RNA干扰对胃癌耐药细胞MDR1及P-gP表达的影响

目的 寻找逆转胃癌细胞多药耐药的有效方法.方法 根据多药耐药基因1(MDR1)的基因序列,设计并体外转录合成2条siRNA,用脂质体转染将其导入人胃癌多药耐药BGC-823细胞内.应用MTT法检测转染后癌细胞生长增殖情况及对阿霉素(ADM)的敏感性,流式细胞仪检测细胞膜表面P-糖蛋白(P-gp)表达和细胞内Rh123的潴留情况.结果 转染sh-MDR1-1和sh-MDR1-2后,BGC-823细胞对ADM的IC50均降低,敏感性提高;BGC-823细胞MDR1 mRNA和P-gP表达均显著降低,细胞内Rh123稳态积累量均明显增高;上述效果均以转染sh-MDR1-1序列为著.结论 sh-MDR1-1特异性siRNA可抑制BGC-823细胞MDR1表达,此为寻找逆转胃癌细胞多药耐药有效方法奠定了基础.     

应用芯片技术筛查人结肠癌羟基喜树碱多药耐药相关微RNA的研究

目的 探讨新一类调控分子微RNA(miRNA)在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中的作用,为逆转肿瘤化学治疗的多药耐药性提供新的靶点.方法 运用miRCURYTM LNA Array V8.1版芯片检测人结肠癌细胞SW1116和人结肠癌羟基喜树碱多药耐药细胞SW1116/HCPT的miRNA表达谱,筛选出具有表达差异的miRNA(2倍以上).通过PiTcar,Targetscan,MIRanda等算法在线搜寻差异表达miRNA的靶基因.利用茎环特异miRNA引物反转录特异的miRNA,并采用荧光定量PCR法对个别差异表达的miRNA进行验证.结果 用于芯片分析的总RNA的吸光度比值分别为1.93(SW1116)和1.94(SW1116/HCPT).琼脂糖变性凝胶电泳进一步验证总RNA质量符合芯片要求.通过芯片检测后发现SW1116/HCPT相比SW1116表达下调的miRNA共有28条,表达上调的有36条.根据靶基因预测结果,我们选取其中2条表达下调hsa-miR-452,hsa-miR-373*和1条表达上调hsa-miR-506进行荧光定量PCR验证,hsa-miR-452和hsa-miR-506的结果与芯片相符合,但hsa-miR-373*表达量不足以由荧光定量PCR检测出.结论 miRNA表达量的改变可能在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中起有关键作用.     

靶向多药耐药基因mdr1 RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 构建靶向人多药耐药基因mdr1的microRNA(miRNA)干扰表达载体并进行鉴定. 方法 设计并合成4对编码mdr1 pre-miRNA的单链寡核苷酸,退火成双链后将其连接入miRNA干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR,构建成重组质粒,酶切并测序鉴定其正确性. 结果 获得的重组质粒经酶切测序证实其插入片段大小与预期相符,序列完全正确. 结论 成功构建了4个靶向mdr1的miRNA干扰载体.     

Ufd1基因沉默逆转SW1116／HCPT细胞株对羟基喜树碱耐药的研究

泛素融合降解1样蛋白（Ufd1）在蛋白质逆向转运中发挥一定作用。前期研究发现羟基喜树碱（HCPT）耐药人结肠癌细胞株SW1116／HCPTUfd1表达增高。目的：探讨Ufd1基因沉默在逆转SW1116／HCPT细胞株对HCPT耐药性中的作用。方法：干扰组SW1116／HCPT细胞转染Ufd1特异性siRNA以沉默Ufd1基因．对照组转染非特异性siRNA。体外药物敏感性试验检测细胞对HCPT的敏感性,流式细胞术检测细胞周期,比色法测定caspase-3活性,蛋白质印迹法检测p-JNK、p53表达情况和细胞内泛素化蛋白贮留情况。结果：干扰组SW1116／HCPT细胞对HCPT的敏感性显著高于对照组（P〈0．05）。经HCPT作用,干扰组和对照组细胞均出现S期阻滞、caspase-3活性增高和p-JNK、p53、泛素表达增加,干扰组更为明显。结论：以RNA干扰技术沉默Ufd1基因可逆转SW1116／HCPT细胞株对HCPT的耐药性,推测该作用可能与活化JNK信号通路、上调p53表达以及致细胞内泛素化蛋白贮留而破坏细胞内蛋白代谢的协调性有关。     

RNA干扰在胃癌基因治疗研究中的应用

RNA干扰(RNAi)能够特异而有效地阻断靶基因的表达,目前已广泛应用于生物体基因表达、调控与功能等的研究中。在胃癌方面,针对幽门螺杆菌感染与胃癌发病、胃癌化疗多药耐药、胃癌相关基因及治疗等都有许多积极的研究探索。本文在简述RNAi的基础上,综述其在胃癌基因治疗方面的研究和应用新进展。     

人结肠癌羟基喜树碱耐药细胞株SW1116/HCPT的建立与鉴定

背景：肿瘤细胞的多药耐药性是造成化疗失败的主要原因，其机制是多种耐药相关基因表达的改变。目的：探讨消化道肿瘤的多药耐药机制和逆转策略。方法：应用药物浓度递增诱导法建立羟基喜树碱（HCPT）耐药结肠癌细胞株SW1116／HCPT；细胞计数法测定细胞生长曲线；流式细胞仪测定细胞周期分布；细胞染色体染色进行核型分析；四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法进行药物敏感实验；聚合酶链反应（PCR）-酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞端粒酶活性；肿瘤药物耐受功能分类基因芯片筛选差异表达的耐药相关基因。结果：与亲代细胞相比，SW1116／HCPT细胞生长曲线无明显改变；对HCPT的耐药倍数增加120．0倍，并与阿霉素（48．2倍）、氧化苦参碱（2．1倍）、阿糖胞苷（2．0倍）、5．氟尿嘧啶（1．8倍）、顺铂（1-3倍）存在交叉耐药现象；细胞周期分布明显改变，G1期细胞增加，S期细胞减少；细胞染色体无明显变化，核型为非整倍体54-69；细胞端粒酶活性无明显改变；功能分类基因芯片显示，耐药细胞株表达改变的基因有30个。其中表达下调10个，上调20个。结论：SW1116／HCPT是研究消化道肿瘤多药耐药现象的模型之一。     

RNA干扰阻断cyclin D1表达抑制结肠癌细胞增殖

目的:使用RNA干扰技术阻断人结肠癌细胞cyclin D1的表达,检测其对细胞生长增殖的影响和机制.方法:将人结肠癌细胞株HT-29分成3组,antisense组(转染反义链组)、sense组(转染正义链组)和对照组.免疫沉淀和蛋白质印迹法观察cyclin D1 siRNA对细胞cyclin D1蛋白质表达的影响,并对蛋白质电泳图像进行分析,MTT比色法绘制细胞生长曲线,~3H-TdR技术和流式细胞技术观测细胞周期变化结果:反义siRNA有效抑制了cyclin D1蛋白质表达,MTT实验显示,转染反义siRNA的细胞,生长代谢减慢,与对照组细胞差异显著(P<0.01).而antisense组细胞24 h的~3H-TdR渗入量,G_0/G_1期和S期细胞较对照组和sense组明显减少(~3H-TdR:1181.8±117.97 vs 1798.4±55.36,1851.4±83.46:P<0.01;G_0/G_1期:79.31% vs 60.87%.59.14%:S期:13.67% vs 26.42%,27.93%:P<0.01).结论:RNA干扰技术能有效减弱cyclin D1蛋白质表达,使细胞周期受阻,并抑制结肠癌细胞的生长增殖.     

Bcl-XL小分子干扰RNA在结肠癌氟尿嘧啶耐药细胞中的治疗作用

近年来以5-氟尿嘧啶（5-FU）为基础的辅助化疗有效地改善了结肠癌患者的预后,但是不断出现的耐药问题严重影响了其应有的疗效,研究显示5-FU耐药的肿瘤细胞中存在Bcl-2家族蛋白,特别是抗凋亡蛋白Bcl-XL表达的增加,这提示Bcl-XL对于耐药肿瘤细胞的存活起着关键的作用,可能是一个潜在的抗肿瘤靶点.因此我们利用靶向Bcl-XL的小分子干扰RNA（siRNA）特异性下调Bcl-XL蛋白,观察其对细胞生长的影响,并探讨Bcl-XL siRNA治疗结肠癌5-FU耐药细胞的作用.     

小干扰RNA表达质粒载体的构建及其抗乙型肝炎病毒效应

近年研究表明,一些小的双链RNA可以高效特异地阻断体内基因表达,促进RNA降解,在细胞内发挥基因敲除作用,这种现象被称为RNA干扰(RNAi)[1]。RNAi技术已被广泛应用于治疗病毒、癌症等疾病的研究。本研究旨在探讨RNAi技术抗HBV的可行性,从而为RNAi治疗乙型肝炎提供实验基础。一、材料与方法1.细胞株和质粒:含H1启动子的转录载体pSilencer31H1hygro质粒购于Ambion公司,HepG2215细胞由本室引进并保存。2.主要试剂:T4DNA连接酶、T4磷酸激酶、SalⅠ(大连宝生物公司产品);脂质体转染试剂Metafectene(德国Biontex公司产品);HBsA…     

人肝再生增强因子小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

目的 检测人肝癌细胞株HepG2细胞有无人肝再生增强因子(hALR)的表达，构建针对人肝再生增强因子基因编码区的小干扰RNA(siRNA)表达质粒pSIALR-A及其阴性对照质粒pSIALR-B，观察其对人肝再生增强因子表达的影响。方法 用免疫细胞化学法观察HePG2细胞表达hALR的情况。将构建成功的pSIALR-A和pSIALR-B分别转染HepG2细胞，转染后48h，用免疫细胞化学法及逆转录聚合酶链反应法观察人肝再生增强因子蛋白及mRNA的表达。结果 HePG2细胞有人肝再生增强因子的表达。成功构建了针对人肝再生增强因子基因编码区的siRNA表达质粒pSIALR-A，并发现它能明显抑制人肝再生增强因子的表达，而随机序列的siRNA却无此作用。结论 人肝再生增强因子的siRNA具有明显和特异性的抑制人肝再生增强因子的表达作用。     

人结肠癌羟基喜树碱多药耐药细胞的蛋白质组学研究

目的对结肠癌羟基喜树碱多药耐药细胞（SW1116／HCPT）及其亲代细胞（SW1116）进行蛋白质组学比较研究，探讨肿瘤细胞的多药耐药机制。方法培养羟基喜树碱多药耐药细胞和亲代细胞，提取蛋白质，以固相pH梯度等电聚焦为第一向，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳为第二向进行双向电泳，图像分析软件分析电泳图谱，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱或基质辅助激光解吸电离飞行时间／飞行时间串联质谱鉴定蛋白质。结果发现9个蛋白质点在SW1116／HCPT细胞中表达量发生改变，4个蛋白质点表达量增加，5个蛋白质点表达量减少。质谱鉴定了6个蛋白质点分别为：琥珀酸脱氢酶复合物（亚单位A）、3-磷酸甘油醛脱氢酶、泛素融合降解1相似蛋白、胞核氯离子通道蛋白、β-微管蛋白和ORF蛋白。结论该研究有助于深入理解结肠癌羟基喜树碱多药耐药机制，并有望在新型耐药逆转剂的开发上发挥作用。     

丁硫氨酸硫酸亚胺逆转人结肠癌细胞多药耐药的机制

目的探讨丁硫氨酸硫酸亚胺(BSO)逆转人结肠癌LoVo／Adr细胞多药耐药性的可行性,并初步探讨其逆转机制。方法MTT法检测BSO对多药耐药LoVo／Adr细胞抗癌药物敏感性的影响; RT-PCR法检测细胞中多药耐药1(mdr1)基因及谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-πmRNA水平;免疫组化染色检测GST-π蛋白水平;1氯-2,4-二硝基苯法测定GST活性。结果BSO作用后亲本LoVo细胞中阿霉素、丝裂霉素的IC50无显著变化,而在LoVo／Adr细胞中,阿霉素的IC50由(3．08±0．84)mg／L降至(1.31±0．53)mg／L(t=3．09,P<0．05),丝裂霉素的IC50由(1．24±0．45)mg／L降至(0．54±0．32)mg/L(t=165．50,P<0.01);BSO对mdr1基因mRNA水平无影响,BSO作用前后GST-πmRNA表达量分别为1．75±0.24和0．84±0．19(t=5．11,P<0．05),BSO作用后LoVo／Adr细胞GST-π蛋白表达显著低于处理前;BSO处理前后LoVo／Adr细胞GST活性分别为(144．26±50．13)和(129.58±41．36)U／mg(t=0,57,P>0．05)。结论BSO可有效增强人结肠癌耐药细胞LoVo／Adr对阿霉素、丝裂霉素的敏感性,具有逆转作用,其机制与mdr1基因无关,但与GST-π基因下调有关,可能是通过降低细胞内GST-π含量,增强对化疗药物的敏感性。     

RNAi对结肠癌HCT-8细胞桩蛋白表达的沉默作用观察

目的观察RNA干扰（RNAi）对结肠癌HCT-8细胞桩蛋白（Paxillin）表达的沉默作用。方法构建针对Paxillin基因序列的短发卡RNA（shRNA）表达载体,并转染至结肠癌HCT-8细胞,72 h后分别用实时定量PCR和Western blot法测定转染细胞中Paxillin mRNA及蛋白。结果根据针对Paxillin基因设计了小干扰RNA（siRNA）序列,构建了shRNA表达载体,并成功转染至HCT-8细胞。以空白对照组作均一化,转染Paxillin-shRNA_1、Paxillin-shRNA_2、Paxillin-shRNA_3、Paxillin-shRNA_NC的细胞及空白对照组细胞Paxillin mRNA相对表达量分别为0.66±0.28、0.31±0.11、1.00±0.22、1.05±0.32、1.00±0.29,Paxillin蛋白相对表达量分别为0.62±0.11、0.39±0.13、0.74±0.21、0.94±0.09、1.00±0.16。结论 RNAi可沉默结肠癌HCT-8细胞Paxillin的表达。     

介导EGFR siRNA转染肝癌HepG2细胞的试剂筛选及条件优化

目的筛选介导表皮生长因子受体（EGFR）小干扰RNA（siRNA）转染肝癌HepG2细胞的试剂,并优化转染条件。方法设计靶向EGFR的特异性siRNA,分别用Lipofectamine 2000、siPORT Amine、ICAFectin 442、N-TER nanoparticle、X-tremeGENE、polyMagnetofection、combiMAGnetofection介导转染肝癌HepG2细胞48、72 h。实时定量RT-PCR检测HepG2细胞的EGFR mRNA,计算敲除EGFR mRNA率,据此筛选出最佳转染试剂,继续进行不同试剂用量、不同siRNA浓度、正反向转染的对比。测算转染后细胞存活率及转染率。结果 Lipofectamine2000、siPORTAmine及combiMAGnetofection介导转染72 h后,HepG2细胞的EGFR mRNA敲除率均超过65%。2μl的combiMAGnetofection及200 nM的EGFR siRNA组合、72 h时HepG2细胞的EGFR mRNA沉默效率最高（90%±1%）,其细胞存活率为94%±8%,转染率超过95%。结论介导EGFR siRNA转染HepG2细胞的最佳试剂是combiMAGnetofection,优化转染条件为2μl的combiMAGnetofection、200 nM的EGFR siRNA、转染72 h。     

人结肠癌细胞胃泌素-黏着斑激酶通路的研究

目的研究胃泌素对人结肠癌细胞信号分子黏着斑激酶(FAK)酪氨酸磷酸化和蛋白质表达的影响。方法使用胆囊收缩素2受体(CCK2R)的真核表达载体pCR3.1/CCK2R,转染人结肠癌细胞株Colo320,上调胃泌素作用;使用胃泌素拮抗剂下调胃泌素作用。使用胃泌素按浓度和时间梯度刺激细胞,以免疫沉淀和蛋白质印迹法检测FAK酪氨酸磷酸化和蛋白质表达情况。结果胃泌素能够引起FAK酪氨酸磷酸化,具有时间和剂量依赖性;CCK2R表达上调可以增强此作用;胃泌素拮抗剂具有相反作用。结论FAK是胃泌素发挥效应的下游信号分子,以酪氨酸磷酸化的形式发挥作用。胃泌素CCKRFAK信号通路在胃泌素引起的肿瘤细胞增殖过程中发挥重要作用。     

可溶性耐药相关钙结合蛋白高表达在胃癌细胞耐药中的作用机制

目的 探讨可溶性耐药相关钙结合蛋白(Sorcin)在胃癌耐药中的作用及机制.方法 采用逆转录(RT)-PCR法扩增Sorcin cDNA片段编码区序列全长.DNA重组技术构建FLAG-Sorcin融合表达载体.经脂质体介导稳定转染胃癌SGC7901细胞.RT-PCR及Western印迹法分别检测转染细胞中Sorcin mRNA水平和蛋白水平的表达变化.高效液相色谱(HPLC)法检测Sorcin转染细胞(SGC7901-F-Sor)及对照细胞(SGC7901)内长春新碱(VCR)的浓度及维拉帕米(VRP)对其的影响.结果 RT-PCR法成功扩增出Sorcin eDNA片段编码区序列全长,并构建FLAC-Sorcin融合表达载体.RT-PCR及Western印迹法证实,Sorein在SGC7901转染细胞中高表达.HPLC检测显示Sorcin高表达的SGC7901细胞胞内VCR浓度较其亲本SGC7901细胞降低76.89%.VRP能增加VCR在细胞内的蓄积,VRP处理后,SGC7901-F-Sor细胞内VCR浓度增加2.41倍.结论 Sorcin高表达可致胃癌SGC7901细胞内VCR蓄积减少,提示Sorcin可能通过改变细胞膜两侧药物转运参与胃癌耐药,VRP能部分逆转此作用.     

应用表达载体介导siRNA抑制胰腺癌STAT3基因表达的研究

目的探讨表达载体介导小干扰RNA（siRNA）对人胰腺癌细胞系SW1990转录激活因子-3（STAT3）表达的抑制作用。方法设计合成3种可编码后形成小发夹结构针对STAT3基因的siRNA的DNA序列，将其连入pRNAT—U6．1／Neo质粒中，构建STAT3siRNA表达载体。表达载体进行PCR及测序鉴定，并分别转染SW1990细胞，实时定量PCR和Western blot观察SW1990细胞转染后STAT3 mRNA和蛋白表达的改变。结果PCR和DNA测序证实携带3种STAT3 siRNA表达载体构建成功，分别转染SW1990细胞后，STAT3基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降（P〈0．05），其中，第二种STAT3 siRNA作用明显，可使mRNA和蛋白表达水平分别下降63％和60％。结论本研究构建的STAT3．siRNA表达载体可有效抑制SW1990细胞STAT3的mRNA和蛋白表达，为下一步以STAT3为靶点的胰腺癌基因治疗实验研究奠定了基础．     

Prevention of liver metastasis by intraperitoneal 5-FU chemotherapy in nude mice inoculated with human colon cancer cells

AIM: To prevent hepatic metastasis by regional adjuvant chemotherapy after radical surgery for colon cancer. METHODS: A nude mouse model of human colon cancer (HCC) was used to evaluate the prevention of metastasis of HCC cells following the application of early postoperative intraperitoneal (IP) high-dose 5-fluorouracil chemotherapy. RESULTS: The incidence of liver metastasis was decreased by 40%, and the mean number of metastatic liver nodules was reduced by 50.89%. Compared with controls, 5-FU 40 mg in NS 40 mL/kg IP for 2 consecutive days prolonged mean survival by 48.21%. CONCLUSION: IP is a promising and effective novel regional adjuvant chemotherapy for the prevention of liver metastasis of HCC cells after radical surgery for colon cancer.