重组Persephin腺病毒对6-OHDA损伤神经干细胞的保护作用

【目的】探讨Persephin对6-羟基多巴(6-OHDA)损伤神经干细胞的保护作用。【方法】用RT-PCR法从人胚胎脑获得Persephin cDNA，构建重组Persephin腺病毒。用Western blot方法分析Persephin基因的表达，Hoeehst染色和流式细胞术测定6-羟基多巴对神经干细胞凋亡的诱导作用。【结果】从人胎脑成功克隆了人Persephin cDNA，构建了其腺病毒载体。Western blot证实重组Persephin腺病毒在神经干细胞中的表达，表达的Persephin可抑制6-羟基多巴诱导的神经干细胞凋亡。【结论】Persephin对6-羟基多巴损伤神经干细胞具有保护作用。     

6-羟基多巴对C17.2神经干细胞毒性及 NURR1基因对其保护作用

[目的]初步鉴定C17.2神经干细胞的特性并研究不同浓度6-羟基多巴对C17.2神经干细胞毒性及NURR1基因对C17.2神经干细胞的保护作用.[方法]免疫组化检测神经干细胞特异性抗原nestin,X-gal染色检测LacZ基因的表达,流式细胞仪检测剂量为0.02、0.04、0.06 g/L 6-羟基多巴在添加含有NURR1基因的重组复制缺陷性病毒前后诱发神经干细胞的坏死和凋亡.[结果]C17.2神经干细胞nestin抗原染色阳性,绝大部分细胞呈X-gal染色阳性,0.02 g/L时6-羟基多巴以诱导神经干细胞凋亡为主,随着剂量增加,细胞坏死增多,0.06g/L时则以神经干细胞的坏死为主,NURR1基因过表达能明显减少神经干细胞的坏死和凋亡.[结论]C17.2神经干细胞具有明显的特性,6-羟基多巴诱发的C17.2神经干细胞凋亡或坏死与其剂量有关,NURR1基因对神经干细胞有保护作用.     

6-羟基多巴对C17．2神经干细胞毒性及NURR1基因对其保护作用

[目的]初步鉴定C17．2神经干细胞的特性并研究不同浓度6-羟基多巴对C17．2神经干细胞毒性及NURR1基因对C17．2神经干细胞的保护作用。[方法]免疫组化检测神经干细胞特异性抗原nestin，X—gal染色检测LacZ基因的表达，流式细胞仪检测剂量为0．02、0．04、0．06g／L6-羟基多巴在添加含有NURR1基因的重组复制缺陷性病毒前后诱发神经干细胞的坏死和凋亡。[结果]C17．2神经干细胞nestin抗原染色阳性，绝大部分细胞呈X-gal染色阳性，0.02g／L时6-羟基多巴以诱导神经干细胞凋亡为主，随着剂量增加，细胞坏死增多，0．06g／L时则以神经干细胞的坏死为主，NURR1基因过表达能明显减少神经干细胞的坏死和凋亡。[结论]C17．2神经干细胞具有明显的特性，6-羟基多巴诱发的C17．2神经干细胞凋亡或坏死与其剂量有关，NURR1基因对神经干细胞有保护作用。     

携带SARS-CoV刺突蛋白N端片段重组腺病毒的构建

[目的]构建携带SARS冠状病毒刺突蛋白N端基因片段的重组腺病毒.[方法]从SARS病毒cDNA扩增刺突蛋白N端基因片段(-45～1469nt,截短的S1区,SN),插入腺病毒穿梭质粒pShuttle,通过体外连接法构建重组腺病毒Ad-SN.用Ad-SN感染Vero-E6细胞,通过RT-PCR和Western blot法检测SN的表达.[结果]克隆的SN基因序列与文献报道基本一致;Ad-SN基因组结构与预期一致.在Ad-SN感染的Vero-E6细胞中存在SN基因的转录和分泌型SN蛋白的表达.[结论]体外连接法是一种简便易行的重组腺病毒载体构建方法;重组腺病毒Ad-SN能正确表达分泌型SN蛋白,可用于诱导抗SARS免疫的动物实验研究.     

人血管内皮生长因子165基因腺病毒载体的构建及其在C17.2神经干细胞的表达

[目的]构建含有人血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的重组腺病毒载体并观察其在C17.2神经干细胞的表达,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供基础.[方法]将VEGF165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV,获得重组质粒pAdTrack VEGF165,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV VEGF165,转化体外培养的C17.2神经干细胞.通过RT-PCR、原位杂交、免疫组化、Western blot法检测其在C17.2神经干细胞中的表达.[结果]重组腺病毒AdCMV VEGF165在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011efu/mL.病毒上清液经ELISA检测VEGF165表达的量为(1135±138)ng/L.重组腺病毒转染神经干细胞后有稳定表达.[结论]成功构建pAd VEGF165重组腺病毒,获得了稳定表达VEGF165的神经干细胞克隆,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供了基础.     

人神经营养素-3受体基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

[目的]构建人神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)受体(即酪氨酸蛋白激酶受体C,tyrosine protein kinase C,TrkC)基因重组的腺病毒表达载体.[方法]从人脑组织mRNA中扩增TrkC基因全长cDNA,定向克隆于穿梭质粒pShuttle中,获得一个带有CMV启动子的表达盒.再将表达盒与腺病毒骨架DNA(Adeno-X viral DNA)体外连接,形成重组腺病毒质粒(pAd-TrkC).用pAd-TrkC转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Adeno-TrkC).[结果]TrkC基因RT-PCR扩增产物为2 478 bp.Adeno-TrkC经PCR鉴定为正确重组子.[结论]应用体外连接法已构建了人TrkC重组腺病毒表达载体,这为进一步应用NT-3进行基因治疗中枢神经损伤奠定了基础.     

腺病毒载体介导的VEGF基因转染对C17.2神经干细胞凋亡的影响

[目的]探讨重组腺病毒介导血管内皮生长因子(VEGF)165基因对缺氧状态下对神经干细胞凋亡的作用.[方法]体外培养C17.2神经干细胞,建立神经干细胞缺氧模型;将携带人类VEGF基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞;Western-blot法检测VEGF蛋白的表达;流式细胞术测定细胞凋亡率;Hoechst33342染色荧光显微镜观察凋亡小体.[结果]转染pAdCMV VEGF165的C17.2神经干细胞成功表达VEGF蛋白;缺氧后神经干细胞凋亡率为(19.98%±0.55%),转染pAdCMV VEGF165后的细胞凋亡率为(10.38%±0.48%,P＜0.01),而转染pAdCMV VEGF165 VEGF反义寡核脱氧核酸经干细胞凋亡率为(19.07%±0.64%),与对照组无显著差异(P＞0.05).[结论]腺病毒介导的VEGF165基因能成功表达VEGF;外源性VEGF对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性,有利于神经干细胞的生存.     

腺病毒介导的NEP基因对Aβ25-35诱导的SK-N-SH细胞凋亡的抑制作用

目的    研究脑中性内肽酶(NEP)基因外源表达对神经毒性物质β-淀粉样肽(Aβ25-35)诱导损伤的SK-N-SH细胞凋亡的抑制作用。方法    用脂质体法将含NEP的腺病毒载体转染高代次293细胞,制备高滴度病毒载体,感染Aβ25-35处理的外源损伤的人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞),采用MTT法检测细胞存活率,采用流式细胞术分析细胞凋亡状态和细胞内活性氧水平,采用RT-PCR和Western blot法检测凋亡相关基因bcl-2及bax的表达情况。结果    细胞存活率及流式细胞术检测结果显示,NEP高表达可明显减轻Aβ25-35诱导的细胞凋亡及减低细胞内活性氧水平,RT-PCR和Western blot结果显示,NEP对Aβ25-35诱导的细胞凋亡的抑制作用可能是通过减少促凋亡基因bax的表达以及降低细胞内活性氧水平来实现的。结论    NEP对Aβ25-35诱导的神经细胞损伤具有一定保护作用,其作用机制可能与凋亡相关基因有关。     

H2O2诱导PC12细胞凋亡中MicroRNA表达及bcl-w调控机制

[目的]构建体外H2O2诱导PC12细胞模拟神经细胞凋亡模型[1],研究microRNA(miRNA或微小RNA)在凋亡中表达和bcl-W调控机制,从microRNA角度探讨颅脑损伤后(如缺血再灌注损伤、脑挫伤)凋亡的机制.[方法]体外H2O2诱导PC12细胞凋亡模型,用基因芯片技术筛选变化显著的microRNA,并对其实验验证后,根据现有microRNA数据库提供的靶标的预测分析结果,搜寻其相关的靶标,通过检测细胞凋亡、Western blot、实时荧光定量PCR技术来验证相关microRNA的作用靶点.[结果]成功构建了体外模拟体内神经细胞凋亡模型,通过基因芯片技术筛选出6个显著下调microRNA[2],其中mi-422a与bcl-w蛋白表达量呈负相关.[结论]通过miR-422a可以调控bcl-w蛋白的表达,且存在负性相关关系.通过调节mi-422a的表达可调控bcl-W蛋白的表达量,证实bcl-w上的基因位点有mi-422a的作用位点存在.     

脑溢安对新生大鼠海马神经干细胞缺氧损伤及p38MAPK活性的影响

目的探讨中药脑溢安颗粒(简称脑溢安)对神经干细胞缺氧损伤的影响及其保护作用机制.方法体外培养神经干细胞来自新生3～5 d SD大鼠海马组织,造缺氧损伤模型,用原位末端标记法(TUNEL)进行细胞凋亡检测,应用免疫共沉淀、激酶反应及Western blot技术研究脑溢安对缺氧损伤神经干细胞内p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)活性的影响.结果培养神经干细胞缺氧损伤后发生凋亡,脑溢安能促进缺氧损伤神经干细胞存活及减少神经干细胞凋亡;缺氧损伤后神经干细胞内p38MAPK活性增强,脑溢安血清组p38MAPK活性显著低于模型组和正常血清组(P＜0.01).结论脑溢安能保护缺氧损伤神经干细胞,抑制缺氧损伤激活的p38MAPK信号转导通路可能为其保护作用机制之一.     

腺病毒载体介导的VEGF基因转染对C17.2神经干细胞凋亡的影响

目的探讨重组腺病毒介导血管内皮生长因子(VEGF)165基因治疗对缺氧状态下对神经干细胞凋亡的作用。方法体外培养C17.2神经干细胞,建立神经干细胞缺氧模型。将携带人类VEGF基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,Western-blotting分析VEGF蛋白的表达,并用流式细胞术测定细胞凋亡率的变化。Hoechst33342染色荧光显微镜观察凋亡小体。结果转染pAdCMVVEGF165的C17.2神经干细胞成功表达VEGF蛋白;缺氧后神经干细胞凋亡率为(19.98±0.55)%,而转染pAdCMVVEGF165后的细胞凋亡率为(10.38±0.48)%(P<0.01),转染pAdCMVVEGF165 VEGF反义寡核脱氧核酸经干细胞凋亡率为(19.07±0.64)%,与对照组无显著差异(P>0.05)。结论腺病毒介导的VEGF165基因能高效表达VEGF;外源性VEGF对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性,有利于神经干细胞的生存。     

腺病毒载体介导的VEGF基因转染对C17．2神经干细胞凋亡的影响

OBJECTIVE: To study the effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) gene transfer on hypoxia-induced apoptosis of neural stem cells in vitro. METHODS: C17.2 neural stem cells cultured in vitro were infected by recombinant adenovirus containing VEGF gene and cultured under hypoxic condition. VEGF expression in these cells was detected by Western blotting, and the apoptotic index was calculated from results of triphosphate-biotin nick end-labeling (TUNEL) assay. Flow cytometry was employed to examine the changes in the cell apoptotic rate after VEGF gene transfer, and the apoptotic bodies were observed under fluorescence microscope with Hoechst33342 staining. RESULTS: The expression of VEGF was significantly increased in pAdCMV VEGF(165)-infected cells, resulting in inhibition of the apoptosis of C17.2 neural stem cells induced by hypoxia manifested by a significantly lower apoptotic rate of the stem cells transfected by pAdCMV VEGF(165) than that of the untransfected cells (10.38%;+/-0.48%; vs 19.98 %;+/-0.55%;, P<0.01) and of the cells transfected with pAdCMV VEGF(165) along with VEGF anti-sense oligodeoxynucleotide (19.07%;+/-0.64%;, <0.01) after hypoxia. CONCLUSIONS: Recombinant adenovirus can efficiently mediate VEGF gene transfer into C17.2 neural stem cells, resulting in high expression of the exogenous VEGF in vitro, which effectively reduces C17.2 neural stem cell apoptosis induced by hypoxia.     

腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP的构建和在神经干细胞中的表达

目的研究腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP的构建及其在神经干细胞(NSCs)中的表达。方法通过RT-PCR从大鼠海马中获得BDNF基因,通过基因克隆、HEK293包装,获得含增强绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒表达载体pAd-BDNF-EGFP,将其感染原代培养的神经干细胞,观察EGFP及BDNF2种基因的表达,镜下测定转染率,并检测RT-PCR产物,证实BDNF的存在。转染后的神经干细胞经G418筛选,抗性细胞传代扩增后获得成功转染BDNF基因的NSCs克隆。结果荧光显微镜下可见感染后的NSCs表达EGFP而发出绿色荧光;通过RT-PCR证明感染后的NSCs具有表达BDNF的能力;用ELISA鉴定细胞上清中分泌的BDNF,72h的含量达到最高值,为12.78ng/mL;证明通过构建病毒的感染可以使神经干细胞获得分泌BDNF的能力,且EGFP基因可作为神经干细胞移植研究中良好的示踪剂。结论腺病毒病毒介导EGFP基因及BDNF基因在大鼠胚胎神经干细胞中成功表达,为应用以神经干细胞直接作为基因靶细胞,介导基因治疗中枢神经系统疾病奠定了基础。     

大鼠促红细胞生成素重组腺病毒载体的构建及其在大鼠SGNs中的表达

目的构建大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)重组腺病毒载体,并转染于体外培养的大鼠螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)。方法全基因合成大鼠EPO基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-EPO。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PacⅠ酶切线性化后电转化感受态细胞,获得重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO,经PacⅠ酶切后转染至293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。并转染至体外培养的螺旋神经元,免疫荧光检测及蛋白水平检测螺旋神经元中EPO表达。结果经KpnⅠ、HindⅢ酶切与测序鉴定显示,腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO构建成功,重组腺病毒AdEPO在293细胞中成功包装,扩增后病毒滴度为1.17×1011U/ml;经RT-PCR和Western blot检测EPO在293细胞中成功表达。重组腺病毒载体AdEPO经鉴定均构建正确;免疫荧光及Western blot检测转染腺病毒后螺旋神经元中EPO表达显著增强。结论成功构建了EPO重组腺病毒载体,并成功转染螺旋神经元,可显著增强螺旋神经元中EPO表达水平。     

人骨形成蛋白7基因的克隆及其在兔骨髓基质干细胞中的瞬时表达

目的克隆人骨形成蛋白7(BMP-7基因,并构建其真核表达载体,观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达并探讨其应用于骨科局部基因治疗的可能性.方法用RT-PCR法从人胎肾组织中克隆人BMP-7基因全长cDNA并测序.将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体pShuttle中构建表达载体pShuttle-BMP-7,经鉴定后利用LipofectAMINE2000瞬时转染rBMSC,用RT-PCR方法及免疫组化检测BMP-7基因的表达.结果用RT-PCR法从胎肾组织中克隆出1296 bp的cDNA,测序证实为人BMP-7基因.RT-PCR方法及免疫组化检测证实其能在rBMSC中表达.结论成功克隆人BMP-7基因并证实其在rBMSC的表达,为下一步腺病毒介导的局部基因治疗打下基础.     

携SH2-Caspase8融合基因重组腺病毒的构建及对K562细胞增殖的影响

目的构建并鉴定携SH2 -Caspase8融合基因的重组腺病毒AdE-SC-EGFP及其突变体,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法采用RT-PCR、重叠PCR扩增SH2-Caspase8融合基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdT-SC-EGFP,进行酶切和测序鉴定。将PmeⅠ酶...     

人白介素24基因克隆表达、纯化及活性检测

目的克隆人IL-24基因,构建原核表达载体,表达纯化GST-IL-24融合蛋白,检测其活性。方法用密执毒素诱导HeLa细胞表达IL-24 mRNA,通过RT-PCR获取IL-24cDNA,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,IPTG诱导表达,经GSTrap TMF Fcolumn亲合纯化,SDS-PAGE和Westernblot检测融合蛋白的表达,MTT法检测GST-IL-24对宫颈癌CaSKi细胞的抑制作用。结果克隆得到人IL-24的cDNA,序列与GenBank公布序列完全一致,SDS-PAGE电泳可见50kD大小的融合蛋白表达。GST-IL-24以剂量依赖的方式抑制宫颈癌CasKi细胞的生长。结论成功构建人IL-24基因原核表达载体,表达纯化得到GST-IL-24,该融合蛋白对宫颈癌CasKi细胞具有抑制作用。     

大鼠BDNF基因复制缺陷型重组腺病毒的构建与鉴定

 【目的】构建携带大鼠脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并初步检测其体外表达目的基因的能力。【方法】提取大鼠脑组织总RNA，使用RT—PCR方法扩增BDNF目的基因并将其克隆入pMD18-T Simple载体测序，将测序完全正确的BDNF目的基因克隆入pShuttle2中，然后利用体外连接法将BDNF目的基因克隆入Adeno—X^TM腺病毒骨架中。Lipofectamine^TM 2000法转染HEK293细胞包装携带BDNF目的基因的重组腺病毒，少量提取重组腺病毒DNA检测证实为复制缺陷型BDNF基因重组腺病毒后大量扩增。蛋白电泳及Western blot法初步检测BDNF目的基因在HEK293细胞中的表达。【结果】成功构建了携带大鼠BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒。并证实其在HEK293细胞中可高水平表达BDNF目的基因。【结论】利用体外连接法可方便、快捷地构建携带BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并可在体外高水平表达表达其所携带的目的基因。     

人前列腺特异性膜抗原胞外区基因重组腺病毒的构建

目的:体外构建和表达人前列腺特异性膜抗原胞外区(tPSMA)基因重组腺病毒。方法:首先设计一对含BglⅡ和HindⅢ酶切位点的tPSMA引物,以质粒pCR3.1-Uni-hPSMA为模板,通过PCR扩增tPSMA并克隆到腺病毒穿梭质粒中,获得pAdTrack-CMV-tPSMA质粒,将其与含有pAdeasy-1的BJ5183菌电转化,筛选阳性克隆,重组子经线性化后转染HEK293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达、RT-PCR、Western blot法检测目的基因tPSMA的表达。结果:成功构建了含tPSMA的重组腺病毒载体Ad-tPSMA,病毒滴度为2.0×1011pfu/L。结论:该重组腺病毒的构建为下一步研究用其制备树突状细胞疫苗基因治疗提供基础。