单纯疱疹病毒Ⅱ型gD模拟抗原表位的筛选及分析

目的:用抗-HSV-2gD单克隆抗体(mAb)从噬菌体随机12肽库中筛选HSV-2gD抗原模拟表位序列.方法:利用HSV-2gD McAb淘筛噬菌体随机12肽库,经四轮富集筛选,随机挑取阳性克隆扩增后进行ELISA鉴定,同时提取其基因组DNA进行序列测定,并利用生物信息学软件对包膜糖蛋白D(gD)进行B细胞抗原表位分析.结果:经四轮生物淘筛后,特异性噬菌体克隆得到了富集.经过对阳性克隆携带的随机12肽序列进行综合生物信息学分析,得到了PYH-H和P-PLW两个模拟HSV-2gD抗原表位的主要氨基酸基序.结论:用噬菌体随机12肽库成功筛选到了两个模拟HSV-2gD抗原表位的主要氨基酸基序,可模拟McAb针对的抗原表位,可能是HSV的替代抗原.该研究方法为研制更有效及更广谱的HSV基因疫苗提供了依据.     

应用噬菌体肽库筛选胃癌相关抗原模拟表位

目的 利用噬菌体递呈随机肽库筛选技术,进行胃癌相关抗原ＭＧ７Ａｇ模拟表位的研究,方法 应用离子交换层析法从小鼠腹水中纯化抗胃癌单克隆抗体ＭＧ７Ａｂ,细胞ＥＬＩＳＡ方法检测其活性,以ＭＧ７ｍＡｂ作为筛选分子,生物淘洗噬菌体递呈随机７肽库,经３次淘洗后将筛选所得的噬菌体克隆进行ＤＮＡ测序,递呈随机７肽氨基酸序列同源性分析,结果 对阳性噬菌体进行递呈肽氨基酸序理分析,获得一侯选模拟表位（ＫＰＨＸＨＸ     

鼠伤寒脂多糖表位模拟位的筛选

目的 获得模拟脂多糖抗原表位的噬菌体环状展示肽。方法 用抗鼠伤寒菌脂多糖单克隆抗体2F4为靶分子，亲和筛选噬菌体随机环七肽库，双夹心ELISA及特异性抗原抑制试验鉴定阳性克隆。结果 经三轮筛选，随机挑选38个克隆，其中34个克隆显示与2F4结合。鼠伤寒沙门氏菌脂多糖可抑制噬菌体克隆与2F4结合，所有克隆的半数抑制浓度为(0．125-0.250)μg／ml。挑选10个克隆测序并推导氨基酸序列，其中7个克隆出现P-X-WAS-X-W保守序列；10个序列中非极性氨基酸含量平均值为71．4％。结论噬菌体展示环七肽可模拟鼠伤寒沙门氏菌脂多糖抗原表位。     

用噬菌体随机12肽库筛选单纯疱疹病毒2型gD基因模拟抗原表位的研究

目的用针对HSV-2gD的单克隆抗体（McAb）从噬菌体展示随机12肽库中筛选HSV-2gD基因的抗原模拟表位，寻找更有效的小片段短肽作为HSV新型基因工程疫苗的候选抗原。方法利用HSV gD McAb淘筛噬菌体随机12肽库，经“吸附-洗脱-扩增”的4轮筛选，随机挑取噬菌体克隆经酶联免疫吸附实验（ELISA）进行鉴定，并对阳性克隆所携带的外源DNA片段进行序列测定和计算机辅助分析。结果经4轮生物淘筛后特异性噬菌体克隆得到了富集，对阳性克隆的分析结果表明P-PLW和PYH--H氨基酸序列是模拟妒基因抗原表住的骨架结构，携有此短肽的噬菌体可以与McAb特异结合。结论从噬菌体随机12肽库中筛选到的外源序列可以模拟HSV-2 gD McAb针对的抗原表位，可能是HSV-2gD一个抗原表住的替代抗原，为进一步研究HSV-2基因疫苗奠定了基础。     

噬菌体展示技术筛选表皮生长因子受体抗原模拟表位

目的 利用噬菌体12肽库进行生物淘洗,筛选表皮生长因子受体(EGFR)抗原模拟表位。方法 以抗EGFR的单克隆抗体药物西妥昔单抗及尼妥珠单抗为靶分子,在噬菌体12肽库中淘选表皮生长因子受体抗原模拟表位,经过3轮淘选后,选择可与西妥昔单抗及尼妥珠单抗有不同程度结合的噬菌体,对阳性产物进行克隆及测序。结果 发现17个和21个阳性噬菌体分别与西妥昔单抗及尼妥珠单抗不同程度地结合;阳性克隆测序结果分别获得了3种不同的氨基酸序列。结论 初步利用西妥昔单抗及尼妥珠单抗可从噬菌体展示的随机肽库中筛选到表皮生长因子受体相关抗原表位。     

O1群小川型霍乱弧菌单克隆抗体识别表位模拟肽的筛选鉴定

【摘　要】目的：以纯化的有高度特异性的IXiao3G6单抗为靶分子,对噬菌体随机7肽库进行淘筛,以期筛选到与O1群小川型霍乱弧菌单抗有高亲和力的模拟肽,为基于表位的霍乱弧菌模拟多肽疫苗的研制奠定基础。方法：运用噬菌体随机7肽库技术,以纯化的IXiao3G6单抗为靶蛋白,进行噬菌体随机肽库 3 轮筛选,以双抗夹心ELISA和竞争抑制实验分析获得的噬菌体短肽与筛选配基的结合能力及特异性,并进行阳性克隆序列测定和同源性分析。结果：3轮筛选后,阳性噬菌体得到有效富集,夹心ELISA检测随机挑取的25个噬菌体克隆,有22个噬菌体克隆为阳性,测序表明其中20个阳性克隆的氨基酸序列完全一致,均为APAIPAS。对该序列同源性分析,未发现有相同的已知序列。竞争抑制实验表明,O1群小川型霍乱弧菌脂多糖（lipopo-lysaccharide,LPS）能很好地抑制阳性克隆与IXiao3G6 McAb的结合,抑制程度随LPS浓度的升高而增加,而对照细菌的LPS则不具有相应的抑制作用,进一步提示噬菌体克隆展示肽模拟了O1群小川型霍乱弧菌LPS抗原表位。结论：筛选到模拟O1群小川型霍乱弧菌LPS的抗原表位的模拟肽,为基于表位的霍乱弧菌模拟多肽疫苗的开发与设计提供了实验依据。     

从噬菌体随机肽库中筛选SARS病毒N蛋白表位模拟肽的研究

目的获得具有生物学活性的SARSN蛋白的模拟肽。方法以抗SARS病毒N蛋白的单克隆抗体作为固相筛选分子,免疫筛选噬菌体随机十二肽库,并采用夹心ELISA、竞争抑制试验鉴定阳性克隆。结果经噬菌体富集后,从随机筛选的各46个克隆中得到N蛋白的2个不同表位,即由ELISA鉴定出单克隆抗体C00835个阳性克隆,确定氨基酸序列GXLXTPXXXXGT为SARSN蛋白的一个表位;单克隆抗体C03941个阳性克隆,确定氨基酸序列TTLPXXXXAXXX为SARS病毒N蛋白的另一个表位。结论用噬菌体随机12肽库成功筛选得到SARSN蛋白的2个不同模拟表位,为用SARS表位去探索其病毒的结构及疫苗的研制创造了条件。     

应用噬菌体随机肽库筛选2型登革病毒E蛋白的抗原表位

【目的】通过型特异性单抗与噬菌体随机 12肽库的生物淘洗 ,确定 2型登革病毒E蛋白分子的抗原表位。【方法】以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子 ,生物淘洗噬菌体随机 12肽库 ,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导 ,通过展示肽序列与DEN2E蛋白的氨基酸一级结构的对比 ,确定E蛋白的抗原优势表位并用相应的合成肽验证。【结果】常规生物淘洗获得富含芳香族氨基酸并有aHWbW核心结构的克隆 ,确定为非特异的塑料结合噬菌体。改进淘洗方法后 ,肽库筛选的噬菌体阳性克隆有共同的结构模体WFKKGS ,与DEN2E蛋白分子的 390～ 397有 3～ 5个氨基酸相同。其对应的合成 10肽能与淘洗单抗特异反应 ,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合。【结论】本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定DEN2E蛋白 390～ 397氨基酸残基 (WFKKGSSI)存在一线性的B细胞抗原表位。     

鼠伤寒脂多糖表位模拟位的筛选

目的获得模拟脂多糖抗原表位的噬菌体环状展示肽。方法用抗鼠伤寒菌脂多糖单克隆抗体2F4为靶分子,亲和筛选噬菌体随机环七肽库,双夹心ELISA及特异性抗原抑制试验鉴定阳性克隆。结果经三轮筛选,随机挑选38个克隆,其中34个克隆显示与2F4结合。鼠伤寒沙门氏菌脂多糖可抑制噬菌体克隆与2F4结合,所有克隆的半数抑制浓度为(0.125~0.250)μg/ml。挑选10个克隆测序并推导氨基酸序列,其中7个克隆出现P-X-WAS-X-W保守序列;10个序列中非极性氨基酸含量平均值为71.4%。结论噬菌体展示环七肽可模拟鼠伤寒沙门氏菌脂多糖抗原表位。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2抗原模拟表位的筛选和鉴定

目的：筛选丙肝病毒（HCV）包膜蛋白（E2）特异性噬菌体模拟表位。方法：以抗－HCV E2的单克隆抗体作为固相筛选分子，对噬菌体同七肽库进行5轮“吸附－洗脱－扩增“的筛选过程，随机挑取50个克隆，经酶联免疫吸附法（ELISA）鉴定、交叉反应以及竞争抑制性实验，最后对所选克隆进行DNA序列分析，以确定HCV E2抗原的模拟表位。结果：经噬菌体富集后，得到12个阳性克隆，确定氨基酸序列XXPXYXW为HCV E2的模拟表位。结论：用噬菌体七肽库成功筛选得到HCV E2的模拟表位，为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件。     

应用噬菌体随机十二肽库筛选hFGF 7相关模拟肽

目的应用噬菌体随机十二肽库生物淘选具有刺激表皮细胞增殖作用的人成纤维细胞生长因子 7(hFGF 7)噬菌体模拟肽。方法以hFGF 7单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选噬菌体随机十二肽库;随机挑取单克隆噬菌体,应用ELISA方法检测单克隆噬菌体的结合力,对结合力较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,进行测序,并行序列分析。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,ELISA检测结果显示获得的一些噬菌体模拟肽具有较好的结合力,测序获得11个与促进细胞分裂、增殖或抑制细胞增殖有关的碱基序列。结论从噬菌体随机十二肽库中可淘选到与hFGF 7相关的噬菌体模拟肽,其中部分噬菌体模拟肽可能会促进表皮细胞增殖,期望将来可应用于促进创面愈合。     

胃癌单克隆抗体MG7的噬菌体呈现型抗独特型单链抗体ScFv的制备

目的 获得胃癌单克隆抗体（简称单抗）MG7的噬菌体呈现型抗独特型单链抗体ScFv（抗－Id ScFv），为研制MG7的抗－Id ScFv重组胃癌瘤苗奠定基础。方法 以MG7单抗与匙孔血蓝蛋白（KLH）的交联物免疫Balb/c小鼠，取脾分离mRNA。以逆转录聚合酶链反应技术分别扩增抗体重、轻链可变区基因（VH和VL），经linkerDNA连接ScFv基因片段。将ScFv DNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1。在辅助噬菌体M13K07的作用下，获得重组噬菌体抗体ScFv。以单抗MG7对重组噬菌体抗ScFv进行四轮筛选后，随机挑取克隆，经噬菌体ELISA筛选抗－IdScFv单克隆，并对其所属抗－Id类型进行初步鉴定。结果 VH、VL和ScFvDNA分析约为340、320和750bp。经富集后，在随机筛检的60个克隆中得到24个噬菌体呈现型抗－IdScFv单克隆，阳性率为40％。在24个克隆中，有5个为β或γ型抗－IdScFv。结论 用噬菌体抗体技术能够成功地获得单抗MG7的抗－IdScFv，为开展用抗－IdScFv防治胃癌的研究创造了条件。     

PRODUCTION OF PHAGE-DISPLAYED ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODY SINGLE CHAIN VARIABLE FRAGMENTS TO MG7 MONOCLONAL ANTIBODY DIRECTED AGAINST GASTRIC CARCINOMA

Objective.To generate phage-displayed anti-idiotypic single chain variable fragments(anti-Id ScFv) to MG7 monoclonal antibody(McAb) directed against gastric carcinoma so as to lay a foundation for developing anti-Id ScFv vaccine of the cancer.Methods.Balb/c mice were immunized i.p.with MG7 McAb conjugated with keyhole limpet hemocyain (KLH),and mRNA was isolated from the spleens of the immunized mice.Heavy and light chain (VH and VL) genes of antibody were amplified separately and assembled into ScFv genes with a linker DNA by PCR.The ScFv genes were ligated into the phagemid vector pCANTAB5E and the ligated sample was transformed into competent E.coli TG1.The transformants were infected with M13K07 helper phage to yield recombinant phages displaying ScFv on the tips of M13 phage.After 4 founds of panning with MG7,the MG7-positive clones were selected by ELISA from the enriched phages.The types of the anti-Id ScFv displayed on the selected phage clones were preliminarily identified by competition ELISA.Results.The VH,VL and ScFv DNAs were about 340 bp,320bp and 750 bp respectively.Twenty-four MG7-positive clones were selected from 60 enriched phage clones,among which 5 displayed β or γ type anti-Id ScFv.Conclusion.The anti-Id ScFv to MG7 McAb can be successfully selected by recombinant phage antibody technique,which paves a way for the study of prevention and cure of gastric carcainoma by using anti-Id ScFv.     

Keratinocyte growth factor (KGF) phage model peptides can promote epidermal cell proliferation without tumorigenic effect

Background KGF significantly influences epithelial wound healing. The aim of this study was to isolate KGF phage model peptides from a phage display 7-mer peptide library to evaluate their effect on promoting epidermal cell proliferation. Methods A phage display 7-mer peptide library was screened using monoclonal anti-human KGF antibody as the target. ELISA was performed to select monoclonal phages with good binding activity. DNA sequencing was done to find the similarities of model peptides. MTT assay, immunofluorescence assay and quantitative real-time PCR analysis were employed to evaluate the effect of the phage model peptides on epidermal cells. Results 56.9% (33/58) of the isolated monoclonal phages exhibited high binding activity by ELISA. Ten of fifteen obtained phage model peptides were similar to KGF or EGF. MTT assay data showed that four (No.1-4) of the ten phage model peptides could promote epidermal cell proliferation. The expression of keratinocyte growth factor receptor (KGFR) mRNA in the KGF control group and the two phage model peptide groups (No.1 and No.2) increased. Expression of c-Fos mRNA and c-Jun mRNA in the KGF control group increased, but did not increase in the four phage model peptide groups (No.1-4). Conclusions Four phage model peptides isolated from the phage display 7-mer peptide library can safely promote epidermal cell proliferation without tumorigenic effect.     

Keratinocyte growth factor phage model peptides can promote epidermal cell proliferation without tumorigenic effect

Background Keratinocyte growth factor （KGF） significantly influences epithelial wound healing. The aim of this study was to isolate KGF phage model peptides from a phage display 7-mer peptide library to evaluate their effect on promoting epidermal cell proliferation. Methods A phage display 7-mer peptide library was screened using monoclonal anti-human KGF antibody as the target. Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was performed to select monoclonal phages with good binding activity. DNA sequencing was done to find the similarities of model peptides. Three-（4,5-dimethylthiazol-2-yl） -2,5-diphenyl tetrazolium bromide （MTT） assay, immunofluorescence assay and quantitative real-time PCR analysis were employed to evaluate the effect of the phage model peptides on epidermal cells. Results Thirty-three out of fifty-eight （56.9%） of the isolated monoclonal phages exhibited high binding activity by ELISA. Ten of fifteen obtained phage model peptides were similar to KGF or epidermal growth factor （EGF）. MTT assay data showed that four （No. 1-4） of the ten phage model peptides could promote epidermal cell proliferation. The expression of keratinocyte growth factor receptor （KGFR） mRNA in the KGF control group and the two phage model peptide groups （No. 1 and No. 2） increased. Expression of c-Fos mRNA and c-Jun mRNA in the KGF control group increased, but did not increase in the four phage model peptide groups （No.1-4）. Conclusion Four phage model peptides isolated from the phage display 7-mer peptide library can safely promote epidermal cell proliferation without tumorigenic effect.     

递呈BAC5单抗识别位点的M13噬菌体克隆系的建立

【目的】获得可递呈抗低分化和未分化癌细胞单克隆抗体 (BAC5单抗 )抗原表位的M13 噬菌体克隆系。【方法】以BAC5单抗为靶抗体 ,对由M13 噬菌体构建的随机 12肽文库进行生物淘洗。用抗体竞争方法从阳性克隆中选出与BAC5单抗结合率较高的克隆系。通过ELISA方法检测BAC5单抗对上述克隆的选择性识别。【结果】经过 3轮淘洗 ,获得的阳性克隆率为77% (35 /4 5 )。来自C2、C17和C2 9号克隆的噬菌体对外加BAC5单抗的结合率分别为 71 6 %、49 4%和 6 4 0 % ,高于其它阳性克隆。BAC5单抗与来自上述 3个克隆的噬菌体呈阳性反应 ,与来自辅助型M13 株的噬菌体 (VCSM13 )和淘洗前的文库噬菌体(RPLM13 )呈阴性反应。【结论】来自C2、C17和C2 9号克隆的噬菌体有可能递呈与BAC5单克隆抗相关的抗原表位。     

亲环素A抗原表位氨基酸序列及三维结构研究

目的：研究人抗亲环素A（CyPA)McAb D4识别的抗原表位的氨基酸组成及其在蛋白分子上的三维定位。方法：以抗人亲环素A McAb D4作捕获抗体,对噬菌体展示肽库进行淘筛,并对筛选出的噬菌体中插入片段进行DNA序列测定和氨基到序列分析,再用RasMol蛋白质三维结构分析软件在亲环素A分子的三维结构中查找相应的抗原表位。结果：经过三轮淘筛和扩增,选择7个克隆进行序列,提示该抗原表位是构象性的。用RasMol蛋白质三维结构分析软件在亲环素A分子的三维结构中,找到由W121、S99、L98、Q111、S110、F112、L122构成的疏水代状结构,可能就是McAb D4的抗原表位。结论：人亲环素A分子上W121、S99、L98、Q111、S110、F112、L122构成一个构象型抗原表位。     

靶向趋化因子受体5短肽的筛选及活性初步分析

目的筛选人趋化因子受体5(CCR5)的亲和短肽。方法采用噬菌体十二肽库对稳定表达CCR5的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(CHO/CCR5)进行筛选,得到30个阳性克隆,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分析,发现其中17个克隆含有AFDWTFVPSLIL基序。结果含有该序列的噬菌体和合成肽AFDWTFVPSLIL能阻止单克隆抗体2D7与CHO/CCR5细胞的结合;并能竞争性地抑制RANTES对CHO/CCR5细胞的结合。结论小分子肽AFDWTFVPSLIL能特异性地结合CCR5,并有可能成为CCR5的拮抗剂。     

短肽库中血管内皮细胞生长因子受体Flt-1拮抗剂筛选条件的改进

目的:改进噬菌体肽库的筛选条件,提高筛选阳性率及阳性克隆重复性.使血管内皮细胞生长因子受体Flt-1拮抗剂的筛选更为有效.方法:通过对血管内皮细胞生长因子受体Flt-1的原核表达产物的变性复性处理,获得相对纯化的可溶性Flt-1受体.将该可溶性受体固相化,对噬菌体表达12肽库进行4 ～ 5轮Bio-panning后,挑取单个噬菌斑制备高滴度噬菌体上清.用ELISA法初步鉴定各噬菌体克隆与sFlt-1的特异性结合并测定阳性克隆的DN A 顺序.在Bio-panning过程中增加非特异性蛋白的预吸附,并减少输入噬菌体数量, 再次筛选短肽库.结果:经过第一次筛选,获得了一系列具有一定重复性与同源性的噬菌体克隆. 改进筛选条件后,筛选阳性率由2%提高到8.3%,阳性克隆的重复性也得到显著提高.该高重复阳性克隆的氨基酸顺序与前一次筛选获得的阳性克隆有较高同源性.结论:Bio-panning 条件的改进提高了筛选效率,为不纯蛋白筛选短肽库积累了经验,并为血管内皮细胞生长因子受体拮抗剂的研制奠定了基础.