细胞外信号调节激酶蛋白参与雷帕霉素诱导的肺癌95D细胞凋亡的机制研究

目的观察雷帕霉素(Rapa)及联合多西紫杉醇(DTX)对肺癌95D细胞系凋亡的作用,并进一步探讨其对细胞外信号调节激酶蛋白(ERK1/2)表达的影响。方法流式细胞仪方法检测单独应用雷帕霉素和多西紫杉醇及两药联合应用对95D细胞凋亡的影响,Western Blot方法检测ERK1/2蛋白及p-ERK1/2蛋白的表达。结果雷帕霉素和多西紫杉醇单独处理组均能促进肺癌细胞的凋亡,且随着浓度的增加其促凋亡作用明显增加;联合应用雷帕霉素和多西紫杉醇促凋亡作用更强,并能显著降低p-ERK1/2蛋白的表达。结论雷帕霉素联合多西紫杉能进一步促进肺癌95D细胞凋亡,ERK1/2信号通路参与其诱导的肺癌95D细胞的凋亡过程。     

雷帕霉素对肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨雷帕霉素对肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响。方法 体外培养肾小管上皮细胞(HK-2细胞),选择100, 200, 400, 800 ng/ml雷帕霉素作用于HK-2细胞24、48、72h。利用 MTT实验分析雷帕霉素对HK-2细胞增殖的影响,并计算各浓度及不同时间的增殖抑制率优化雷帕霉素作用的浓度和时间;选择最佳的作用浓度和作用时间处理HK-2细胞,通过流式细胞分析技术,分析雷帕霉素对HK-2细胞的凋亡的影响。结果 MTT实验显示不同浓度的雷帕霉素,对增殖有抑制作用,且表现浓度依赖性和时间依赖性;RAPA可以促进HK-2细胞的凋亡。结论 通过HK-2细胞模型研究,发现雷帕霉素可抑制肾小管上皮细胞增殖、促进细胞凋亡。     

雷帕霉素联合顺铂对卵巢癌细胞株SKOV3凋亡和自噬的影响

目的研究雷帕霉素联合顺铂对卵巢癌细胞株SKOV3细胞凋亡和自噬的影响,并探讨可能的分子机制。方法雷帕霉素及顺铂分别单独或联合作用于卵巢癌细胞株SKOV3细胞后,流式细胞仪检测凋亡率,实时荧光定量PCR检测各处理组的mTOR mRNA表达,Western blot检测自噬蛋白Beclin1、LC3和抗凋亡蛋白bcl-2的表达。结果雷帕霉素联合顺铂组凋亡率为(12.520±1.499)%,较其他处理组凋亡率提高(P<0.05);雷帕霉素联合顺铂组的mTORmRNA表达为0.339±0.015,较对照组明显降低(P<0.05);雷帕霉素联合顺铂组的自噬蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ表达均增强(P<0.05),抗凋亡蛋白bcl-2明显降低(P<0.05)。结论雷帕霉素通过特异性阻滞mTOR的表达,可以促进顺铂诱导的卵巢癌SKOV3细胞凋亡,增强卵巢癌SKOV3细胞自噬性死亡。     

雷帕霉素增加耐药胃癌细胞对多柔比星的敏感性

目的探讨雷帕霉素对耐药胃癌细胞对多柔比星敏感性的影响。方法用含低浓度（0.5μmol/L）多柔比星培养基培养并建立耐药胃癌细胞株MKN45-R和SNU1-R,以不同浓度的多柔比星处理胃癌细胞48h后,用CCK-8试剂盒测得细胞活力,计算半数抑制浓度(IC₅₀)。采用10μmol/L雷帕霉素预处理耐多柔比星胃癌细胞后再次测定IC₅₀。结果多柔比星对胃癌细胞株MKN45和SNU1的生长有剂量依赖性抑制作用,IC₅₀分别为（57.2±4.0）μmol/L和（49.9±4.7）μmol/L,耐药细胞株MKN45-R和SNU1-R的多柔比星IC₅₀显著增大,分别为（153.7±6.7）μmol/L和（172.8±13.1）μmol/L。低浓度雷帕霉素可增加耐药细胞MKN45-R和SNU1-R对多柔比星的敏感性,IC₅₀显著减小为（69.9±2.3）μmol/L和（50.0±1.7）μmol/L。结论雷帕霉素可增加耐药胃癌细胞对多柔比星的敏感性。     

雷帕霉素洗脱支架损伤血管内皮的作用机制探讨

目的探讨雷帕霉素洗脱支架损伤血管内皮的作用机制。方法（1）对兔行局部肌肉注射雷帕霉素（雷帕霉素组）,模拟雷帕霉素洗脱支架安全性评价中的肌肉植入,同时设正常对照组和丙酮对照组。观察各组形态变化及测定匀浆液钙含量。（2）采用雷帕霉素0.1、1、10 及100 μg/L 处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）48 h 及1 μg/L 雷帕霉素处理HUVEC 6、12、24 及48 h,采用MTT 法检测细胞存活率,分析细胞存活率与药物浓度及处理时间的关系。（3）HUVEC 分设正常对照组、1 μg/L 雷帕霉素组。48 h 后HE 染色观察细胞形态变化,用NO 检测试剂盒测定细胞培养液NO 含量,采用Fluo-3/AM 荧光探针标记细胞内Ca2+。结果（1）雷帕霉素组出现支架植入类似的蓝染表现,雷帕霉素组较正常对照组和丙酮对照组钙含量升高（P < 0.05）。（2）雷帕霉素处理HUVEC 后,细胞存活率随浓度增加和时间延长均呈逐渐降低趋势（P < 0.01）。（3）雷帕霉素组细胞胞浆出现空泡、核固缩及核碎裂,与正常对照组比较,细胞培养液NO 含量降低,细胞内游离Ca2+含量增高（P < 0.05）。结论雷帕霉素洗脱支架中抗增殖药雷帕霉素对血管内皮有损伤作用,其机制可能与引起细胞内钙升高有关。     

雷帕霉素对宫颈癌患者HeLa细胞侵袭转移抑制作用的实验

目的:研究雷帕霉素对宫颈癌患者HeLa细胞侵袭转移抑制作用。方法:取宫颈癌患者HeLa细胞标本进行实验,空白组不加雷帕霉素,雷帕霉素组加入雷帕霉素30 nmol/L,分别培养48 h后,采用MTT法检测细胞活力(计算细胞生长抑制率)、Transwell法检测细胞迁移侵袭能力,以及采用Western blot法检测蛋白激酶B(Akt)和兔抗雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化水平以及兔抗基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、兔抗基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、波形蛋白(Vimentin)与钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平。结果:雷帕霉素组患者宫颈癌HeLa细胞生长抑制率、E-cadherin表达率明显多于对照组(P<0.05),且宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭数量、Akt与mTOR磷酸化水平、MMP-2、MMP-9与Vimentin表达明显少于对照组(P<0.05)。结论:雷帕霉素能抑制宫颈癌HeLa细胞的侵袭转移,主要是通过Akt/mTOR信号通路发挥作用。     

雷帕霉素联合紫杉醇诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3凋亡及其分子机制

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在恶性肿瘤发生发展中起重要作用。本研究观察特异性mTOR抑制剂雷帕霉素联合紫杉醇对卵巢癌细胞A2780和SKOV3的作用及内在的分子机制。方法：A2780和SKOV3细胞经雷帕霉素和紫杉醇处理后，以MTT法检测细胞的增殖情况，金正均法计算q值判断两药的相关作用。以流式细胞仪检测细胞凋亡，逆转录聚合酶链反应检测survivin的表达。结果：雷帕霉素联合紫杉醇可抑制A2780和SKOV3细胞的增殖，且随时间延长抑制作用越显著，[第一段]     

青蒿琥酯及其联合2-脱氧-D-葡萄糖对非小细胞肺癌A549细胞的抑制作用

目的 探讨青蒿琥酯(Art)及其联合2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞的抑制作用及可能机制。方法 CCK-8法检测不同浓度Art (20、40、60和80μmol/L)对A549细胞活力的影响,线粒体荧光探针四甲基罗丹明甲酯(TMRM)染色、激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测Art 20、40、60μmol/L作用A549细胞的线粒体功能,ATP测定试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒分别检测空白对照组(无药物处理)、2-DG 10 mmol/L组、Art 40μmol/L组、Art 40μmol/L+2-DG 10 mmol/L组的相对ATP含量和细胞凋亡。结果 随着Art浓度的升高,其抑制A549细胞活力增强,TMRM染色荧光强度减弱,而细胞内MitoSOX染色荧光强度增强(P<0.05)。与空白对照组相比,2-DG 10 mmol/L组、Art 40μmol/L组和Art 40μmol/L+2-DG 10 mmol/L组相对ATP含量均降低,而凋亡细胞比例均升高(P<0.05),Art 40μmol/L+2-DG 10 mmol/L组相对AT...     

小剂量雷帕霉素治疗活动性类风湿关节炎临床疗效及重建调节性T细胞介导的免疫耐受的研究

目的研究小剂量雷帕霉素治疗活动性类风湿关节炎(RA)患者的临床疗效及安全性,观察其对调节性T细胞(Treg细胞)介导的免疫耐受的重建。方法选取活动性RA患者62例按2∶1随机分为雷帕霉素组42例和对照组20例,2组均给予改善病情抗风湿药(DMARDs)及/或小剂量激素,雷帕霉素组加用雷帕霉素0.5mg 1次/隔日,2组患者分别于0、3、6、12周进行临床和常规实验室指标评估,并在0、12周采用流式细胞术检测患者外周血以CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞、辅助性T细胞(CD4+IL-17+Th)17为主的CD4+T亚群细胞绝对计数及百分比,比较2组之间及治疗前后患者的临床及实验室指标,并记录不良反应。结果共55例患者完成研究,分为雷帕霉素组37例和对照组18例,经12周治疗后2组28个关节疾病活动脂数(DAS28)评分、肿胀关节数(SJC)、关节压痛数(TJC)、红细胞沉降率(ESR)均下降,差异有统计学意义(P<0.05);2组中仅雷帕霉素组的免疫抑制用量明显少于传统治疗组,且2组均无不可逆的不良反应出现;雷帕霉素组Treg细胞、Th17绝对计数显著高于对照组[12周2组Treg分别为(29±23)个/μl和(16±16)个/μl,P=0.042;Th17分别为(7.3±5.5)个/μl和(3.5±2.4)个/μl,P=0.011];雷帕霉素组Treg细胞、Th17细胞绝对计数治疗前后无明显差异,而对照组2种细胞绝对计数显著下降[Treg:0周(35±20)个/μl,12周(16±16)个/μl,P=0.016;Th17:0周(8.9±4.2)个/μl,12周(3.5±2.4)个/μl,P=0.028]。结论 DMARDs药物可能通过减少RA患者Treg细胞、Th17细胞数缓解病情,而加用小剂量雷帕霉素可以明显提高RA患者外周血中Treg细胞水平,提示雷帕霉素可能通过重建Treg细胞介导的免疫耐受缓解病情,为活动性RA的治疗提供新思路。     

迷迭香酸通过线粒体通路诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡的研究

目的研究迷迭香酸通过线粒体通路诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用。方法体外培养MG-63细胞,将10、20、30、40、50、60μmol/L迷迭香酸作用于MG-63细胞,MTT和CCK-8法检测迷迭香酸对细胞生长的影响;AO/EB染色法观察细胞凋亡;流式细胞仪检测对细胞凋亡和细胞周期的影响;Western blotting法检测Cyt-c、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平。结果 MTT和CCK-8结果显示迷迭香酸可浓度相关性地抑制MG-63细胞的生长;AO/BE染色可看到迷迭香酸组凋亡细胞明显增加;流式细胞仪检测结果显示迷迭香酸可浓度相关性地促进MG-63细胞凋亡,并将细胞周期阻滞在S期;Western blotting法结果显示与对照组比较,迷迭香酸20、40、60μmol/L组的Bax、Caspase-3和Cyt-c蛋白表达水平明显增加(P0.05、0.01);与对照组比较,迷迭香酸20、40、60μmol/L组的Bcl-2蛋白表达水平则明显降低(P0.05、0.01),且呈剂量相关性。结论迷迭香酸可显著促进人骨肉瘤MG-63细胞凋亡,其机制可能与调控线粒体凋亡通路有关。     

Rapamycin reverses TLR4 signaling-triggered tumor apoptosis resistance by disrupting Akt-mediated Bcl-xL upregulation

Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling in tumor cells can promote tumor escape and tumor progression, for which TLR4-triggered resistance of tumor cells to apoptosis has been proposed as one of the mechanisms. Rapamycin is an immunosuppressant agent widely used for treatment of transplantation rejection and autoimmune diseases, and recently used for cancer therapy. However, the underlying mechanisms responsible for antitumor effects of rapamycin remain to be fully elucidated. Here we report that rapamycin can reverse TLR4-triggered resistance of colon cancer cells to oxaloplatin- or doxorubicin-induced apoptosis by disrupting Akt and subsequent NF-kappaB activation, suppressing upregulation of anti-apoptotic protein Bcl-xL. Furthermore, Akt/NF-kappaB inhibitors also reverses the apoptosis resistance, accordingly, Akt constitutive activation rescues NF-kappaB activation and Bcl-xL expression in rapamycin-pretreated colon cancer cells, suggesting Akt disruption is critical to the process. Therefore, rapamycin may abrogate TLR4-triggered tumor apoptosis resistance by inhibiting Akt/NF-kappaB pathways and Bcl-xL expression, providing experimental evidence for the anti-tumor effect of rapamycin.     

Inhibition of Akt (ser473) phosphorylation and rapamycin-resistant cell growth by knockdown of mammalian target of rapamycin with small interfering RNA in vascular endothelial growth factor receptor-1-targeting vector

Previously we developed dicetyl phosphate-tetraethylenepentamine-based polycation liposomes (TEPA-PCL) for use in small interfering RNA (siRNA) therapy. In the present study, mammalian target of rapamycin (mTOR) expression in cancer cells was silenced with mTOR-siRNA (simTOR) formulated in TEPA-PCL modified with Ala-Pro-Arg-Pro-Gly (APRPG), a peptide having affinity for vascular endothelial growth factor receptor-1 (VEGFR-1). We investigated the effects of inhibition of mTOR, focusing on the differences between cells treated with simTOR and those with rapamycin in terms of Akt (ser473) phosphorylation and antiproliferative effects. Rapamycin treatment is known to induce Akt (ser473) phosphorylation which attenuates the antiproliferative effects of rapamycin. As a result, knockdown of mTOR did not alter or only slightly reduced Akt (ser473) phosphorylation in phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10 (PTEN)-null (LNCaP and MDA-MB-468 cells) and PTEN-positive (DU 145 and MDA-MB-231) cells, although rapamycin induced Akt (ser473) phosphorylation of these cells. Rapamycin suppressed the growth of PTEN-null cells, in which the rapamycin-sensitive mTOR complex 1 (mTORC1) is excessively activated. On the other hand, rapamycin did not suppress the growth of PTEN-positive cells possibly through a negative feedback mechanism via the rapamycin-insensitive mTOR complex 2 (mTORC2) signaling pathway. In contrast, simTOR significantly suppressed the growth of cancer cells regardless of the presence of PTEN, possibly through inhibition of both mTORC1 and mTORC2. These results indicate that mTOR knockdown using APRPG-TEPA-PCL/simTOR is likely to be an effective strategy for cancer siRNA therapy.     

茶黄素双没食子酸酯对肺癌A549细胞生长及VEGF基因表达的影响

目的观察茶黄素双没食子酸酯(TFDG)对肺癌A549细胞株生长的抑制、促凋亡效应及对血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的影响。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测TFDG对肺癌A549细胞生长的抑制作用,通过流式细胞术检测TFDG对肺癌A549细胞凋亡的影响,RT-PCR法检测A549细胞VEGF mRNA的表达。实验数据用x±s表示,采用单样本方差分析进行统计分析。结果 TFDG显著抑制A549肺癌细胞生长,具有时间依赖性和浓度依赖性;同时TFDG使A549细胞出现凋亡,凋亡率17.8%(P<0.05);TFDG可降低A549细胞VEGF mRNA表达,且呈浓度依赖性(P<0.05)。结论 TFDG能抑制A549细胞生长,促进其凋亡,抑制VEGFmRNA的表达。     

葫芦素B通过激活线粒体途径诱导人肺癌NCI-H460细胞凋亡

目的探讨葫芦素B对人肺癌NCI-H460细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其机制。方法体外培养NCI-H460细胞,MTT法观察葫芦素B对细胞增殖的影响,倒置相差显微镜观察细胞形态的变化,采用流式细胞术检测细胞凋亡率。采用罗丹明123(Rhodamine 123)染色,通过流式细胞仪检测线粒体膜电位(△ψm),采用Western blot方法检测线粒体内和胞浆内的细胞色素C。结果葫芦素B对NCI-H460细胞的增殖有抑制作用,且呈剂量、时间依赖性;葫芦素B处理组细胞形态发生显著改变,细胞皱缩、变圆,可见胞核染色质浓缩;流式细胞仪检测结果显示葫芦素B诱导NCI-H460细胞凋亡,呈剂量依赖性。葫芦素B处理后线粒体膜电位显著下降,细胞色素C由线粒体释放到胞浆中。结论葫芦素B可以抑制人肺癌NCI-H460细胞的增殖并诱导细胞凋亡,线粒体途径参与葫芦素B诱导的NCI-H460细胞凋亡。     

Anti-tumor effect of honokiol alone and in combination with other anti-cancer agents in breast cancer

Honokiol, an active component isolated and purified from Chinese traditional herb magnolia, was demonstrated to inhibit growth and induce apoptosis of different cancer cell lines such as human leukaemia, colon, and lung cancer cell lines; to attenuate the angiogenic activities of human endothelial cells in vitro; and to efficiently suppress the growth of angiosarcoma in nude mice. In this study, we have demonstrated that treatment of different human breast cancer cell lines with honokiol resulted in a time- and concentration-dependent growth inhibition in both estrogen receptor-positive and -negative breast cancer cell lines, as well as in drug-resistant breast cancer cell lines such as adriamycin-resistant and tamoxifen-resistant cell lines. The inhibition of growth was associated with a G1-phase cell cycle arrest and induction of caspase-dependent apoptosis. The effects of honokiol might be reversely related to the expression level of human epidermal growth receptor 2, (HER-2, also known as erbB2, c-erbB2) since knockdown of her-2 expression by siRNA significantly enhanced the sensitivity of the her-2 over-expressed BT-474 cells to the honokiol-induced apoptosis. Furthermore, inhibition of HER-2 signalling by specific human epidermal growth receptor 1/HER-2 (EGFR/HER-2) kinase inhibitor lapatinib synergistically enhanced the anti-cancer effects of honokiol in her-2 over-expressed breast cancer cells. Finally, we showed that honokiol was able to attenuate the PI3K/Akt/mTOR (Phosphoinositide 3-kinases/Akt/mammalian target of rapamycin) signalling by down-regulation of Akt phosphorylation and upregulation of PTEN (Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome Ten) expression. Combination of honokiol with the mTOR inhibitor rapamycin presented synergistic effects on induction of apoptosis of breast cancer cells. In conclusion, honokiol, either alone or in combination with other therapeutics, could serve as a new, promising approach for breast cancer treatment.     

雷帕霉素抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞增生

目的研究阻断PI3K-p70S6K和Ras-p42／p44MAPK信号通路对血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)诱导的脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及细胞周期进程的影响。方法ANGⅡ联合不同浓度雷帕霉素刺激体外培养的HUVEC,3H-胸腺嘧啶核苷掺入法和3H-亮氨酸掺入法测定细胞DNA和蛋白质合成,流式细胞术检测细胞周期变化,免疫印迹(Western blot)检测细胞信号蛋白p70S6K (p70 ribosomal protein S6 kinase),ERK2(extracellular signal regulated kinase)及细胞周期蛋白CyclinD1、CyclinA、和CyclinBt表达的变化。结果雷帕霉素抑制ANGⅡ诱导的血管内皮细胞蛋白质和DNA的合成,并呈剂量依赖性,雷帕霉素抑制ANGⅡ诱导的p70S6K和CyclinD1的表达,阻滞细胞于G1期(P<0．01),而不影响ERK2、CyclinA和CyclinBt的表达。结论PI3K-p70S6K信号通路在ANGⅡ诱导的HUVEC增殖及细胞周期进程中起关键作用,雷帕霉素免疫抑制靶点p70S6K可应用于干预血管内皮细胞的增殖。     

双氢青蒿素诱导肺癌细胞凋亡的实验研究

双氢青蒿素是半合成的青蒿素衍生物,近年来研究表明青蒿素类药物具有明显抑制肿瘤生长的作用。目的:探讨双氢青蒿素对肺癌细胞生长抑制作用及其机制。方法:以体外培养的SPC-A-1细胞株为研究对象,采用MTT法测定二氢青蒿素对SPC-A-1细胞的增殖影响,采用TUNNEL染色、DNAladder及流式细胞术检测双氢青蒿素诱导SPC-A-1细胞凋亡。结果:DHA对SPC-A-1细胞的抑制增值作用呈浓度依赖性和时间依赖性特点,双氢青蒿素抑制SPC-A-1细胞增殖作用主要由于其诱导肺癌细胞凋亡所致。