作用。方法 体外培养人PMVECs,第一阶段：分为空白对照组（完全培养基培养）和TNF-α组（分别以5、10、20 ng/mL共培养24 h）,采用MTT法检测各组PMVECs存活率,用针头式滤器检测TNF-α损伤前后PMVECs的单层通透性。第二阶段：分为TNF-α组（20 ng/mL处理24 h）和LXA4干预组（1、10、100 μg/L处理24 h）,检测PMVECs存活率和单层通透性,RT-PCR检测PMVECs IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65 mRNA的表达。结果 （1）5、10、20 ng/mL TNF-α组的PMVECs存活率分别是（76.39±9.3）%、（61.87±11.7）%、（49.54±12.6）%,与空白对照组比较,均显著降低（P< 0.05）,而经1、10、100 μg/L三种浓度LXA4干预后,20 ng/mL TNF-α组的PMVECs存活率均得到提高,其中100 μg/LLXA4干预后的PMVECs存活率为（82.32±8.7）%,有统计学差异（P < 0.01）;（2）与损伤前[（0.021±0.011）mL/min·cm2·kPa]比较,TNF-α处理60、90 min后PMVECs单层通透系数（Kf值）显著增高[（0.067±0.007）和（0.096±0.007）mL/min·cm2·kPa,P< 0.05）],而LXA4干预60、90 min时Kf值则显著降低[（0.039±0.008）和（0.058±0.011） mL/min·cm2·kPa,P< 0.05）];（3）与对照组比较,TNF-α组的IL-1β、VCAM-1、NF-κB p65 mRNA的表达水平均有显著升高（P < 0.01或P < 0.05）,而LXA4干预组显著改善（P< 0.01或P< 0.05）。结论 TNF-α能引起PMVECs的急性炎症损伤,LXA4对TNF-α引起的PMVECs急性炎症损伤有改善作用。     

蛋白酶活化受体1调控Mcl-1和Bax表达介导热打击致人脐静脉内皮细胞早期凋亡的研究

目的:观察热打击人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后蛋白酶活化受体1(PAR1)对凋亡相关蛋白Mcl-1、Bax水平表达调控及细胞早期凋亡的影响,明确PAR1在热打击致HUVECs凋亡中的作用.方法:采用PAR1抑制剂SCH79797 (SCH)、PAR1激动剂TFLLR-NH2(TF)、PAR1 siRNA、PAR1腺病毒过表达预处理HUVECs,给予42℃热打击2h,后于8h提取各处理组总蛋白,western blot检测Mcl-1、Bax、Caspase 3及Cleaved-Caspase 3蛋白表达,流式细胞计数仪检测各处理组细胞早期凋亡.结果:与正常对照组比较,热打击组Mcl-1、Bax、Caspase 3表达增加及Cleaved-Caspase 3活化程度增加(P＜0.05);与热打击组比较,PAR1抑制剂或PARl siRNA联合热打击组Mcl-1表达增加(P＜0.05),Bax减少(P＜0.05),Cleaved-Caspase 3活化程度降低,细胞早期凋亡数目减少(P＜0.05,P＜0.01),PAR1激动剂或PAR1腺病毒联合热打击组Bax表达增加(P＜0.05),Mc1-1表达减少(P＜0.05),Cleaved-Caspase 3活化程度增加,且细胞早期凋亡数目增加(P＜0.05或P＜0.01).结论:热打击HUVECs可发生细胞凋亡,Mcl-1、Bax蛋白表达增加;PAR1通过调控Mcl-1及Bax的表达最终起到促凋亡作用.     

糖皮质激素对骨髓微血管内皮细胞活性氧代谢影响的实验研究

目的糖皮质激素的应用是引起非创伤性股骨头缺血性坏死的主要原因之一。通过研究经糖皮质激素处理后的骨髓微血管内皮细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)的代谢变化,进一步探讨激素性股骨头缺血性坏死的发病机制。方法取行人工全髋关节置换术患者自愿捐献的股骨头内松质骨,利用酶消化法分离培养骨髓微血管内皮细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态。取第3代细胞,分别与不同浓度(0、0.03、0.10、0.30、1.00 mg/mL)氢化可的松培养后,采用MTT法测定细胞增殖抑制率;流式细胞仪观测细胞凋亡率;采用荧光探针检测细胞中ROS含量变化,以及与ROS代谢相关的黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)含量变化。结果原代培养2～3 d后,镜下见单个细胞为梭形,呈铺路石样排列;1周后细胞趋于融合状态。0.03、0.10、0.30、1.00 mg/mL组细胞增殖抑制率分别为20.22%±2.97%、22.94%±4.52%、43.98%±3.35%、78.29%±3.85%,0.30、1.00 mg/mL组的细胞增殖抑制率明显高于0.03、0.10 mg/mL组(P<0.05)。0、0.03、0.10、0.30、1.00 mg/mL组细胞凋亡率分别为0.10%±0.01%、0.23%±0.02%、1.83%±0.04%、6.34%±0.11%、15.33%±0.53%,0.30、1.00 mg/mL组细胞凋亡率明显高于0 mg/mL组(P<0.05)。0、0.30、1.00 mg/mL组ROS含量分别为57.35±7.11、120.47±15.68、166.15±11.57,XOD含量分别为0.017 9±0.000 9、0.028 3±0.001 7、0.067 7±0.004 1;以上两指标3组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论糖皮质激素通过使血管内皮细胞内ROS生成增加,引起氧化应激反应,进而导致细胞功能受损。