SHV-12型超广谱β-内酰胺酶特性的研究

目的研究SHV-12型超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的特性。方法将b laSHV-12基因连接至pET28 a载体上,并用重组质粒转化大肠埃希菌BL21进行克隆表达,挑选b laSHV-12阳性表达的菌落,提取其酶蛋白进行等电点测定和酶动力学分析。结果SHV-12型ESBL等电点为8.2。同时,在所测的几种抗生素中,该酶对头孢他啶和头孢噻肟的Km相同且最小;对头孢噻吩,有着最大的Vm ax/Km;而对阿莫西林,表现出最大的Km和最低的Vm ax。结论SHV-12型ESBL对头孢他啶和头孢噻肟具有高的亲和力,而对头孢噻吩有最大的催化效能。     

SHV-12型超广谱β-内酰胺酶特性的研究

目的研究SHV-12型超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的特性。方法将blaSHV-12基因连接至pET28a载体上，并用重组质粒转化大肠埃希菌BL21进行克隆表达，挑选blaSHV-12阳性表达的菌落，提取其酶蛋白进行等电点测定和酶动力学分析。结果SHV-12型ESBL等电点为8．2。同时，在所测的几种抗生素中，该酶时头孢他啶和头孢噻肟的Km相同且最小；对头孢噻吩，有着最大的Vmax／Km；而对阿莫西林，表现出最大的Km和最低的Vmax。结论SHV-12型ESBL对头孢他啶和头孢噻肟具有高的亲和力，而对头孢噻吩有最大的催化效能。     

大庆地区肺炎克雷伯菌SHV型产超广谱β-内酰胺酶细菌基因型的研究

[目的]了解大庆地区肺炎克雷伯菌中SHV型ESBLS的检出情况，确定其基因型，并对其流行病学方面进行研究。[方法]从2004年10月-2005年7月在大庆三级医院共收集54株肺炎克雷伯菌，双纸片协同法对其进行超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）表型检测，采用SHV特异性引物及多重PCR法对SHV基因整个开放阅读框进行扩增，并对PCR产物测序，通过BLAST分析确定基因型。[结果]本次研究共检出肺炎克雷伯菌5种SHV型耐药基因：SHV-28、SHV-12、SHV-5、SHV-1以及SHV-11。[结论]在大庆地区检出肺炎克雷伯菌SHV-28，SHV-12，SHV-5型ESBLs，首次检出SHV-1，SHV-11型β-内酰胺酶。在一定程度上，SHV型ESBLs存在克隆传播。加强对产SHV型ESBLs菌株的监测，控制其传播具有重大的意义。     

嗜麦芽窄食单胞菌所产L1型金属β内酰胺酶的序列分析及原核表达

目的对嗜麦芽窄食单胞菌所产L1型金属β内酰胺酶基因进行测序、原核表达。方法PCR扩增L1酶的编码基因，将其亚克隆入pUCm—T载体后测定核苷酸序列，将u酶基因克隆至表达载体pET-41a( )后在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达，十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达情况，等电聚集电泳测定表达蛋白的等电点。结果本实验中L1的编码基因与国外同类酶的氨基酸同源性为92．44％。此L1酶基因可在大肠埃希菌BL21(DE3)中大量表达，等电点为6．7。结论对L1型金属β内酰胺酶的克隆测序及成功表达为进一步研究该酶的分子生物学特性奠定了基础。     

SHV-71型β-内酰胺酶的酶动力学研究

目的对临床分离的鲍曼不动杆菌所产SHV-71型β-内酰胺酶的编码基因进行序列分析,研究其对多种β-内酰胺类抗生素的酶动力学参数,并观察pH、温度、底物浓度及酶抑制剂对酶活性的影响。方法PCR扩增SHV型酶的编码基因。将SHV的PCR产物与pMD18-T载体连接,测定它们的核苷酸序列,并将SHV-71型酶基因克隆至表达载体pET-41b(+),转化至宿主菌大肠埃希菌BL21(DE3)中。以IPTG诱导其表达并纯化,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达情况。用分光光度计测定SHV-71型酶对多种β-内酰胺类抗生素的动力学参数,以及pH、温度、底物浓度及酶抑制剂对酶活性的影响。结果SHV-71型酶对第一、二、三代头孢菌素类抗生素的相对最大水解速度及相对水解效率均较高,而对青霉素类和碳青霉烯类抗生素的相对最大水解速度及相对水解效率均较低。该酶在pH7.4、37℃的活性最高;底物浓度低于120μmol/L时,反应初速度随底物浓度增加而呈线性增加,底物浓度大于120μmol/L时,酶活性反而受抑;克拉维酸和三唑巴坦对SHV-71型酶有抑制作用。结论根据SHV-71型酶的酶学特点,我们推测SHV-71型酶为超广谱β-内酰胺酶。     

4株产TEM型超广谱β内酰胺酶肠杆菌科细菌的研究

目的：鉴定临床分离的3株大肠埃希菌和1株肺炎克雷伯菌所产的TEM型β内酰胺酶编码基因的序列，并进行原核表达，了解其相关特性。方法：聚合酶链反应(PCR)扩增TEM型β内酰胺酶编码基因片段，克隆入pGEM—T easy载体，表达于感受态细胞大肠埃希菌DH5a中，双脱氧链终止法测定核苷酸序列，确定基因型；其基因与原核表达载体(pET-28c)连接，并在感受态细胞大肠埃希菌DH5a中进行原核表达，提取质粒，用PCR进行表达鉴定，用超广谱β内酰胺酶(ESBLs)表型确认试验鉴定表达菌株的表型，另外对这些临床菌株进行接合试验。结果：PCR扩增结果显示这4株细菌产生的TEM型β内酰胺酶编码基因片段含981个核苷酸，其表达酶的性质均为ESBLs，临床菌株的质粒接合试验均为阳性。这4株临床菌株所产生的TEM型β内酰胺酶的编码基因已被GenBank命名为TEM-10(GenBank注册号：U95363)。结论：安徽地区这4株细菌所产TEM型β内酰胺酶均为TEM-10，在国内我们首次从临床分离株中发现TEM-10。     

多重耐药肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶编码基因分子生物学研究

目的确定浙江省嘉兴地区临床分离的多重耐药肺炎克雷伯菌E3株所产β-内酰胺酶编码基因序列及亚型.方法肺炎克雷伯菌E3株经酶抑制剂增强的肉汤稀释法鉴定为产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌,聚合酶链反应(PCR)扩增其β-内酰胺酶编码基因片段,克隆入pGEM-Teasy载体,双脱氧链终止法测定核苷酸序列并确定亚型,重组细菌表型鉴定.结果E3株同时产SHV和TEM型2种β-内酰胺酶,其中SHV基因片段含812个核苷酸,编码产物有266个氨基酸,应为SHV-11型β-内酰胺酶;TEM基因片段含973个核苷酸,编码产物有288个氨基酸,应为TEM-1型β-内酰胺酶.含TEM-1和SHV-11编码基因的重组细菌经酶抑制剂增强的肉汤稀释法鉴定为阴性.结论E3株肺炎克雷伯菌同时产生SHV-11和TEM-1 2种ESBLs,其可影响ESBLs的表型检测结果.     

大庆地区革兰阴性杆菌SHV型ESBLs基因型调查

目的了解大庆地区革兰阴性杆菌中SHV型ESBLs基因型的分布状况。方法采用双纸片协同法(DDS)、PCR法,检测ESBL阳性革兰阴性杆菌中的SHV基因。结果254株临床分离的多重耐药革兰阴性杆菌中共检出26株携带SHV基因,分别为SHV-28、SHV-12、SHV-5、SHV-1以及SHV-11五种基因型。携带blaSHV基因的细菌主要为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌。结论在大庆地区首次检出SHV-28,SHV-12,SHV-5型ESBLs基因,首次检出SHV-1,SHV-11型β-内酰胺酶基因;大庆地区革兰阴性杆菌携带多种类型SHV型ESBLs基因。     

SHV-5编码基因的克隆及序列分析

目的：研究鉴定得自浙江省嘉兴地区临床分离的肺炎克雷伯菌E2株编码超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的基因。方法：PCR扩增ESBLs编码基因片段,克隆入pGEM-Teasy载体,双脱氧链终止法测定核苷酸序列并确定亚型。结果：PCR扩增结果显示E2株产生的ESBL为SHV型,其基因片段含812个核苷酸,GeneBank查询其氨基酸序列与SHV-5型ESBLs完全相同。结论：浙江省嘉兴地区肺炎克雷伯菌E2株所产ESBL亚型为SHV-5。     

发现一株产KPC-2型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌

目的 研究1株亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌的耐药机理。方法 采用浓度梯度法（Etest）测定细菌对各抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）。通过等电点分析（IEF）、质粒抽提、接合试验、转化试验、聚合酶链反应（PCR）扩增及耐药基因克隆测序分析细菌编码的B内酰胺酶。结果临床分离的肺炎克雷伯菌等电点显示3条β内酰胺酶条带，分别为5．4、6．7和8．2。PCR扩增测序临床分离菌含TEM-1（pI，5．4）、SHV-12（pI，8．2）和KPC-2（pI，6．7）β内酰胺酶编码基因。转化菌只有一条β内酰胺酶条带，为6．7。从转化菌质粒（60000bp）上获得1500bp的克隆片段，测序证实其为KPC-2编码基因。结论 亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌的质粒上携带水解碳青霉烯类抗生素的A类2f组KPC-2酶的编码基因。     

NK4蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化与活性研究

目的通过构建NK4基因的重组原核表达载体,规模化制备NK4蛋白。方法将NK4基因插入载体pET-26b(+),构建重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4,并转化E.coli Rosseta(DE3)。IPTG诱导转化菌表达NK4蛋白,然后采用Ni-NTA树脂亲和层析进行纯化。观察复性后NK4蛋白对Hela细胞的生物学性状的影响,评价制备的NK4蛋白的生物活性。结果NK4基因重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4获成功构建。转化pET-26b(+)-NK4的E.coli Rosseta(DE3)以包涵体形式大量表达目的蛋白,占菌体总蛋白的42%。经Ni-NTA树脂亲和层析纯化后NK4蛋白纯度约为95%,并经Western blot证实。NK4蛋白行稀释复性后可抑制Hela细胞的贴壁、迁徙并促进其凋亡。结论成功构建NK4基因的重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4,并可在E.coli Rosseta(DE3)表达。制备的NK4保留了其生物学活性。     

mica基因的克隆及其在原核系统中的表达

本研究构建mica基因原核表达系统并纯化MICA蛋白。利用外周血标本提取RNA,经RT-PCR获取mica基因cDNA。将mica cDNA经TOPO克隆连接构建克隆载体,然后将克隆重组载体和原核表达载体pET-28a经双酶切后进行连接构建重组表达载体,进而转染宿主菌E.coliBL21DE3进行表达。利用亲和层析的Ni-NTASpin纯化重组的MICA蛋白。结果表明:带有重组质粒pET-28a-mica的宿主菌经IPTG诱导表达后,以可溶性形式大量表达重组的MICA蛋白,经Ni-NTA Spin纯化后得到重组的MICA蛋白。结论:本研究构建了mica基因原核表达系统并纯化了MICA蛋白,为探讨MICA与移植免疫的关系奠定了基础。     

促Treg细胞生成及活化重组分子的构建与表达

本研究旨在构建促Treg细胞生成及活化的重组分子的原核表达载体,并鉴定其表达。应用RT-PCR获得人TGF-β1及HIV被膜蛋白gp120的C2-C4区基因并将其克隆至pCR2.1 T载体,酶切制备人TGF-β1及C2-C4区DNA片段,通过PCR定向连接两目的片段至原核表达载体pET-28a,生成pET-28a/C2-C4-Linker-hTGF-β1,转染E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使用0.1 mmol/L的IPTG诱导蛋白表达,以Western blot方法鉴定表达结果。结果表明,成功扩增人TGF-β1及C2-C4区基因并分别克隆入pCR2.1-T载体,经亚克隆构建了重组蛋白的原核表达质粒pET-28a/C2-C4-Linker-hTGF-β1,并转染E.coli BL21(DE3)感受态细胞获得工程菌株,通过IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式获得表达。结论:本研究成功构建促Treg细胞生成及活化的重组分子的原核表达载体,并获得原核表达。     

小鼠A细胞介素21原核表达载体的构建及活性鉴定

目的：白细胞介素21是近年发现的由T细胞分泌的细胞因子，具有广泛的免疫调节作用和抗肿瘤活性。为进一步观察其体内外免疫作用，拟构建小鼠白细胞介素21（mlL-21）原核表达载体，并对其表达的活性进行鉴定。 方法：实验于2006—03／2007—05在南京医科大学附属南京儿童医院儿科研究所和东南大学基础医学院病原生物学与免疫学系完成。实验材料：实验中所用BALB／c小鼠由扬州大学比较医学中心提供，六七周龄，雌雄兼备，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。pcDNA3．1／mlL-21质粒由东南大学基础医学院免疫学实验室提供。实验方法：以pcDNA3．1／mlL-21质粒为模板，PCR获得长度为369bp的mlL-21基因片段。将其定向克隆至pET-28a（＋）质粒中，采用PCR酶切和测序等方法对重组质粒进行鉴定。并对重组蛋白进行IPTG诱导表达、Western blot及体外生物学活性检测。 结果：构建了重组原核表达载体pET-28a（＋）／mlL-21，经鉴定后证实重组质粒构建正确。SDS-PAGE显示含重组质粒的诱导菌在M16000位置出现一蛋白条带。Western blot结果显示该蛋白具有良好的免疫原性。体外生物学功能检测显示该重组蛋白能够增强小鼠脾细胞中的NK细胞杀伤活性。 结论：成功构建了重组原核表达载体pET-28a（＋）／mlL-21，表达的mlL-21具有良好的免疫原性。     

IMP-4型金属β内酰胺酶合并膜孔蛋白OmpK36缺失引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素高水平耐药

目的 研究临床分离的肺炎克雷伯菌Z4和Z5对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制.方法 2008年从卫生部北京医院的急诊室和神经内科患者的痰标本分别分离到2株对碳青霉烯类抗生素不敏感的肺炎克雷伯菌Z4和Z5.测定菌株MIC,对菌株进行质粒接合试验、质粒消除试验、β内酰胺酶IEF分析、PCR扩增和DNA序列分析以及外膜蛋白分析.结果 亚胺培南、美罗培南和厄他培南对Z4和Z5的MIC分别为32、32和256μg/ml以及1、1和2μg/ml.接合试验可使受体菌大肠埃希菌对碳青霉烯的MIC值从≤0.062 5或0.125μg/ml上升到1或2μg/ml.PCR扩增和序列分析发现Z4产IMP-4型金属β内酰胺酶、TEM-1型和SHV-1型广谱β内酰胺酶;Z5产IMP-4、TEM-1和SHV-12型超广谱β内酰胺酶;2株细菌的转移接合子均只产IMP-4.质粒消除试验发现Z5的IMP-4质粒消除株(TEM-1和SHV-12阳性)对碳青霉烯类抗生素敏感,而Z4的IMP-4质粒消除株(SHV-1阳性)对碳青霉烯类抗生素敏感性降低(亚胺培南、美罗培南和厄他培南MIC分别为0.25、0.5和4μg/ml).Z4和Z5的blaIMP-4基因均位于大小约55 000 bp质粒的I类整合子上.外膜蛋白的SDS-PAGE和ompK35/36基因序列分析发现Z4由于ompK36基因中存在点突变(CAG突变为TAG)造成基因表达提前终止而导致OmpK36膜孔蛋白缺失.结论 质粒介导的IMP-4型金属β内酰胺酶的产生或β内酰胺酶的产生合并OmpK36膜孔蛋白缺失均可引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素敏感性降低,IMP-4合并OmpK36膜孔蛋白缺失则可导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素高水平耐药.     

人α1微球蛋白基因的质粒载体构建和表达

目的构建表达人α1-微球蛋白(α1-microglobulin,1α-MG)的重组质粒并纯化目的蛋白。方法从正常人肝脏中提取cDNA,RT-PCR扩增α1-mg基因,将扩增产物用NdeI/BamHI消化,切下目的基因片断克隆到质粒pET-15b中,构建重组pET-15b,转化入E.coliDH5α中,经酶谱分析和测序,鉴定出正确的重组质粒pET-15b。将重组pET-15b转化入宿主菌E.coliBL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达。提取细菌总蛋白质进行SDS-PAGE分析和蛋白印迹鉴定。利用重组蛋白中的6个组氨酸(His)组成的“标签”进行亲和层析,纯化重组蛋白。结果筛选到携带有α1-mg基因的正确重组质粒pET-15b,重组蛋白在BL21(DE3)pLysS中得到了诱导表达,含量达20mg/L细菌培养液。经一步金属螯合亲和层析纯化后,重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出均一的单一条带。结论重组质粒pET-15b的构建和有活性的酶蛋白的表达成功说明,PCR扩增获得的α1-mg基因具有完整的阅读框架,亲和层析纯化后可得到活性和纯度均较高的目的蛋白,为研制国产免疫比浊法试剂盒打下基础。     

日本血吸虫候选疫苗原肌球蛋白的表达载体构建、原核表达及免疫原性研究

目的 将日本血吸虫原肌球蛋白基因(tropomyosin)克隆到原核表达载体pET-28a(+)裁体上,在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中表达其产物,并对其进行免疫原性分析.方法 从日本血吸虫的Expressed Sequence Tag(EST)文库中筛选出包含tropomyosin全长基因的EST,然后用高保真酶PCR扩增,构建到pET-280(+)裁体上,最终在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IFTG)诱导表达.表达的his-tropomyosin融合蛋白用镍螯舍树脂蛋白纯化柱(Ni-NTA resin)亲和层析纯化,得到纯度较高的tropomyosin后,通过Western Blotting技术,用感染日本血吸虫的兔血清作为天然抗体来研究tropomyosi的免疫原性.结果 pET-28a(+)-tropomyosin重组质粒在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中成功表达,使用SDS-PAGE分析得到实际Mr约为40 000的his-tropomyosin融合蛋白,Ni-NTA resin的纯化效果很明显,获得的相对纯的目的 蛋白经过Western BIotting方法 检潮显示:tropomyosin融合蛋白能够与感染日本血吸虫6 w的兔血清有较强的免疫反应.结论 Tropomyosin能够在BL-21(DE3)型大肠埃希菌中高效表达,且抗原免疫原性强,日本血吸虫感染的兔血清能够识别体外表达的tropomyosin,具有与天然的tropomyosin相同的免疫原性.     

产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌中SHV型β内酰胺酶的分子生物学研究

目的：了解复旦大学附属华山医院临床分离产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌中SHV型β内酰胺酶的分布、流行情况以及分子生物学特点。方法：用SHV型β内酰胺酶基因的通用引物进行聚合酶链反应(PCR)检测；编码框以外设计引物、PCR扩增SHV型β内酰胺酶全编码基因并进行克隆表达、序列分析；对产SHV型β内酰胺酶的菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测。结果：58株产ESBLs大肠埃希菌中，只有3株细菌产生SHV型β内酰胺酶(5．2％)，其中1株产生SHV—11(非ESBLs)，另2株产生SHV—12(ESBLs)；3株产SHV型β内酰胺酶菌株的PFGE谱型不同。结论：临床分离产ESBLs大肠埃希菌中，SHV型β内酰胺酶的基因型为SHV—11和SHV—12，SHV型ESBLs不是主要的ESBLs型别。未发现产SHV型β内酰胺酶菌株间克隆传播。     

实验方法与改进

细菌抗原微阵列中玻片修饰方法比较。超广谱β-内酰胺酶SHV-4型基因克隆表达与纯化研究，搅拌棒在R1和S位置时对检验结果的影响，化学发光免疫定量检测狂犬病毒抗体方法的建立，荧光检测孕妇感染蛋白质芯片制备的初步研究……     

产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌相关耐药基因研究

目的了解常州地区肺炎克雷伯菌耐药状况及β-内酰胺类耐药基因。方法用琼脂稀释法检测氨苄西林、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南和亚胺培南对肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度(MIC)。采用聚合酶链反应(PCR)检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌16种相关耐药基因,并用DNA测序仪测序。结果120株肺炎克雷伯菌ESBLs阳性率为44.2%(53株)。从53株肺炎克雷伯菌中检出TEM、SHV、CTX-M-1群、CTX-M-9群、OXA-1群、LEN、OKP和DHA 8种β-内酰胺酶基因,阳性率分别为75.5%、22.6%、18.9%、7.5%、11.3%、5.7%、3.8%和41.5%,其中2株菌同时检出6种β-内酰胺酶基因。基因测序证实为TEM-1、TEM-11、SHV-13、SHV-28、CTX-M-22、CTX-M-55、OXA-1和OKP-6等。结论本地区肺炎克雷伯菌已携带多种β-内酰胺酶耐药基因,是其对β-内酰胺类抗菌药物耐药的重要原因之一。