兔心房室结细胞的分离及鉴定

为进一步从细胞水平研究房室结区的特点和功能，需获得形态和功能正常房室结区细胞。本文用快速，恒压的低钙，无钙和胶原酶Tyrode液相继灌流家兔心脏冠脉系统后，结合解剖部位再经KB液或低钙台氏液存放，可获得耐钙的游离的房室结细胞、心房肌和心室肌细胞。用全细胞电流记录房结内梭状和柱状细胞的动作电位参数。此细胞保持了在未损伤的房室结区细胞的电流特性，且与心房肌、心室肌比较明显较短和薄，很多细胞保持了良好的自主活动性，为在细胞水平上研究房室结电生理特性提供了可能。     

组织块法培养成年兔肌腱细胞

背景:体外分离培养肌腱细胞,熟悉其生物学特性是研究肌腱愈合机制、改善肌腱愈合内环境的前提和基础。目的:采用组织块法体外培养成年兔肌腱细胞,观察其细胞形态、生长增殖情况以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达。方法:无菌条件下取成年新西兰白兔双侧后肢趾屈肌腱,手术显微镜下剥离、去除肌腱外膜组织,剪成组织小块,0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶Ⅰ消化10～15min,离心去上清,将组织小块转移到培养瓶中,贴壁后加入1mL培养液,待细胞游出贴壁生长时,再加培养液继续培养,每3d换液1次,当细胞长到80%～90%融合时按1:3传代。结果与结论:一般10d左右细胞会从组织块游出贴壁生长,此时细胞多呈星形或不规则形,随着时间延长细胞逐渐增多,呈梭形的成纤维细胞样。传代细胞刚接种时圆形,4～6h开始贴壁并伸展为梭形,排列逐渐规则成群。从传代细胞的生长曲线可看出,前4d细胞生长较慢,为潜伏期,第5天后进入快速增殖期,7d以后进入平台期。免疫荧光法证实Ⅰ型胶原染色阳性,而Ⅲ型胶原染色呈阴性。结果表明采用组织块法可在体外成功培养成年兔肌腱细胞。     

伊东细胞的简便分离,培养及鉴定

采用高分子聚蔗糖和泛影葡胺，成功配制出适用于伊东细胞（Itocells）分离的非连续密度梯度分层液。该方法的细胞得率为3．35X10’个／大鼠，存活率95％，纯度gi％以上，优于Friedman［‘j报道的结果。该方法的建立对推动肝纤维化发生机制研究具有重要意义。1材料与方法1．l动物及试剂：雄性纯种Wistar大鼠20只，体重400～500g，由第三军医大学实验动物中心提供，普通饲料喂养。高分子聚蔗糖、泛影葡胺，根据公式：PIVI＋P。V，＿。。＿＿＿．t＿。p；。一X于十号上配制成密度分别为1．080、1．058、VI＋V”“’”“——。——。J。。…     

兔膝关节软骨细胞的分离培养及形态学特征

背景:软骨细胞是软骨破坏过程中的靶细胞,也是分泌炎性细胞因子的主要细胞之一,体外分离培养骨关节炎软骨细胞存在难度.目的:对兔膝关节软骨细胞进行分离和培养,观察兔软骨细胞的形态学特性.方法:4周龄新西兰白兔采用机械-酶消化法,通过调整胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶的浓度及消化时间来获得较纯的关节软骨细胞,传代培养.通过倒置相差显微镜下观察细胞形态、绘制生长曲线、苏木精-伊红染色、阿利新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫荧光染色对细胞进行鉴定.结果与结论:原代培养的软骨细胞以多角形或三角形为主,传代3次后出现反分化.形态学、免疫荧光染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定,90%以上的软骨细胞维持多角形或三角形,核为圆形或椭圆形.苏木精-伊红阳性染色为细胞核呈紫蓝色,软骨细胞基质红染,胞浆及细胞周围有紫红色、阿利新蓝染色可见细胞浆和胞膜呈深蓝色、Ⅱ型胶原免疫荧光染色可见胞浆和胞膜清晰绿色荧光,细胞核区域未见明显绿色荧光.结果提示,实验成功建立了软骨细胞分离、培养体系,且3代以内90%以上的软骨细胞生长良好.     

不同区域的肌腱组成细胞的增殖能力及其行为差异

背景目前已经证实肌腱具有内在愈合的潜能,但不同区域的肌腱组成细胞在修复过程中的增殖能力及行为差异还有待进一步研究.目的研究不同区域的肌腱组成细胞在体外培养过程中的增殖能力及行为学差异.设计重复测量设计.地点和对象南通医学院第二附属医院骨科.白色纯种Leghorn鸡15只,雌雄不拘,体质量约400 g,购自南通医学院动物中心.方法将鸡Ⅱ区趾深屈肌腱立体分割成4区腱外膜组织、外膜下腱组织、亚中心腱组织、中心腱组织.两相同区域肌腱组织按间隔0.5,1,2 mm 3种排列方式培养于24孔培养板中,每种排列方式培养5孔.完整肌腱段组织也以相同方式培养作为对照.每天计数每种排列方式细胞游出数目、方向及来源,培养第9天作组织学检查.主要观察指标①不同区域的肌腱组织细胞增殖能力及其行为.②立体分割的肌腱段组织体外培养后的组织学变化.结果细胞游出最早、数目最多的组织为腱外膜组织,其他依次为亚中心腱组织、中心腱组织、外膜下腱组织.两腱外膜组织间距越小细胞游出越早,而其他区域的肌腱组织则相反.组织学检查显示培养第9天的完整肌腱段组织,表面腱外膜细胞明显增殖;外膜下腱组织、亚中心腱组织内的腱内膜细胞与培养前相比,差异无显著性意义(t=2.31,P＞0.05);中心腱组织的腱内膜细胞(84±3)较培养前(167±5)减少,两者间差异有非常显著性意义(t=58.08,P＜0.01).培养第9天的中心腱组织,其腱内膜细胞(237±3)比培养前(167±5)增多,两者差异有非常显著性意义(t=33.73,P＜0.01).结论不同区域的肌腱组成细胞在体外培养过程中的增殖能力及行为存在差异.     

兔骨髓源性血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定

本研究探讨兔骨髓源性血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)的分离、培养及鉴定方法。抽取兔骨髓细胞,用梯度密度离心法获得单个核细胞,以内皮细胞培养液培养,通过细胞形态观察、免疫组织化学试验、流式细胞术以及内皮祖细胞吞噬功能进行鉴定。结果表明,新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养48小时后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接呈梭形的内皮样细胞。内皮祖细胞免疫组织化学检测结果显示CD133(+),CD34(+),Ⅷ因子(++),KDR(++);流式细胞术鉴定结果显示CD133的阳性率为(18.23±7.12)%,CD34的阳性率为(47.71±14.85)%,CD31的阳性率为(71.61±13.51)%,KDR的阳性率为(87.24±11.40)%。细胞吞噬功能鉴定说明超过80%的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-acLDL和FITC-UEA-1。结论:密度梯度离心法体外分离兔骨髓源的单个核细胞,在一定的诱导培养条件下能分化成为血管内皮祖细胞。     

转化生长因子β1受体在肌腱愈合过程中的表达变化

目的:了解兔屈趾肌腱Ⅱ区伤口愈合过程中转化生长因子β1受体在不同时间和部位的表达情况。方法:实验于2004-09/2005-07在青岛大学医学院附属医院动物实验中心完成。①实验材料:清洁级成年新西兰大白兔42只,体质量4.0～4.5kg,雌雄不拘。②实验干预及分组:36只成年新西兰大白兔左前中趾Ⅱ区屈趾深肌腱被完全切断并修复为实验组,分别于1,7,14,21,28,56d获取肌腱,每个时间点6只;另取6只兔,不损伤和修复屈趾肌腱做对照组。③实验评估:用Western blot和免疫组织化学技术分析两组转化生长因子β1受体的表达差异。结果:①Western blot发现实验组切断修复后的肌腱转化生长因子β1受体蛋白的上调,主要集中在腱鞘、腱外膜和沿肌腱切口处,在14d达到高峰至56d才明显降低;对照组只见极少的受体表达。②免疫组织化学染色结果与Western blot是一致的。结论:肌腱损伤修复后,肌腱和腱鞘转化生长因子β1受体的表达明显增加,在术后14d达到高峰,56d开始降低,这种受体上调可能为屈指肌腱术后瘢痕形成的生物学调节提供新的途径。     

SD大鼠肝脏星状细胞分离培养及方法的改进

目的：建立高效、简便的肝星状细胞分离方法.方法：采用改良原位灌流、12%Optiprep密度梯度离心法分离大鼠肝星状细胞,desmin和α-SMA 免疫细胞化学检测鉴定星状细胞性质.结果：肝星状细胞的得率稳定在3×10^7/肝以上,纯度为95%左右,存活率为98%,传代培养10代以上,细胞增殖及转分化状态仍良好.结论：肝星状细胞分离培养成功,对分离方法的改进措施可行.     

人滑膜细胞的分离培养与鉴定

[目的]建立人滑膜细胞体外分离培养的方法，为进一步的实验研究奠定基础。[方法]分别用胶原酶消化法及组织块培养法分离和培养人滑膜细胞，并通过形态学和免疫组化进行鉴定。[结果]培养的滑膜细胞具有成纤维细胞的形态和特征；免疫组化染色显示Vimentin阳性，CD68阴性，滑膜细胞呈长梭形极向生长。[结论]两种方法均成功的培养出了人滑膜细胞，适合做为实验研究的靶细胞。     

兔骨髓基质细胞分离操作基础

目的 建立简单有效的兔骨髓基质细胞分离方法,从而获得较多的骨髓基质细胞.方法 采用密度梯度离心法与细胞贴壁法相结合,充分分离骨髓中的杂质细胞.结果 可以获得较多的骨髓基质细胞.结论 此方法简单有效,可以为进一步实验提供基本条件.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

新西兰兔关节软骨细胞分离培养与鉴定的实验研究

目的 探讨新西兰兔关节软骨细胞体外分离、培养及鉴定的实验方法.方法 单纯采用Ⅱ型胶原酶消化新西兰兔关节软骨组织以分离软骨细胞,经体外培养后,以形态学观察、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原蛋白细胞化学染色对软骨细胞进行鉴定.结果 倒置相差显微镜显示3代以内软骨细胞呈多角形或三角形,核为圆形或椭圆形;甲苯胺蓝染色可见细胞呈紫蓝色,细胞基质呈蓝色;Ⅱ型胶原蛋白细胞化学染色可见胞浆及胞膜出现棕黄色颗粒,细胞基质内也有少量棕黄色颗粒.结论 成功建立了新西兰兔关节软骨细胞分离及培养体系,3代以内软骨细胞生长良好,保持稳定的生物学特征,传代4次后出现"去分化"现象.     

人表皮干细胞的分离、纯化培养及鉴定

目的对人表皮干细胞（human keratinocyte stem cells,hKSCs）进行分离、纯化培养及鉴定,探索一种高效分离及纯化培养hKSCs的途径,为组织工程皮肤的构建提供种子细胞。方法利用酶消化法分离hKSCs,快速粘附法纯化hKSCs并进行无血清培养,倒置相差显微镜观察形态变化;以角蛋白19（cytokerafin,CKl9）及整合素岛、p63为一抗,利用激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope,砌）对原代培养的细胞进行免疫细胞化学检测。结果经快速粘附法筛选的细胞在相差显微镜下观察形态一致,呈上皮样生长;LSCM下CK19及整合素β1、p63均呈阳性反应,初步证实分离出的细胞为hKSCs。结论成功建立了hKSCs分离、纯化和培养的方法,为组织工程皮肤的研究提供了理论与实验基础。     

大鼠脂肪源性干细胞的分离培养及鉴定

背景:脂肪源性干细胞在体外易于培养,增殖快,具有多向分化潜能。目的:构建一种体外分离培养SD大鼠脂肪源性干细胞的方法,并对其部分生物学特性与表型进行分析。方法:切取SD大鼠腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化,分离大鼠脂肪源性干细胞,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色及油红O染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。结果与结论:体外培养的脂肪源性干细胞呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈"S"型。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色阳性;成脂诱导实验组油红O染色阳性;对照组均为阴性。细胞CD29,CD44,CD105表达阳性,CD31,CD45表达阴性。提示SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的脂肪源性干细胞在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型。     

大鼠脂肪源性干细胞的分离培养及鉴定

背景：脂肪源性干细胞在体外易于培养,增殖快,具有多向分化潜能。目的：构建一种体外分离培养SD大鼠脂肪源性干细胞的方法,并对其部分生物学特性与表型进行分析。方法：切取SD大鼠腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化,分离大鼠脂肪源性干细胞,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色及油红O染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。结果与结论：体外培养的脂肪源性干细胞呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈＂S＂型。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色阳性;成脂诱导实验组油红O染色阳性;对照组均为阴性。细胞CD29,CD44,CD105表达阳性,CD31,CD45表达阴性。提示SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的脂肪源性干细胞在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型。     

大鼠触须毛囊干细胞的分离培养和鉴定

背景:毛囊干细胞在体内膀胱及周围组织环境作用下有可能向尿路上皮细胞和平滑肌细胞分化,成为目前研究较新的干细胞之一。目的:建立一种高效简单的分离培养和鉴定毛囊干细胞的方法。方法:取大鼠触须部皮肤组织,体式显微镜下分离出毛囊组织,中性蛋白酶Ⅱ与胰蛋白酶和乙二胺四乙酸混合液两步酶法消化;所得细胞悬液中添加含体积分数10%胎牛血清的角质细胞无血清培养基,Ⅳ型胶原差速贴壁法筛选毛囊干细胞,20min以内贴壁的细胞作为实验组,未贴壁的细胞作为对照组;待筛选后的细胞生长至70%～80%汇合后,进行传代培养。结果与结论:筛选后的细胞形态均匀一致,折光性强,呈典型的铺路石状。透射电镜显示细胞处于原始状态。流式细胞仪检测实验组CD34和β1整合素的表达分别为(39.52±19.57)%和(93.46±4.73)%,对照组相应为(19.20±11.53)%和(63.57±14.42)%,两组间差异有显著性意义(P<0.05)。结果表明联用显微分离技术、二步酶法及差速贴壁法筛选可以获得纯度较高的毛囊干细胞。CD34和β1整合素表达是较理想的鉴定方法。     

大鼠触须毛囊干细胞的分离培养和鉴定

背景：毛囊干细胞在体内膀胱及周围组织环境作用下有可能向尿路上皮细胞和平滑肌细胞分化,成为目前研究较新的干细胞之一。目的：建立一种高效简单的分离培养和鉴定毛囊干细胞的方法。方法：取大鼠触须部皮肤组织,体式显微镜下分离出毛囊组织,中性蛋白酶Ⅱ与胰蛋白酶和乙二胺四乙酸混合液＂两步酶法＂消化;所得细胞悬液中添加含体积分数10%胎牛血清的角质细胞无血清培养基,Ⅳ型胶原差速贴壁法筛选毛囊干细胞,20min以内贴壁的细胞作为实验组,未贴壁的细胞作为对照组;待筛选后的细胞生长至70%～80%汇合后,进行传代培养。结果与结论：筛选后的细胞形态均匀一致,折光性强,呈典型的＂铺路石状＂。透射电镜显示细胞处于原始状态。流式细胞仪检测实验组CD34和β1整合素的表达分别为（39.52±19.57）%和（93.46±4.73）%,对照组相应为（19.20±11.53）%和（63.57±14.42）%,两组间差异有显著性意义（P〈0.05）。结果表明联用显微分离技术、二步酶法及差速贴壁法筛选可以获得纯度较高的毛囊干细胞。CD34和β1整合素表达是较理想的鉴定方法。     

经血源性子宫内膜间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景:目前用于干细胞研究的主要来源为胚胎干细胞和骨髓干细胞,但这两种来源都存在着部分局限性,因此需要寻找一种新型的干细胞以克服肿瘤形成的潜在性、标本来源的缺乏及伦理学的争议等弊端. 目的:分离培养经血源性子宫内膜间充质干细胞并进行鉴定.方法:采用Ficoll密度梯度离心法分离出人经血源性子宫内膜间充质干细胞,对细胞的形态及生长特性进行观察;采用流式细胞仪对细胞表面抗原CD29、CD44、CD34 、CD45、HLA-ABC及HLA-DR进行表型鉴定;免疫细胞化学法测定经血源性子宫内膜间充质干细胞中nestin阳性细胞表达.结果与结论:应用Ficoll密度梯度离心法可以从女性月经血中分离培养出干细胞,约2周原代细胞达到80%～90%融合,细胞呈漩涡状、网状、辐射状.传代后能稳定生长,可见纤维样细胞形态为主导.流式检测结果显示,经血源性子宫内膜间充质干细胞表现出CD29强阳性,CD44阳性,CD34 、CD45 、HLA-DR阴性,低表达HLA-ABC.染色显示nestin抗原在经血源性子宫内膜间充质干细胞中有表达,约占经血源性子宫内膜间充质干细胞的(10.35±0.51) %.结果表明经血源性子宫内膜间充质干细胞表达间充质干细胞的标记物,具低免疫源性;经血源性子宫内膜间充质干细胞表达nestin抗原,为经血源性子宫内膜间充质干细胞在神经系统应用提供一定的理论依据.     

脂肪间充质干细胞的分离培养和鉴定

背景:近年来的研究发现,在脂肪组织中也存在这与骨髓间充质干细胞类似的间充质干细胞.脂肪组织可以从美容吸脂中获得,来源丰富,取材方便,蕴藏着巨大的临床应用价值.目的:分离培养人脂肪间充质干细胞并检测其生物学特性.方法:用离心的方法获得人脂肪间充质干细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中行贴壁培养.并进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原.结果与结论:采用消化、离心分离获得的脂肪间充质干细胞大小较为均匀,呈梭形或星形的成纤维细胞样.细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期,至第9天后数量减少;流式细胞仪检测表明超过90%细胞为CD29、CD45和CD105阳性.提示体外分离培养脂肪间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞.