抑制性消减杂交法构建甲状腺癌差异表达基因文库

目的：筛选并克隆在甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的基因。方法：(1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差示表达分析,构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库;(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性高／低表达的基因;(3)登录Genbank,运用Blastn程序进行同源性分析。结果：成功构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库,对其中数个克隆的插入cDNA片段进行测序,经检索Genbank表明,正向SSH产物中有3个片段与来源于结肠上皮腺癌和Lung Epidermoid carcinoma的EST有100％同源性,提示它们来自恶性肿瘤相关基因。反向SSH产物中有5个片段为未知新序列,提示它们可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。结论：通过抑制性消减杂交技术,构建了人甲状腺癌cDNA消减文库,为下一步筛选鉴定甲状腺癌特异性基因及其全长克隆、功能研究等工作打下了基础。     

膀胱癌差异表达基因BQ135232的全长克隆及意义

目的 克隆并鉴定膀胱移行上皮细胞癌(BTCC)的差异表达基因.方法 应用抑制消减杂交技术(SSH)构建膀胱癌和其正常上皮组织差异表达的cDNA消减文库,进一步利用斑点印迹杂交筛选出BTCC差异表达的基因, 对其中明显差异表达的BQ135232应用SMART RACE克隆全长,再应用免疫荧光原位杂交进行染色体定位,并应用Northern blot进行差异表达分析.结果 成功构建了人膀胱癌组织的cDNA消减文库,共含有376个阳性克隆和83个阴性克隆.随机挑出的100个阳性克隆中,76个克隆含有肿瘤差异表达的基因片段,对其进行同源性比对分析,其中有66个克隆为已知基因,其余的10个克隆代表5种未知基因.未知基因中BQ135232共有3个拷贝,染色体定位发现其位于第12号染色体近末端处.Northern杂交分析显示它在膀胱癌组织中高表达,而在正常膀胱组织中无明显表达.结论 本研究表明BQ135232是跟膀胱癌发生发展密切相关的新基因,它的成功克隆为阐明膀胱癌发生发展的分子生物学机制开辟了新的途径.     

乳腺癌相关差异表达基因的筛选及分析

目的构建乳腺癌组织与癌旁正常乳腺组织差异表达的cDNA消减文库,筛选乳腺癌相关基因并进行分析。方法应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术对15对乳腺癌组织及正常癌旁乳腺组织进行差异基因的消减,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,采用数字表法随机挑选克隆经PCR鉴定后,对200个阳性克隆插入片段的序列进行测定及同源性分析。结果建立了乳腺癌差异表达片段cDNA消减文库;通过测序和同源性分析,得到173个差异表达基因,其中26个与肿瘤发生发展相关;26个基因中有15个已被文献明确报道在乳腺癌组织或细胞中有差异表达。结论应用SSH技术成功建立了乳腺癌差异表达基因cDNA消减文库,为乳腺癌的发病机制研究及寻找潜在的治疗靶点提供了有力的支持。     

人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库的构建

目的 构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。方法 采用抑制性消减杂交技术，以胃印戒细胞癌组织为检测子，正常胃黏膜组织为驱动子，分离胃印戒细胞癌组织特异性表达的基因片段，并与T载体连接，构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。结果 成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，获得200多个阳性克隆，随机挑取50个克隆鉴定均有长度为100～750bp插入片段。结论应用抑制性消减杂交技术构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆人胃印戒细胞癌组织特异性表达基因奠定基础。     

应用抑制消减杂交技术构建肝癌差异表达基因消减cDNA文库

目的 构建肝癌及癌旁肝细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法 采用新近建立的抑制消减杂交方法,以肝癌组织及癌旁肝组织作为对比材料,分离肝癌组织中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用电穿孔法转化大肠杆菌进行文库扩半后,随机挑取100个白色克隆及菌落PCR进行鉴定。结果 扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,95％的克隆中均有100－600bp的插入片段,这些片段可能是肝癌差异表达基因的cDNA片段。结论 用SSH法及T／A克隆技术成功构建了肝癌与癌旁肝组织差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选,克隆肝癌差异表达的新基因奠定了基础。     

甲状腺癌特异性低表达基因的筛选与克隆

目的 筛选并克隆在甲状腺癌组织中特异性低表达的基因。方法 (1)应用抑制性消减杂交(SSH)进行基因差异表达分析，构建人甲状腺癌组织与正常甲状腺组织之间差异表达的cDNA消减文库。(2)克隆、鉴定甲状腺癌组织特异性低表达的基因。(3)登录Genbank，运用Blastn程序进行同源性分析。(4)应用cDNA末端快速扩增法(RACE)获取目的基因TCRS30的cDNA全长。(5)Northem blot验证TCRS30号基因的差异表达。结果 构建了高消减效率的人甲状腺癌cDNA消减文库，通过筛选阳性克隆，获得一个在甲状腺癌组织中低表达的基因片段，经检索Genbank表明，在已知的人类EST数据库中找不到高度同源的序列，提示它可能来自于在甲状腺癌中特异性低表达的新基因。以RACE法获知TCRS30的cDNA全长约为4．5kb，通过Northem blot初步验证了TCRS30号基因在甲状腺癌和正常甲状腺组织中存在差异表达。结论 通过SSH和RACE技术，获得了一个在甲状腺癌和正常甲状腺组织中差异表达的未知基因片段TCRS30，它可能代表着一条对甲状腺癌有抑制作用的新基因。     

应用抑制性消减杂交筛选大鼠不同程度肝纤维化的上调基因

目的应用抑制消减杂交技术,筛选大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化和重度肝纤维化组织中差异表达的上调基因。方法利用抑制消减杂交技术,构建大鼠轻度肝纤维化和重度肝纤维化2个差异cDNA文库,并挑选36条上调显著的基因进行测序鉴定。结果获得1152个克隆,其中有1036个含有插入片段。挑选32个克隆测序,与GenBank数据库进行初步比较,其中28条与已知基因的部分序列高度同源。结论应用抑制消减杂交技术成功构建了轻度肝纤维化和重度肝纤维化差异表达基因的cDNA削减文库,为进一步研究肝纤维化发生、发展和逆转的机制奠定了理论基础。     

应用抑制消减杂交和斑点印迹杂交对膀胱癌差异表达基因的研究

目的：研究膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜的差异表达基因。方法：应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization SSH)构建人膀胱移行细胞癌和正常粘膜差异表达的cDNA消减文库，进一步利用斑点印迹杂交(Dot blot)从中筛选出TCC差异表达的基因，随机选取部分克隆进行测序，结果在GenBank中作同源性对比分析。结果：成功构建了具有高消减效率的人TCC的cDNA消减文库，从文库的376个阳性克隆中随机选取100个克隆扩增、筛选后得到89条200～900bp的差异表达基因片段，测序后发现5条未知新基因片段和41种已知基因。结论：利用SSJ和Dot blot研究膀胱癌差异表达基因，为大批量筛选和克隆其差异表达的基因提供了行之有效的方法，也为研究基因功能和TCC的发生机制奠定了基础。     

高胆固醇血症小鼠相关基因消减文库的建立

目的 构建高胆固醇血症小鼠cDNA消减文库.方法 以高胆固醇血症小鼠肝组织的eDNA为Teste,以正常小鼠肝组织的cDNA为Driver,应用抑制消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization).构建正向消减文库,反之构建反向消减文库.结果 成功构建高胆固醇血症cDNA正.反向消减文库,利用葛落PCR技术鉴定文库的阳性克隆.结论 用SSH技术成功构建了高胆固醇血症小鼠差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选.克隆高胆固醇血症小鼠差异表达的基因奠定了基础.     

应用抑制性消减杂交筛选大鼠不同程度肝纤维化的上调基因

目的 应用抑制消减杂交技术,筛选大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化和重度肝纤维化组织中差异表达的上调基因.方法 利用抑制消减杂交技术,构建大鼠轻度肝纤维化和重度肝纤维化2个差异cDNA文库,并挑选36条上调显著的基因进行测序鉴定.结果 获得1 152个克隆,其中有1 036个含有插入片段.挑选32个克隆测序,与GenBank数据库进行初步比较,其中28条与已知基因的部分序列高度同源.结论 用抑制消减杂交技术成功构建了轻度肝纤维化和重度肝纤维化差异表达基因的cDNA削减文库,为进一步研究肝纤维化发生、发展和逆转的机制奠定了理论基础.     

Suppression subtractive hybridization for identifying differentially expressed genes in renal cell carcinoma

Objective To construct a renal cell carcinoma (RCC) cDNA subtractive library using suppres sion subtractive hybridization.Methods Polyadenylated RNA ［Poly (A)(+) RNA］ was isolated from tissues of RCC and norm al kidney, and single- strand cDNAs and double-strand cDNAs were synthesized in turn. RCC cDNAs were divided into two groups and ligated to the specific adaptors l and 2, and then h ybridized with normal kidney cDNA twice with two rounds of suppression PCR. Sec ond round PCR products were cloned to T/A plasmid vectors to set up the subtract ive library. One hundred clones were randomly picked to perform enzyme digest a nalysis, and some underwent sequence analysis and Northern blot to identify RCC specifically expressed genes. SMART RACE procedure was operated to clone full l ength novel RCC specifically expressed genes.Results A human RCC subtractive library with high subtractive efficiency was successfull y set up. The amplified library contains 350 positive clones. Random analysis of 100 clones with enzyme restriction showed that 85 plasmids in the clones cont ained 50-400 bp inserts. Sequence analysis was performed for 10 clones. All t he 10 sequences were unknown before and derived from 6 unique, novel genes among which the cDNA insert RCC18 had five copies. Northern blot analysis showed tha t RCC18 cDNA was highly expressed in RCC, but no signal could be detected in nor mal kidney. Using SMART RACE technique, we obtained the full length of the nove l gene RCC18.Conclusions The constructed cDNA subtractive library of human RCC is a highly efficient one and lays a solid foundation for large scale screening and cloning new and speci fic oncogenes or tumor suppressor genes of RCC. The novel specifically expresse d genes provided an important clue for studying the mechanisms of occurrence and development of RCC.     

用抑制性消减杂交方法筛选人肾癌相关基因

目的 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌差异表达基因文库并进行差异表达基因筛选.方法 以肾癌细胞株RLC-310和肾近曲小管细胞株HK-2互为实验组和对照组,提取mRNA,应用抑制性消减杂交技术进行正反两向消减杂交,获得人肾癌细胞差异表达基因文库,结合反向Northern斑点印迹杂交,筛选差异基因克隆,并进行测序分析.结果 正向和反向文库共包含1200多个阳性克隆,经斑点杂交筛选后,对213个差异克隆进行测序并经BLAST分析,得到144个差异表达基因,与肾癌相关的高表达基因67个,低表达基因77个,其中新EST 14个,未知功能基因21个;对测序基因进行聚类分析发现与细胞生长、黏附、凋亡等肿瘤细胞生物学行为相关.结论 该文库质量可靠,所筛选出的差异基因和新的基因为进一步筛选肾癌特异性相关基因,绘制肾癌差异基因表达谱,最终阐明肾癌发生、发展、转移机制提供了实验材料和研究靶点.     

家族性急性髓系白血病差异表达基因的筛选与鉴定

目的分离家族性急性髓系白血病患者骨髓中差异表达的基因,在基因水平上探讨急性白血病发生发展的分子机制。方法应用Super SMART和抑制性消减杂交（SSH）技术,构建家族性急性髓系白血病cDNA消减文库;应用差异筛选技术进行差异表达片段的筛选与鉴定;测序结果进行BLAST同源性比对分析。结果成功构建了家族性急性髓系白血病cDNA消减文库;克隆、筛选并鉴定了17条基因片段,与已知基因同源,11条为未知基因片段。结论SSH技术是筛选差异表达基因的有效方法;获得多个与细胞增殖和分化相关的已知基因;获得11条新基因EST片段,并被GenBank收录。     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的 :采用消减抑制杂交技术 ,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况 ,分离食管癌相关基因片段 ,构建食管癌的消减cDNA文库。方法 :以食管癌癌组织为测试子 (tester) ,以正常食管粘膜组织为驱赶子 (driver) ,用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体 ,经蓝白斑筛选后 ,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒 ,构建食管癌消减cDNA文库。结果 :用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段 ,经蓝白斑筛选 ,得到 2 2 0个白色克隆 ;再用PCR方法快速筛选出 10 0个两端分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R的阳性重组质粒 10 0个 ,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论 :构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因 ,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆 ,对于消减文库的构建具有重要意义     

应用抑制消减杂交技术克隆人大肠癌转移相关新基因

目的 克隆新的大肠癌转移相关基因,为进一步阐述大肠癌转移的分子机制提供线索。方法 利用抑制消减杂交技术,以1对来自同一亲本、转移能力不同的大肠癌细胞株SW620和SW480为研究对象,构建2种大肠癌转移促进基因和转移抑制基因的cDNA消减文库。随机挑取文库克隆进行差异筛选,对所得的差异片段进行测序和同源性分析,利用Northern Blot对新基因的表达情况进行验证。结果 两种消减文库分别含有235和232个白色克隆,90%以上的白色克隆含有插入片段。随机挑取约200个阳性克隆进行差异筛选。共获得29个差异片段。测序及同源分析发现15个为未知基因,GenBank登陆号为CD485499-CD485513。其中与5号染色体序列同源的基因有6个。结论 抑制消减杂交技术是筛选、克隆大肠癌转移相关新基因的有效手段;5号染色体上可能存在多个与大肠癌转移相关的新基因位点;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法采用新近建立的抑制消减杂交方法,哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料,分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,随机挑取100个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,90％的克隆中均有200～600bp的插入片段,这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

正加速度重复暴露大鼠脑差异表达基因的筛选

目的 筛选大鼠经正加速度(Gosiliveacceleration， Gz)重复暴露后脑的差异表达基因，探讨 Gz重复暴露致脑损伤的分子机制。方法 应用抑制性消减杂交技术，构建高消减效率的 Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库；用差异筛选技术筛选阳性克隆；用序列分析确定阳性克隆的性质；用RT—PCR证实阳性克隆的可靠性。结果 从消减库中获得70个阳性克隆；经差异筛选后，选取其中10个阳性克隆，序列分析表明，7个克隆与已知基因高度同源，3个为新的候选基因。RT—PCR证实了差异表达基因在 Gz重复暴露大鼠脑中高表达。结论 用抑制性消减杂交技术筛选发现的3个新的cDNA可能在 Gz脑损伤的病理过程中起重要作用。