RKIP在鼻咽癌侵袭转移中的作用及机制研究

目的:研究Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitory protein,RKIP)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)侵袭转移中的作用及其机制.方法:采用免疫组织化学染色检测RKIP在转移潜能不同的NPC组织中的表达,分析其表达水平与NPC临床病理特征和患预后的关系;采用脂质体转染技术建立RKIP表达改变的稳定转染NPC细胞系,采用刮痕愈合实验和Transwell小室侵袭实验检测细胞的体外运动和侵袭能力,采用Western blot检测NF-κB信号分子磷酸化水平.结果:RKIP在NPC组织中的表达显著低于正常鼻咽粘膜组织,在有转移NPC组织中的表达明显低于无转移NPC组织,在颈淋巴结转移癌组织中的表达明显低于原发癌;RKIP表达水平与NPC的淋巴结转移、远处转移、临床分期以及NPC患的总生存期负相关;RKIP表达上调降低5-8F NPC细胞的体外运动和侵袭能力,而RKIP表达下调增强6-10B NPC细胞的体外运动和侵袭能力;RKIP表达水平与NPC细胞NF-κB信号通路的活性负相关,NF-κB抑制剂Bay11-7082能抑制RKIP下调的6-10B细胞的体外运动和侵袭.结论:RKIP可能是NPC的一个转移抑制蛋白,RKIP低表达的NPC患预后差,RKIP表达下调通过活化NF-κB通路促进NPC的侵袭和转移.     

HCV核心蛋白与NS4B对HepG2细胞增殖的影响

目的 探讨HCV核心蛋白与非结构蛋白4B（NS4B）对HepG2细胞增殖的影响及可能机制.方法 重组质粒pcDNA3.1（-）Core与pcDNA3.1（-）NS4B单独和联合转染HepG2细胞,同时以转染空载体和未转染HepG2细胞作为对照.RT-PCR及Western Blot检测各组细胞中HCVCore、NS4B 、Wnt1、β-catenin 、c-myc及CyclinD1表达;MTT法,平板克隆形成试验检测HCV核心蛋白与NS4B对HepG2细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期.结果 ①pcDNA3.1（-）Core与pcDNA3.1（-）NS4B单独和联合转染HepG2细胞,成功表达HCV Core或/（和）NS4B mRNA和蛋白.②pcDNA3.1（-）Core和pcDNA3.1（-）NS4B单独转染和联合转染的HepG2细胞Wnt1、β-catenin、c-myc、CyclinD1 mRNA与蛋白的相对表达量均高于HepG2/pcDNA3.1（-）组和HepG2组（P＜0.01）.③与HepG2/pcDNA3.1（-）组和HepG2组比较,pcDNA3.1（-）Core和pcDNA3.1（-） NS4B单独转染和联合转染的HepG2细胞活力和克隆形成能力增强,S期和G2/M期细胞比例升高（P＜0.01）.结论 HCV核心蛋白与NS4B能加速HepG2细胞周期进程,促进细胞增殖,这种效应可能与其增强Wnt1、β-catenin、c-myc及CyclinD1的表达相关.     

siRNA抑制nm23-H1基因表达对鼻咽癌6-10B细胞生物学行为的影响

目的：采用RNA干扰技术下调nm23-H1基因在鼻咽癌6-10B细胞中的表达,探讨nm23-H1表达下调对6-10B细胞生物学行为的影响。方法：采用脂质体法将nm23-H1基因siRNA(nm23-H1 siRNA)瞬间转染6-10B细胞,Western 印迹检测转染细胞中nm23-H1蛋白的表达水平,然后利用MTT法、流式细胞术和Transwell小室实验分别检测转染6-10B细胞的增殖、细胞周期和体外迁移侵袭等生物学行为的变化;测序检测6-10B细胞nm23-H1基因有无S120G 点突变。结果： nm23-H1 siRNA有效地下调nm23-H1基因的表达, nm23-H1 siRNA转染6-10B细胞的增殖能力增强,S期细胞增多,体外迁移和侵袭能力增强（P<0.05）。6-10B细胞nm23-H1 基因无S120G 点突变。结论：nm23-H1基因具有抑制人鼻咽癌细胞6-10B增殖和体外迁移侵袭的作用。     

人PSCA真核表达质粒的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1-PSCA,通过稳定转染建立高效表达人前列腺干细胞抗原(PSCA)的小鼠黑色素瘤B16细胞系。方法:利用PCR扩增出人PSCA全长基因的cDNA编码区序列,使用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组表达质粒pcDNA3.1-PSCA。双酶切及测序鉴定后,利用脂质体法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,G418加压筛选后得到阳性克隆。通过流式细胞术、免疫荧光及Western blot检测PSCA在细胞系中的表达情况。结果:经测序及双酶切鉴定,pcDNA3.1-PSCA重组质粒构建正确;稳定转染人PSCA的B16细胞系表达率接近100%。结论:建立的稳定转染人PSCA的B16细胞系能够高效表达PSCA基因,为抗前列腺癌疫苗的功能研究奠定了基础。     

Pax-8 基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究

目的: 构建大鼠 Pax-8 基因全长序列的真核表达载体pcDNA3.1(+),并将重组质粒转染至心肌细胞系H9c2中进行表达,测定转染后 Pax-8 基因对心肌细胞增殖及凋亡的影响。方法: 酶切pCMV sport6- Pax-8 获得大鼠 Pax-8 全长基因,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Pax-8。限制性酶切鉴定和DNA测序鉴定插入片段。将重组质粒经脂质体法转染至大鼠心肌细胞系H9c2细胞中,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后Pax-8 mRNA及蛋白表达水平。CCK-8法检测细胞增殖;以血清饥饿诱导心肌细胞凋亡,同时进行 Pax-8 质粒转染,流式细胞仪检测细胞凋亡指数,Western blotting法检测活化caspase-3的表达。结果: 成功构建了大鼠pcDNA3.1(+)-Pax-8真核表达载体,且证实转染后心肌细胞的 Pax-8 mRNA 及蛋白表达均明显高于空白对照组(P<0.05)及空质粒组(P<0.05)。转染 Pax-8 基因能提高心肌细胞的增殖能力(P<0.05),明显抑制血清饥饿引起的细胞凋亡(P<0.01),同时下调活化caspase-3的表达(P<0.01)。结论: 通过基因重组技术成功使得 Pax-8 基因在心肌细胞中过表达。 Pax-8 基因可能通过促进心肌细胞增殖及抑制心肌细胞凋亡从而参与胚胎心脏发育的过程。     

过表达Raf激酶抑制蛋白(RKIP)抑制人肝星状细胞增殖

目的研究Raf激酶抑制蛋白(RKIP)对LX-2人肝星状细胞增殖的影响。方法用重组质粒pc DNA3.1-RKIP转染LX-2细胞,G418筛选并培养稳定转染的细胞。MTT法和集落形成试验检测过表达RKIP对LX-2细胞增殖、集落生成的影响;Western blot法检测RKIP、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、1型胶原蛋白(Col1)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)、MMP-2及胞外信号调节激酶/丝裂原激活蛋白激酶(ERK/MAPK)信号通路相关蛋白的表达水平。结果与对照细胞相比,过表达RKIP明显抑制LX-2细胞增殖和集落形成,下调Col1、α-SMA、MMP-1和MMP-2蛋白表达,降低ERK/MAPK磷酸化水平。结论过表达RKIP抑制LX-2细胞的增殖,其机制与抑制ERK/MAPK信号通路有关。     

反义核酸抑制B16黑色素瘤细胞tyr基因的表达

目的：用反义核酸技术抑制小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因（tyr）的表达。 方法： 构建tyr反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr，用脂质体法导入B16细胞，用酪氨酸酶活性及黑色素含量测定，多巴染色及透射电镜等检测由反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr转录产生的tyr反义核酸对B16细胞tyr表达的抑制情况。 结果： 成功构建了反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr，转染了反义重组体的B16细胞其酪氨酸酶活性为0.0498±0.0036，显著低于对未转染组B16细胞的0.0916±0.0132(P<0.01);转染空质粒pcDNA3.1(-)及真核表达重组体pcDNA3.1(+)-tyr组B16细胞的氨酸酶活性分别为0.1015±0.0166和0.0948±0.0096,两者同对照组相比均无显著差异(P>0.05)。多巴染色及电镜观察结果表明转染了反义重组体的B16细胞其黑色素颗粒的含量明显低于对照组。 结论： 反义核酸可以显著抑制B16黑色素瘤细胞tyr的表达。     

HBV基因组各基因真核表达载体的构建及转染

目的 构建HBV基因组各基因真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系.方法 采用PCR方法,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBV基因的各基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用细胞流式技术及细胞免疫组化技术检测HBV各基因产物在细胞内的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/HBs、pcDNA3.1( )/HBc、pcDNA3.1( )/HBe、pcDNA3.1( )/HBp、pcDNA3.1( )/HB-preS1、pcDNA3.1( )/HB-preS2、pcDNA3.1( )/HBx真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的 基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究各基因的功能奠定良好的实验基础.     

miR-107抑制胶质瘤细胞的体外增殖、迁移和侵袭

目的探讨miR-107对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的调控机制。方法运用RT-qPCR检测人正常的星形胶质细胞系NHA、神经胶质瘤细胞系U87、A172、U251中miR-107和FOXK1的表达;将细胞分为miR-NC组(转染miR-NC)、miR-107组(转染miR-107 mimics)、si-NC组(转染si-NC)、si-FOXK1组(转染si-FOXK1)、miR-107+pcDNA3.1组(共转染miR-107 mimics和pcDNA3.1)和miR-107+pcDNA3.1-FOXK1组(共转染miR-107 mimics和pcDNA3.1-FOXK1);用脂质体法分别转染至U87细胞;CCK-8法检测细胞的增殖;Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭;Western blot检测细胞中FOXK1的蛋白表达;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果与正常的星形胶质细胞NHA相比,神经胶质瘤细胞U87、A172、U251中miR-107表达明显下调,FOXK1表达明显上调(P<0.05);过表达miR-107、敲减FOXK1均可抑制U87细胞的增殖、迁移和侵袭;miR-107可抑制野生型FOXK1的细胞荧光活性,并负向调控FOXK1的表达;过表达FOXK1可逆转miR-107对U87细胞增殖迁移侵袭的抑制作用。结论 miR-107抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制可能与靶向负调控FOXK1有关,将可为胶质瘤的诊断和治疗提供靶向治疗的依据。     

miR-346 在鼻咽癌中的表达及生物学功能

目的:探讨miR-346 在鼻咽癌中的表达及在鼻咽癌中的生物学功能。方法:收集63 例鼻咽癌组织以及34 例 鼻咽部非癌组织标本,Real-time PCR 检测组织和6 株人鼻咽癌细胞系及1 株人正常鼻咽部永生化上皮细胞株NP69 中miR- 346 表达量,选取人鼻咽癌细胞系中表达量居中的两种细胞系,并转染miR-346 inhibitor,设置对照组(NC 组)并转染阴性对照 质粒,Real-time PCR 检测两种细胞系转染miR鄄346 inhibitor 和对照组miR鄄346 表达量,细胞增殖、凋亡分别采用Brdu-ELISA 和 流式细胞术检测,Transwell 小室实验检测细胞迁移和侵袭。结果:与鼻咽非癌组织比较,鼻咽癌组织中miR-346 表达量显著升 高(P =0.000);以正常人鼻咽部上皮细胞NP69 比较,各鼻咽癌细胞株中miR-346 相对表达量均显著升高,差异有统计学意义 (P<0.05)。选择6 种鼻咽癌细胞株中miR-346 表达量居中的两种,分别为CNE-1 和CNE-2,转染miR-346 inhibitor 后,两种鼻 咽癌细胞株miR-346 相对表达量均显著降低,与NC 组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。两种鼻咽癌细胞转染miR-346 inhibitor 下调miR-346 表达后鼻咽癌细胞的增殖受到抑制,均在转染第3 天差异具有统计学意义(P<0.05)。下调miR-346 表 达后鼻咽癌细胞CNE-1 和CNE-2 的凋亡显著增加,迁移细胞数和侵袭细胞数显著降低,与NC 组比较差异均有统计学意义 (P<0.05)。结论:miR-346 在鼻咽癌中高表达,下调miR-346 表达会抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进凋亡,miR-346 可 能作为一种癌基因在鼻咽癌的发生和发展中发挥重要的作用。     

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对NIH3T3细胞增殖的影响

目的:研究新发现的小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响,探讨基因的生物学功能。方法:构建真核表达质粒pcDNA3.1( )-Biot2,由脂质体包裹稳定转染NIH3T3细胞,用Realtime RT-PCR、Western blot等方法筛选和鉴定Biot2表达阳性细胞克隆,研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果:成功构建真核表达重组质粒pcDNA3.1( )-Biot2,并稳定转染于NIH3T3细胞。与对照组相比,转染了Biot2cDNA的NIH3T3细胞生长速率明显增快。结论:成功地建立稳定转染小鼠新基因Biot2的NIH3T3细胞克隆;Biot2基因能影响细胞增殖的调节,促进NIH3T3细胞的增殖,为进一步研究基因生物学功能奠定了基础。     

过表达泛素偶联酶E2C对293T细胞增殖的影响

目的:构建稳定过表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C)的293T人胚肾细胞株,初步探讨其对293T细胞增殖的影响。方法:采用脂质体法将已成功构建的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒转入293T人胚肾细胞株中,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株;用Western blot技术检测并鉴定UBE2C基因在293T细胞中的表达情况;用MTT法检测UBE2C对293T细胞增殖的影响。结果:Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的UBE2C蛋白表达水平明显高于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。MTT法检测结果显示转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的增殖速度明显快于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。结论:成功建立稳定过表达UBE2C的293T细胞株,过表达UBE2C可促进293T细胞的增殖。     

阳离子脂质体介导IL-15基因治疗小鼠肺转移模型的实验研究

目的:用阳离子脂质体(CL)包裹pcDNA3.1-IL15制备阳离子脂质体质粒DNA复合物CL-IL15,观察其抗小鼠B16-F10肺转移瘤的治疗作用,并初步探讨其作用机制。方法:构建hIL-15真核表达载体,测定脂质体-质粒DNA复合物的最佳包封率;将该复合物转染CHO-K1细胞株,West-ern blott检测体外转染条件下IL-15蛋白的表达情况,MTT法检测细胞转染上清对CTLL-2细胞株的增殖刺激作用;建立B16-F10小鼠黑色素瘤肺转移模型,尾静脉给药,每隔1 d给药1次,共6次,治疗结束24 h后观察各组肿瘤肺转移情况;LDH释放法(乳酸脱氢酶释放法)检测脾淋巴细胞的杀伤作用,冰冻切片免疫荧光法观察NK细胞对肿瘤组织的浸润。结果:成功构建hIL-15表达载体,并验证其与阳离子脂质体的质量比为1∶5时,包裹后形成的复合物具有较好的包封率;可以在体外有效转染并表达具生物活性的分泌型IL-15蛋白;CL-IL15复合物治疗小鼠肿瘤肺转移模型,可以显著减少肿瘤肺转移结节数目,提高脾细胞对肿瘤细胞杀伤活性(P<0.05),增加NK细胞在肿瘤组织中的浸润比例。结论:阳离子脂质体质粒DNA复合物CL-IL15可有效地抑制小鼠B16-F10肺转移瘤,其作用机制可能与IL-15诱导脾细胞对肿瘤细胞的杀伤、激活NK(natural killer)细胞对肿瘤组织的浸润等机制有关。     

丙型肝炎病毒核心蛋白转染HepG2细胞对其p53表达的影响

目的 研究丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV—core protein，HCV—C）对HepG2细胞周期、细胞凋亡和n53蛋白表达的影响。方法 表达HCV—C的真核表达质粒pcDNA3.1-core，通过Lipofectamine基因转染法转染HepG2细胞，经G418筛选获得稳定转染HepG2细胞，经Westem Blot证实HCV核心蛋白阳性表达。利用四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法，平板克隆实验和流式细胞术，蛋白印迹和免疫细胞化学法检测HCV核心蛋白对细胞生长增殖率、细胞周期、细胞凋亡率和p53蛋白表达的影响。结果 HCV—C转染组细胞增殖率显著高于空白质粒转染组和未转染组；HCV—C转染组细胞S期所占百分率高于未转染组；HCV-C转染组细胞凋亡率显著低于未转染组；HCV—C转染组细胞突变型p53蛋白的表达高于空白质粒转染组和未转染组。结论 HCV核心蛋白可能通过促进突变型p53蛋白的表达，促进HepG2从G0／1期进入S期，促进细胞生长增殖，抑制细胞凋亡。     

稳定表达组织型纤溶酶原激活因子基因的人脐静脉内皮细胞株的建立

为建立稳定表达组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)基因的人脐静脉内皮细胞株,为其在基因修饰的组织工程血管中的应用奠定基础。首先构建t-PA基因的真核表达载体pcDNA3.1-Myc-HisB(-)/t-PA,将该表达载体用阳离子脂质体介导,转染人脐静脉内皮细胞系细胞,经G418筛选,获得阳性细胞克隆,扩增后分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹(Western-blotting)检测t-PA转录和蛋白表达水平,用底物发色法检测t-PA的活性。逆转录聚合酶链反应检测出了t-PA的稳定转染细胞克隆,免疫印迹证实该克隆细胞有含Myc标签的t-PA蛋白表达,底物发色法检测发现其表达产物的活性增加。结果证明成功建立了稳定表达t-PA基因的人脐静脉内皮细胞株。     

雌激素受体2对前列腺癌细胞系PC-3M增殖的影响

目的： 构建带有人雌激素受体2（ESR2）全长cDNA的重组质粒pcDNA3.1-hERβ,转染人前列腺癌PC-3M细胞株,观察ESR2对细胞增殖能力的影响。 方法：RT-PCR方法从人正常卵巢组织中获取ESR2全长cDNA,利用基因重组技术与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hERβ;瞬时转染前列腺癌PC-3M细胞株,应用细胞计数、MTT法及流式细胞术检测细胞增殖能力的改变;半定量RT-PCR法及Western blotting法分别检测增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1 mRNA及蛋白表达。 结果：DNA测序结果显示扩增的ESR2序列与GenBank（NM_001437）所公布的序列完全一致。重组质粒pcDNA3.1-hERβ瞬时转染人PC-3M细胞48 h后,与质粒对照组相比：RT-PCR法及Western blotting法显示,ESR2基因在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显增加;细胞计数及MTT结果发现,细胞数目减少,细胞增殖活性下降（P<0.01）;流式细胞实验显示,G0/G1期细胞比例增加（P<0.05）,S期及G2/M期细胞比例减少（P<0.05）;RT-PCR及Western blotting结果还发现cyclinD1的表达减弱,而P21Cip1的表达增强。 结论：成功构建pcDNA3.1-hERβ重组质粒;带有ESR2全长基因的重组质粒转染PC-3M细胞后,细胞的增殖活性受到抑制;RSR2可能通过影响细胞增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1的表达抑制细胞的增殖。     

Bmi-1 基因过表达对人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1增殖的影响

目的: 探讨原癌基因B淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入区1( Bmi-1 )过表达对人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1增殖的影响。方法: 采用逆转录病毒介导转染方法将携带原癌基因 Bmi-1 的质粒或空质粒稳定转染GES-1细胞,通过real-time PCR及Western blotting在mRNA及蛋白水平鉴定转染效果。流式细胞术检测过表达 Bmi-1 对GES-1细胞周期的影响。应用CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒检测稳定转染 Bmi-1 对GES-1细胞增殖的影响。结果: Real-time PCR及Western blotting结果均表明成功建立稳定转染 Bmi-1 基因的GES-1细胞株。流式细胞术结果表明,过表达 Bmi-1 基因使GES-1细胞G₀/G₁期减少,G₂/M期和S期细胞增多。生长曲线显示,过表达 Bmi-1 基因使GES-1细胞增殖速度明显提高。结论: 过表达 Bmi-1 基因能调控GES-1细胞的细胞周期,促进GES-1细胞的增殖。     

可视化鼻咽癌细胞模型CNE2-EGFP的建立

目的利用pEGFP-N1质粒转染鼻咽癌细胞株,建立稳定表达绿色荧光蛋白的鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP．为整体鼻咽癌可视化研究提供良好的试验材料。方法利用脂质体转染法,将pEGFP—N1质粒转染鼻咽癌细胞株．通过G418抗性筛选、亚克隆扩增获得GFP稳定表达的人鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP。结果成功获得多个稳定表达GFP的人鼻咽癌细胞CNE2-EGFP细胞株,比较CNE2和CNE2-EGFP发现,两者生长曲线、细胞周期分布、裸鼠成瘤能力等均无显著性差异。结论建立了非G418依赖、稳定表达GFP且保持母株细胞特性的人鼻咽癌细胞株CNE2-EGFP,为鼻咽癌整体可视化研究打下了坚实的基础。