HBV cccDNA荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:评估一个新设计的HBVcccDNA荧光定量PCR检测方法。方法:以肝穿组织为检测标本,采用LightcycleTM探针,通过一对特殊引物,使HBVcccDNA可以扩增而病毒基因组不能扩增;同时利用一种依赖于ATP的特异性DNase提高反应的特异性,以此实现对cccDNA的检测。结果:成功建立了HBVcccDNA荧光定量PCR的检测方法,线性范围为2.5×101～2.69×109拷贝/ml。对5个病例的肝穿样本进行分析,其中3例为乙肝感染患者,并均接受抗病毒治疗达1年,另2例为乙肝阴性患者。检测结果如下:1)2例乙肝阴性患者的肝组织检测结果cccDNA及tDNA皆为阴性。2)接受拉米夫定治疗1年的病人tDNA为7.10×103拷贝/ml,cccDNA为2.64×103拷贝/ml;接受恩替卡韦治疗1年的病人tDNA为1.00×105拷贝/ml,cc-cDNA为4.04×103拷贝/ml;第3例病人接受拉米夫定治疗前tDNA为6.62×103拷贝/ml,cccDNA为3.03×102拷贝/ml,拉米夫定治疗1年后tDNA为5.19×103拷贝/ml,cccDNA为1.51×102拷贝/ml。结论:本研究结果显示,所建立的HBVcccDNA荧光定量PCR方法具有良好的线性范围,灵敏度、特异性及准确性均达到预期目标,而且检测所需样本量少,只需约1mg肝穿组织。可作为临床监测抗病毒治疗效果的有效手段和开展HBV复制调控研究的重要工具。     

乙肝病毒携带孕妇血清和乳汁中HBV—DNA定量检测研究

目的探讨HBV携带孕妇血清HBV标志物与血清、乳汁中HBV—DNA含量之间的关系,评价母乳喂养的安全性。方法利用EUSA筛查乙肝五项至少一项阳性的孕妇血清HBV—M．将其分为HBeAg阳性组和HBeAg阴性组共180例。同时应用荧光定量PCR对其血清和乳汁中的HBV—DNA进行检测。结果HBeAg阳性组孕妇的血清和乳汁HBV—DNA阳性率为97．7％（88,90）和62．2％（74／90）,HBV—DNA平均载量的对数量为7．32±1．83和4．02±1．21。HBeAg阴性组孕妇的血清和乳汁HBV—DNA阳性率为55．5％（50／90）和13．3％（13／90）,HBV—DNA平均载量的对数量为5．62±0．93和3．32±0．51。孕妇血清中HBeAg阳性组其乳汁和血清中HBV—DNA阳性率及病毒载量与HBeAg阴性组差异有统计学意义（P〈0．05）。结论HBV携带孕妇的血清中HBV—DNA载量越高,其乳汁HBV—DNA含量越高;二者高度相关（r=0．932,P〈0．01）。血清HBV载量高的孕妇最好不要进行母乳喂养。     

实时荧光定量TaqMan-PCR检测小鼠多瘤病毒方法的建立

目的 建立一种快速、特异、敏感的小鼠多瘤病毒 (murine polyomavirus, MPyV)荧光定量 TaqMan PCR检测方法, 用于MPyV核酸的检测。 方法 根据GenBank中小鼠多瘤病毒基因组序列设计了一对特异性引物及TaqMan探针, 扩增长度为69 bp的片段, 通过优化反应体系和反应条件, 对构建的重组质粒标准品进行检测, 并绘制标准曲线, 进行特异性、敏感性和重复性试验。最后用建立的方法对人工感染MPyV的肺脏、脾脏和粪便, 及86 份小鼠临床样本进行检测, 验证在临床应用中的效果。 结果 所建立的检测方法特异性强, 只能在小鼠多瘤病毒DNA中检出荧光信号, 检测灵敏度达到100拷贝, 批内和批间重复性好, 检测结果变异系数(CV)均小于1.13%, 人工感染MPyV小鼠的肺脏、脾脏和粪便均为阳性, 对86份临床样本进行检测, 有3份样本呈阳性(阳性率为3.5%)。 结论 建立的MPyV荧光定量TaqMan-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好, 适合用于MPyV临床诊断、日常监测和流行病学调查。     

选择性聚合酶链反应检测 2.2.15 细胞内HBV cccDNA

0 引言1986年美国Sells等(The Mount Sinal Medical Center)将HB V基因转染到人肝癌细胞(HepG2)中,获得了能表达HBV标志的细胞株2.2.15细胞,并以此作为模型筛选抗HBV的药物,进行基因结构及功能的研究. 然而HBV在2.2.15细胞中复制方式与自然感染的肝细胞有何不同,有无HBV 的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)存在, 各学者说法不一[1.2],我们应用选择性PCR技术,检测了2.2.15细胞内的HBV cccD NA,现简报如下.     

定量PCR检测慢性HBV感染者血清HBV-DNA含量

目的 了解不同慢性乙型肝炎病毒感染者血清ＨＢＶ－ＤＮＡ含量并探讨其临床意义 。方法 应用荧光能量转移定量聚合酶链反应检测２４５例不同临床类型慢性ＨＢＶ感染者血清ＨＢＶ－ＤＮＡ含量。结果 ＨＢｅＡｇ阳性患者ＨＢＶ－ＤＮＡ含量显著高于ＨＢｅＡｇ阴性／抗－ＨＢｅ阳性患者的含量;     

HBV cccDNA检测临床应用研究进展

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(hepatitis Bvirus covalently closed circular DNA,HBVcccDNA)是嗜肝病毒复制过程中产生的一种重要复制中间体,在宿主细胞核内积聚,形成HBV cccDNA池,半衰期长,现有抗病毒药物不能清除,是宿主肝细胞持续     

TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

实时荧光定量PCR检测斑点热立克次体方法的建立

目的 建立斑点热群立克次体(SFGR)TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法 .方法 根据日本斑点热立克次体外膜蛋白A(ompA)基因序列设计特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的此检测方法和常规的巢式PCR方法同时对临床收集...     

不对称PCR杂交显色方法的建立及其对HBV DNA的检测

目的：建立一种灵敏、快速、特异的检测ＨＢＶ ＤＮＡ ＰＣＲ产物的杂交显色方法．方法：使用一个生物素标记的上游引物对ＨＢＶ ＤＮＡ进行不对称ＰＣＲ扩增,使扩增出的单链带有生物素,并可结合在固定有链亲合素的微孔板表面．用标有辣根过氧化物酶的探针与固定的单链ＰＣＲ产物杂交,而后加底物显色测定吸光值。结果：该方法比常规的琼脂糖凝胶电泳法更特异,而且灵敏度高１０倍￣１００倍,对简便处理的标本适应性强,具有良     

乙型肝炎患者外周血单个核细胞HBV cccDNA含量的检测及其临床意义

[目的]采用实时荧光定量PCR的方法检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞中HBV cccDNA 的含量,并探讨其临床意义.[方法] 应用实时荧光PCR(RT-PCR)方法对随机选取的乙型肝炎患者100例和1例追踪治疗的乙肝患者的血清HBV DNA 含量和外周血单个核细胞中HBV cccDNA 的含量进行检测;对已确诊的慢性乙肝患者40例,肝硬化患者30例外周血单个核细胞中HBV cccDNA 的含量进行检测.[结果] 100例乙型肝炎患者中,HBV DNA含量<5×102 copies/mL有57例,HBV cccDNA 的含量均<5×102 copies/mL;HBV DNA含量>5×102 copies/mL 有43例,HBV cccDNA 的含量>5×102 copies/mL 有22例;HBV DNA含量>1×103 copies/mL的患者有17例,在这些患者中HBV cccDNA 的含量>5×102 copies/mL者为13例,两者之间比例经χ2检验,差异无显著性意义,P>0.05;肝硬化患者HBV cccDNA 阳性率(>5×102 copies/mL)为67.7%,远远高于慢性乙肝患者的42.5%和随机乙肝人群的22.0%.各组间患者比例经χ2检验,差异有显著性意义,P<0.05.[结论] 乙型肝炎患者进行外周血单个核细胞中HBV cccDNA的检测,对于抗病毒治疗效果的监测和预后判断都重要的临床意义.     

外周血淋巴细胞中乙肝病毒cccDNA检测研究

目的做外周血淋巴细胞中乙肝病毒cccDNA检测研究,并探讨其临床意义。方法采用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞,用荧光定量PCR法检测外周血淋巴细胞中cccDNA含量。结果36例CAH患者中检出29例阳性(80.56%),61例CPH患者中检出32例阳性(52.46%),59例ASC标本中检出1例阳性(0.02%)。47例健康人标本检测结果均为阴性。CAH组、CPH组、携带者及阴性对照组之间互相存在统计学差异(P<0.05),携带者组和阴性对照组之间无统计学差异。对定量资料的统计学分析显示:CAH组检测的基因拷贝数较CPH组基因拷贝数明显增高,两者具有统计学差异(P<0.05)。结论(1)cccDNA在外周血淋巴细胞中的存在,对于慢性乙肝病毒持续感染状态的建立和维持,可能具有重要意义。(2)检测外周血淋巴细胞乙肝病毒cccDNA存在及其含量高低,可以作为评估临床抗乙肝病毒治疗有效性的一个参考指标。(3)该检测还可用于乙肝患者治疗中的复发及预后判断。     

环介导等温扩增(LAMP)试剂盒检测石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)

 目的  建立一种检测石蜡包埋的肝组织中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的新方法,并探讨其应用价值和临床意义。方法  提取30例慢性HBV感染患者的石蜡包埋肝组织中的DNA,采用质粒安全ATP依赖性DNA酶(plasmid-safe ATP-dependent DNase,PSAD)消化,去除非cccDNA后,加入引物及Bst DNA酶进行环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),将检测结果与临床实验室资料结合并进行分析,以判断其临床应用价值。结果  30例HBV感染患者中,有17例HBV cccDNA阳性,阳性检测率56.67%。其中肝癌5例、肝硬化4例、重型乙型肝炎5例、慢性乙型肝炎(轻-中度)3例。提示肝组织HBV cccDNA阳性可能与疾病进展密切相关,与血清HBV cccDNA阳性有一定的相关性,与乙型肝炎病毒血清免疫标志物以及肝功能状况无明显相关。结论  LAMP法能检测到石蜡包埋肝组织中的HBV cccDNA,结合临床实验室资料,对判断抗病毒药物疗效及研究乙型肝炎致病机制具有一定的意义。     

乙肝病毒血清标志物与DNA定量联合检测的临床应用价值

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）两对半抗原抗体系统、前S1蛋白（Pre-S1）和HBV脱氧核糖核酸（HBV-DNA）之间的关系及临床意义。方法用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清标志物,用荧光定量PCR检测HBV-DNA。结果A组（HBsAg^＋HBeAg^＋抗HBc^＋）HBV-DNA、Pre-S1阳性率为98.63%、86.30%;B组（HBsAg^＋抗HBe＋抗HBc^＋）HBV-DNA、Pre-S1阳性率为48.37%、22.22%;C组（其它模式）HBV-DNA、Pre-S1阳性率为4.96%、0.83%。HBV-DNA定量结果A组显著高于B、C两组（P〈0.01）;B组显著高于C组（P〈0.05）。结论正确合理地分析HBV血清学指标出现的类型,与HBV-DNA的联合动态检测有助于临床诊断、疗效观察及预后判断。     

HBV病毒滴度与血清标志物关系的研究

目的探讨乙肝患者血清中乙型肝炎病毒的滴度与血清标志物及肝功能的关系。方法1584份患者血清分别用荧光定量聚合酶链反应法(FQ-PCR)、ELISA法测定HBVDNA和血清标志物(HBV-M),肝功能三项(TB、AST、ALT)用全自动生化分析仪测定。结果感染期模式组共有1525例,HBVDNA检出有1215例,阳性率为79.67%,最高拷贝数为9.61×109/ml,最低拷贝数为9.16×103/ml,HBV-M主要模式大三阳、小三阳的HBVDNA阳性率分别为97.49%和51.17%,平均拷贝数分别为2.56×108/ml和1.61×107/ml;恢复期模式组有42例,但仍可检出HBVDNA4例,阳性率为9.52%;HBV-M全阴的有17例,1例为HBVDNA阳性,阳性率为5.88%。相关分析显示血清HBVDNA含量与肝功能状态无明显的相关性(相关系数γDNA-ALT=0.3204,γDNA-AST=0.2751,γDNA-TB=0.2007)。结论FQ-PCR方法检测HBVDNA具有高检出率,能准确反映乙肝病毒感染和复制情况;血清标志物阴性患者仍可有HBVDNA阳性;HBVDNA水平不能反映肝功能状态。HBVDNA与HBV-M、肝功能同时检测,对乙肝的临床诊断、治疗方案的选择以及疗效的判断有一定的指导意义。     

HBV感染与宿主基因及病毒DNA甲基化

乙型肝炎病毒(HBV)感染是慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病因,HBV感染诱导的宿主基因组甲基化及病毒自身DNA甲基化改变可能是病毒感染慢性化及慢性肝病形成的重要发病机制之一,HBV基因组及HBV共价闭合环状DNA的甲基化在调控病毒复制和蛋白表达中起着重要作用。探讨HBV DNA甲基化对于研究病毒的致病机制、指导HBV感染的治疗有重要意义。     

外周血HBV cccDNA检测的临床应用

目的通过对乙型肝炎患者外周血单个核细胞及血浆中共价闭合环状DNA（cccDNA）的检测,初步探讨其外周血检测对乙型肝炎诊治的价值。方法将86例确诊为乙型肝炎患者根据病情分为3组,急性乙型肝炎（AHB1、慢性乙型肝炎（CHB）及HBsAg无症状携带者（ASC）组。采集外周血,分别检测ALT、AST、总胆红素（TBIL）、cccDNA、HBV—DNA。结果三组血浆cccDNA检测结果有显著性差异（P〈0．01）。单个核细胞cccDNA7个标本阳性,血浆cccDNA与HBV—DNA、ALT、AST、TBIL相关系数分别为0．817、0．402、0．450、0．221。结论血浆cccDNA在乙型肝炎患者的各个病程有显著性差异,单个核细胞cccDNA储存池确实存在但浓度较低难以检测。血浆cccDNA．与HBV—DNA、ALT、AST相关,但与TBIL无明显相关。     

检测慢乙肝病人外周血HBV DNA含量的临床意义

目的研究荧光定量PCR法检测慢性乙型肝炎病人血清HBV DNA含量的临床意义。方法血清HBV DNA定量检测采用荧光PCR法（FQ—PCR）;采用免疫组化ABC法标记相应肝组织中aBcAg,研究二者之间的关系。结果血清HBV DNA含量较低组（A、B组）,肝组织中aacAg的表达呈阴性或少数阳性;而血清HBV DNA含量较高组（C、D组）,肝组织HBcAg表达多数呈阳性或强阳性,随着血清HBV DNA含量的升高肝组织HBcAg表达强度和范围也随之增加。结论血清HBV DNA定量检测能较好地反映乙肝病毒在体内的复制状况。     

Ad-1.2乙型肝炎病毒感染HepG2细胞后HBV cccDNA的动态分析

目的 研究Ad-1.2 HBV感染HepG2细胞后HBV的复制情况.方法 携带1.2拷贝FIBV DNA的腺病毒体外感染人肝癌细胞株HepG2,ELISA法检测培养上清中HBsAg、HBeAg的动态表达;利用质粒抽提试剂盒提取细胞内cccDNA,经绿豆核酸酶处理后,用特异引物进行实时定量PCR检测.结果 Ad-1.2HBV感染HepG2细胞后,可有效表达HBsAg及HBeAg;感染后第1天即可在细胞内检出cccDNA,第4天达到高峰.结论 Ad-1.2HBV感染细胞,可作为抗病毒药物筛选和评价的模型.