ICR小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备

背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性,且效果优于无饲养层单独添加一些细胞因子,而且可以为上述两种细胞提供类似的胚胎发育环境.目的:建立稳定高效的ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于培养人胚胎干细胞及诱导多能性干细胞.方法:使用胰蛋白酶消化法分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察不同的胰蛋白酶水平及消化时间对获取小鼠胚胎成纤维细胞的量及其增殖活性的影响;利用不同质量浓度丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞1,1.5,2,2.5,3,3.5 h制备饲养层细胞,MTT法检测其增殖活性,探索其制备饲养层的最佳条件.结果与结论:分离ICR小鼠胚胎原代成纤维细胞最佳胰蛋白酶浓度为0.05%,消化时间为12～15 min,丝裂酶素最佳作用质量浓度和时间为10 mg/L作用2.5 h,成纤维细胞饲养层可以维持8～12 d.0.05%胰蛋白酶消化15～20 min效果优于0.15%,0.25%胰蛋白酶消化;10 mg/L丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞2.5 h能有效抑制其增殖,表明该条件下的饲养层细胞能很好的支持胚胎干细胞及诱导多能性干细胞生长.     

C57BL／6小鼠胚胎成纤维细胞生物学特性及饲养层制备

背景：昆明小鼠胚胎成纤维细胞是目前最常用的饲养层细胞,C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层的研究鲜有报道。目的：体外分离和培养C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞,制备饲养层,力求扩大小鼠胚胎成纤维细胞的来源。方法：用不同浓度胰蛋白酶分步消化法体外分离和培养C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性,研究其生长规律,并制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层,检测干细胞在所制备饲养层上的生长状态。结果与结论：不同浓度胰蛋白酶分步消化法制备的C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞生长状态好,获得的成纤维细胞数量多,增殖活跃。在细胞冻存后1,2周、1,3,6个月内复苏的细胞存活率差异无显著性意义。C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞在第2-5代增殖旺盛,第6代以后细胞增殖出现明显下降。种植到培养皿上的C57BL/6小鼠饲养层细胞在种植后3 d内活力高,种植4 d以后细胞活力急剧下降。所以C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞来源的饲养层的最佳使用时间为灭活后3 d内,C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞饲养层和昆明小鼠胚胎成纤维细胞饲养层一样,能很好地支持胚胎干细胞及诱导多能干细胞生长。     

人胚胎干细胞饲养层的制备及生物学活性

背景：建立一种既可以大量制备,又能保存并保持较高活性的饲养层是胚胎干细胞培养研究不可缺少的环节。目的：体外分离培养、冻存复苏ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性。方法：取ICR小鼠13.5d胚胎,用胰蛋白酶分步消化法分离培养小鼠成纤维细胞,对冻存复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞形态、生长曲线、贴壁率、细胞化学染色及支持人胚胎干细胞生长特性等进行观察。结果与结论：复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞在体外传代30min时80%以上细胞贴壁,生长曲线显示细胞增殖活跃,细胞化学染色AKP、PAS、POX阴性,能长期支持人胚胎干细胞传代生长。提示此方法所获得的小鼠胚胎成纤维细胞复苏后有较高的生物学活性,可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。     

小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G的培养

背景:小鼠胚胎干细胞系SF1-G是由雌性C57BL/6 小鼠与雄性M. spretus 小鼠交配后,取桑葚胚期胚胎在STO饲养层细胞上分离培养获得,STO细胞较昂贵,而由小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层细胞不仅取材容易,而且形成胚胎干胞的克隆率、维持胚胎干细胞正常核型的能力均比STO细胞要好一些,因此,建立一种适宜SF1-G细胞扩增的培养体系,保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提.目的:建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及胚胎干细胞饲养层细胞制备体系;以建立有效的小鼠胚胎干细胞(SF1-G细胞)扩增培养体系.方法:从孕12.5～14.5 d的ICR小鼠分离培养原代小鼠胚胎成纤维细胞;取 3～5 代的小鼠胚胎成纤维细胞,以丝裂霉素C抑制其增殖能力制备饲养层细胞;在饲养层细胞上增殖培养SF1-G细胞;染色体G显带分析法检测SF1-G细胞核型,SF1-G细胞碱性磷酸酶染色和RT-PCR检测Oct4、Nanog基因表达.结果与结论:从孕鼠胚胎有效分离到小鼠胚胎成纤维细胞,以3～5代细胞制备的饲养层细胞能够支持胚胎干细胞SF1-G呈边界清晰的克隆样生长.染色体核型检测 SF1-G保持正常核型,碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性.实验建立了有效的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养体系,并制备供胚胎干细胞进行增殖培养饲养层细胞体系,能够在实验室对 SF1-G细胞保持正常未分化状态培养.     

人胚胎干细胞饲养层的制备及生物学活性

背景:建立一种既可以大量制备,又能保存并保持较高活性的饲养层是胚胎干细胞培养研究不可缺少的环节。目的:体外分离培养、冻存复苏ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性。方法:取ICR小鼠13.5d胚胎,用胰蛋白酶分步消化法分离培养小鼠成纤维细胞,对冻存复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞形态、生长曲线、贴壁率、细胞化学染色及支持人胚胎干细胞生长特性等进行观察。结果与结论:复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞在体外传代30min时80%以上细胞贴壁,生长曲线显示细胞增殖活跃,细胞化学染色AKP、PAS、POX阴性,能长期支持人胚胎干细胞传代生长。提示此方法所获得的小鼠胚胎成纤维细胞复苏后有较高的生物学活性,可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。     

高效制备昆明鼠胚胎成纤维细胞饲养层

背景：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层是胚胎干细胞培养最常用的方法,能有效抑制胚胎干细胞分化并促进其增殖,但其制备过程繁琐,工作量大,准备周期长。目的：探索建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层简单、高效的培养体系。方法：取13.5d胎龄胎鼠用改良组织块法及简化酶消化法分离培养原代成纤维细胞,倒置显微镜下观察不同方法培养的原代和传代鼠胚胎成纤维细胞的生长形态、结构及细胞数量变化。收集鼠胚胎成纤维细胞进行冻存,复苏后细胞经不同浓度作用时间的丝裂霉素C处理,制备饲养层。结果与结论：两种简化方法培养的原代鼠胚胎成纤维细胞生长状态良好,得到高效优质足量细胞,操作过程简单,省去了多次消化、离心、细胞计数等繁琐操作,均适宜于鼠胚胎成纤维细胞的原代培养。简化复苏法复苏后的细胞,按其生长汇合情况,以丝裂霉素C10mg/L作用1.5～2.0h或1mg/L培养过夜,省时并可获得细胞生长状态最佳的饲养层。     

人胚胎成纤维细胞饲养层的制备

背景：极小胚胎样干细胞是近年来发现的一种具有类似胚胎干细胞生物学特性的非造血干细胞，但对其体外培养扩增的方法报道极少。有研究推测，人胚胎成纤维细胞能为人骨髓极小胚胎样干细胞体外培养扩增提供良好的微环境。
　　目的：从人胚胎躯干中分离、培养人胚胎成纤维细胞，制备人胚胎成纤维细胞饲养层用于人骨髓极小胚胎样干细胞的培养。
　　方法：利用胰酶消化法从孕5-9周龄人胚胎躯干中分离培养人胚胎成纤维细胞。制作饲养层，使用不同浓度丝裂霉素C处理后，用于培养分选后的人骨髓极小胚胎样干细胞，以细胞形态、生长曲线作为胚胎成纤维细胞和饲养层的评价指标。
　　结果与结论：从人胚胎中成功分离培养出人胚胎成纤维细胞，该细胞可传代24代以上，且经过传代及冻存复苏后生物学特性无改变。丝裂酶素C低于12 mg/L时，人胚胎成纤维细胞增殖不能完全抑制；高于14 mg/L，人胚胎成纤维细胞可能死亡。12 mg/L丝裂霉素C作用3 h后能较好地抑制人胚胎成纤维细胞的增殖，并且保持其活力约2周，可以在很长一段时间内用作人骨髓极小胚胎样干细胞的饲养层。     

高效制备昆明鼠胚胎成纤维细胞饲养层

背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层是胚胎干细胞培养最常用的方法,能有效抑制胚胎干细胞分化并促进其增殖,但其制备过程繁琐,工作量大,准备周期长。目的:探索建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层简单、高效的培养体系。方法:取13.5d胎龄胎鼠用改良组织块法及简化酶消化法分离培养原代成纤维细胞,倒置显微镜下观察不同方法培养的原代和传代鼠胚胎成纤维细胞的生长形态、结构及细胞数量变化。收集鼠胚胎成纤维细胞进行冻存,复苏后细胞经不同浓度作用时间的丝裂霉素C处理,制备饲养层。结果与结论:两种简化方法培养的原代鼠胚胎成纤维细胞生长状态良好,得到高效优质足量细胞,操作过程简单,省去了多次消化、离心、细胞计数等繁琐操作,均适宜于鼠胚胎成纤维细胞的原代培养。简化复苏法复苏后的细胞,按其生长汇合情况,以丝裂霉素C10mg/L作用1.5～2.0h或1mg/L培养过夜,省时并可获得细胞生长状态最佳的饲养层。     

昆明小鼠胚胎干细胞最佳分离方法及培养液选择

背景:到目前为止已经建立数百个小鼠胚胎干细胞系,昆明小鼠是中国应用最多的实验小鼠,其建系成功报道极少.目的:建立一简单有效的昆明小鼠胚胎干细胞分离培养体系,以提高昆明鼠胚胎干细胞建系成功率.方法:用添加血清替代物或胎牛血清培养液的小鼠胚胎成纤维细胞制备饲养层.昆明小鼠经孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素促排卵,交配后 3.5 d 冲洗子宫取胚胎,将胚胎接种在饲养层中培养,观察胚胎贴壁、内细胞团集落形成率.4～6 d 后在 0.05%trypsin-0.02%EDTA 消化液中用切割法处理增殖的内细胞团块,再接种到新的饲养层上.倒置显微镜下观察形成的胚胎干细胞样集落形态.结果与结论:妊娠 3.5 d 孕鼠适合胚胎干细胞的分离培养;在 0.05%trypsin-0.02%EDTA 消化液中采用切割法进行内细胞团集落的分离,集落增殖快、分化低;在含胎牛血清培养液中进行干细胞培养较血清替代物培养液中传代次数多,此培养液更适宜进行分离培养昆明鼠胚胎干细胞.     

小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育

背景:到目前为止已建立了数百个小鼠胚胎干细胞系,一般情况下实验室培养的胚胎干细胞有3个细胞来源,即胚泡内的内细胞群、胚胎生殖嵴的原始生殖细胞和应用克降技术制造人体胚胎并提取干细胞.目的:尝试用自制的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养小鼠胚胎干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-12/2007-09在辽宁医学院完成.材料:妊娠14.5 d的孕鼠40只,由辽宁医学院实验动物中心提供.方法:无菌条件下剪开孕鼠子宫壁,取出胚胎,去除头、尾、内脏和四肢后采用胰蛋白酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理3.5 h后接种于6孔板中,细胞贴壁后即为成纤维细胞饲养层.收集3.5 d的小鼠囊胚,在显微镜下将囊胚置于上述6孔板的中央,五六_人后取隆起生长的内细胞团块,分离后再培养.主要观察指标:成纤维细胞饲养层的制备情况,胚胎干细胞的生长状态、碱性磷酸酶染色结果及分化趋势.结果:光镜下小鼠胚胎成纤维细胞呈不规则形,生长较快,传代比例为1:4,经丝裂霉素C处理后细胞贴壁较慢,失去分裂增殖能力.小鼠囊胚孵出透明带的时间为24～72 h,从胞膜中孵出约为1 d,3～5 d后可形成胚胎干细胞集落,7 d后集落呈"鸟巢"状.组织化学染色后可见细胞内有大量的蓝紫色颗粒沉积,连续培养20 d,期间不换培养液,可见胚胎干细胞团分化为亮度较小、界限清楚的单核细胞.结论:小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

新生小鼠海马、嗅球及皮质神经干细胞的分离培养及鉴定

背景：从体外分离培养出高纯度、生物学性能均一的神经干细胞,建立起一套完整的神经干细胞培养体系,是进行神经干细胞研究的基础。 目的：建立新生小鼠海马、嗅球、皮质组织神经干细胞的分离培养体系,并对其生物学特性进行分析。 方法：分离新生昆明小鼠海马、嗅球、皮质组织,采用机械分离和胰酶消化法提取原代神经干细胞。采用无血清培养技术、机械吹打和酶消化法进行传代培养神经干细胞。以体积分数为10%的胎牛血清诱导分化神经干细胞。对神经干细胞及其分化产物行CD133、巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色鉴定。 结果与结论：从新生小鼠海马、嗅球、皮质可提取出具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞,经巢蛋白、CD133免疫荧光染色检测呈阳性;神经干细胞经胎牛血清诱导后可分化为β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞,并证实染色阳性细胞为神经元和星形胶质细胞。该实验建立了一套神经干细胞体外分离培养、纯化、鉴定、诱导分化方案,为后续神经干细胞研究的顺利进行奠定了实验基础。     

慢性腱病模型大鼠肌腱干细胞体外成脂和成肌腱的分化能力

背景：慢性腱病是一种常见的肌腱退行性病变,好发于运动员以及肌腱过度劳损的人群。由于慢性腱病的发病机制尚未阐明,临床上还缺乏有效的治疗手段。 目的：体外研究比较慢性腱病大鼠和正常大鼠来源肌腱干细胞成脂、成肌腱分化能力。 方法：从慢性腱病大鼠以及正常大鼠髌腱中分离培养原代肌腱干细胞,传代培养至第3代,体外观察细胞形态学变化。将两种来源肌腱干细胞（P3）单层培养至细胞融合,分为2组,成脂诱导组用成脂诱导培养基培养,对照组用基础培养基培养。成脂诱导分化21 d后,将两种来源肌腱干细胞的成脂诱导组和对照组分别行油红O染色定量分析。实时荧光定量PCR检测各组细胞成脂性基因C/EBPα和PPARγ2的mRNA的表达。将两种来源的肌腱干细胞体外单层培养至70%-80%融合时,行实时荧光定量PCR检测慢性腱病来源肌腱干细胞以及正常肌腱干细胞成肌腱相关基因Col1a1,Scx,Tnmd和Dcn的mRNA的表达。 结果与结论：肌腱干细胞体外培养至第3代时,正常肌腱来源的肌腱干细胞保持细长纺锤形的典型的干细胞形态,而慢性腱病来源的肌腱干细胞虽然形态发生改变,但仍保持纺锤形形态。肌腱干细胞（P3）体外成脂诱导分化21 d后,慢性腱病来源的肌腱干细胞胞体变大、变圆,可见大量油红O染色阳性的细胞,油红O染色阳性率显著高于正常大鼠（P=0.004）。实时荧光定量PCR结果显示,慢性腱病大鼠来源肌腱干细胞的成脂性基因（C/EBPα和PPARγ2）mRNA的表达均显著高于正常大鼠（P=0.004）,肌腱特异性基因Col1a1,Scx, Tnmd以及Dcn mRNA表达量均明显低于正常大鼠（P =0.009）。说明与正常大鼠来源的肌腱干细胞相比,慢性腱病来源的肌腱干细胞体外成肌腱分化的能力减弱,而成脂分化的能力增强,此结果为进一步揭示慢性腱病发病机?     

三维培养小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景：骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能而被用于多种疾病治疗及研究,但是在目前的培养条件下,其极易发生老化和自分化而失去应用价值。 目的：研究三维球体培养对骨髓间充质干细胞干性及衰老的影响。 方法：取3周龄 C57/B6小鼠,分离培养骨髓间充质干细胞,分别接种于包被有壳聚糖的培养板和普通培养板。培养5 d后分别收集两组细胞,流式细胞术检测细胞表型及干性相关标志分子,应用PI和Annexin-V染色检测细胞凋亡,β-Gal染色鉴定衰老。 结果与结论：小鼠骨髓间充质干细胞培养第3天就可以聚集成球状生长,球体状生长的细胞干性相关标志分子CD44和Sca-1表达高于普通培养细胞,PI和Annexin-V染色可见球体培养细胞凋亡明显减少,且通过β-Gal染色可见球体状态生长的细胞无明显衰老。上述结果表明,三维球体培养技术有益于维持间充质干细胞的干性,减少其凋亡并延缓衰老。     

利用层粘连蛋白扩增罗曼鹤鸡骨髓间充质干细胞

背景：鸡骨髓间充质干细胞是胚胎发育学、免疫学和肿瘤学研究重要的细胞模型,但如何大规模扩增并使其保持良好的未分化潜能是鸡骨髓间充质干细胞应用中亟待解决的难题。 目的：建立扩增鸡骨髓间充质干细胞的层粘连蛋白培养体系。 方法：将体外分离得到的鸡骨髓间充质干细胞分别接种在包被层粘连蛋白培养皿和传统二维培养皿上。经过体外扩增,比较两种培养体系下,鸡骨髓间充质干细胞的形态特征、表面标志物、扩增性能和成脂分化潜能。结果与结论：层粘连蛋白培养体系和常规培养体系中骨髓间充质干细胞的形态学特征和表面标志物表达没有显著差异,但层粘连蛋白培养体系获得的骨髓间充质干细胞增殖能力和分化潜能都明显优于传统培养体系。可见层粘连蛋白培养体系能快速地扩增出大量增殖能力强和未分化性能良好的鸡骨髓间充质干细胞,为鸡骨髓间充质干细胞的进一步深入研究和应用提供生物学基础。     

Toll样受体3对胚胎骨髓来源间充质干细胞免疫调节Th17细胞的作用

背景：课题组前期研究发现胚胎骨髓来源的间充质干细胞促进人Th17细胞增殖,但内在的调节机制尚需阐明。目的：探讨Tol 样受体3对胚胎骨髓来源间充质干细胞免疫调节Th17细胞的作用。 方法：应用免疫磁珠分离正常人 CD4＋ T 细胞,单独或与胚胎来源骨髓间充质干细胞共培养4 d。实时定量PCR测定白细胞介素17、Tol 样受体3及MyD88相关基因的表达水平。〈br〉 结果与结论：相对于CD4＋T细胞单独培养组,间充质干细胞共培养组白细胞介素17 mRNA表达水平明显升高（3.59±0.11 vs.1.14±0.08,P ＜0.01）;进一步发现 Tol 样受体3 mRNA 亦相应升高（3.10±1.60 vs.0.94±0.01,P ＜0.05）。而且,相对于CD4＋T细胞单独培养组,胚胎骨髓来源间充质干细胞共培养组促进了MyD88的表达（2.29±0.05 vs.1.85±0.31,P＜0.01）。研究结果表明Tol 样受体3可能对胚胎骨髓来源间充质干细胞免疫调节Th17细胞发挥作用,为今后潜在的细胞治疗策略提供可能的实验依据。     

CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备

背景：小鼠胚胎成纤维细胞作为干细胞生长用饲养层,优于无饲养层,它能够分泌一些既促进干细胞生长又能抑制干细胞分化的因子。目的：建立CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层最佳的分离培养方法,分析丝裂霉素C抑制成纤维细胞增殖的最佳浓度与时间,用于培养诱导多能性干细胞。方法：取孕10～15dCF-1小鼠,分离胎鼠原代成纤维细胞,经不同质量浓度（5,10,15,20mg/L）丝裂霉素C处理不同时间（1,1.5,2,2.5,3h）制备饲养层,并观察其增殖情况。将人诱导多潜能干细胞或胚胎干细胞在丝裂霉素C处理过的饲养层上培养,观察细胞集落生长情况。结果与结论：制备CF-1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的最佳胎龄为13.0～14.0d。丝裂霉素C抑制CF-1小鼠胚胎成纤维细胞增殖的最佳浓度及作用时间为10mg/L,2.5h,成纤维细胞饲养层可以维持5～7d。诱导多能性干细胞与胚胎干细胞在经10mg/L丝裂霉素C处理2.5h后饲养层上能发育成典型的＂鸟巢＂状干细胞集落。     

穴位注射骨髓间充质干细胞后心肌梗死大鼠血管细胞黏附因子1及迟发抗原4的表达

背景：目前认为骨髓间充质干细胞归巢是由黏附分子和趋化因子介导的,该过程有骨髓内皮细胞、造血干细胞、骨髓造血微环境及其分泌或表达的分子共同参与,黏附分子可能在其中起到重要作用。 目的：以血管细胞黏附因子1和迟发抗原4为指标探讨穴位注射骨髓间充质干细胞向心肌迁移、趋化的机制。方法：贴壁法培养骨髓间充质干细胞,以第3代为种子细胞,调整细胞浓度为1×10^10 L-1。60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、心肌注射骨髓间充质干细胞组（以下简称心肌组）,穴位注射骨髓间充质干细胞组（以下简称穴位组）,每组15只。采用结扎左冠状动脉前降支方法复制心肌梗死模型,穴位组造模成功72 h后于心俞、至阳、膻中每穴位注入骨髓间充质干细胞0.3 mL,心肌组造模成功72 h后二次开胸,左前降支供血区域及周边心肌分6点均匀地移植骨髓间充质干细胞1.2 mL,4周后颈动脉插管,多道生理记录仪检测血流动力学指标,ELISA法检测血清血管细胞黏附因子1及迟发抗原4表达水平。 结果与结论：心肌组、穴位组大鼠心功能得到改善,两组血清血管细胞黏附因子1及迟发抗原4较模型组升高,心肌组和穴位组比较差异无显著性意义。结果说明血管细胞黏附因子1/迟发抗原4轴可能是穴位注射干细胞趋化机制之一。     

小鼠胰腺干细胞在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下的体外连续传代培养

背景:胰腺干细胞具有分裂与高度分化潜能的特性,可以在体外进行成功分离和培养,但体外如何对其进行有效扩增是亟待解决的问题.目的:在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下体外传代培养小鼠胰腺干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在广西中医学院基础医学院细胞无菌培养室完成.材料:SPF级新生昆明小鼠20只,孕14 d昆明小鼠多只,均购自广西中医学院实验动物中心. 方法:取SPF级新生昆明小鼠的胰腺组织,V型胶原酶消化,未消化完全的组织块自然沉降后,收集上层的含细胞离散液,离心弃上清,加入含角质细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清低糖DMEM培养基,在经多聚赖氨酸溶液处理的24孔板中培养.取孕14 d昆明小鼠,剖腹取胎鼠,去除头部及内脏,将躯干及四肢采用组织块胰蛋白酶消化法分离培养成纤维细胞,调整密度为5×108L-1接种于24孔板中, 传至第3代经丝裂霉素适当处理制备饲养层细胞.取原代培养5 d的胰腺干细胞,按30个/cm2密度种入铺有饲养层细胞的孔板中,当胰腺干细胞铺满小孔底部面积的80%时继续传代.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态变化,原代培养48 h对细胞进行碱性磷酸酶染色,通过免疫组织化学染色鉴定胰腺干细胞特异分子标志物巢蛋白的表达.分别于传代后2,3,4,5 d检测碱性磷酸酶、巢蛋白和胰十二指肠同源盒基因1的表达. 结果:原代培养的来源于胰腺组织的细胞中,可见一些大、圆、单个核的细胞,胞浆折光性强,核浆比例大,呈附壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达胰腺干细胞特异性分子标志巢蛋白,且具有活跃的分裂增殖能力.在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层条件下对胰腺干细胞进行体外传代培养,可连续传至第3代,各代胰腺干细胞仍保持大、圆、单个核、核浆比例大及增殖能力强等特性,传代后各时间点碱性磷酸酶、巢蛋白染色均呈阳性,胰十二指肠同源盒基因1蛋白染色呈阴性反应,可保持未分化状态. 结论:以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,经丝裂霉素C处理后可分泌供胰腺干细胞生长所需的因子,并抑制胰腺干细胞的自主分化,体外连续传至第3代仍能够保持较好的生长特性、高度增殖能力及未分化状态.