银杏苦内酯B对N-甲基-N-亚硝脲诱导的大鼠视网膜细胞凋亡的抑制作用

目的: 探讨银杏苦内酯B(GB)对N-甲基-N-亚硝脲(MNU)诱导的大鼠视网膜变性的影响及其机制。方法: 建立大鼠视网膜变性模型,应用TUNEL法检测光感受器细胞凋亡,RT-PCR法和免疫组织化学法分别检测MNU作用后不同时间大鼠视网膜中bcl-2和bax mRNA和蛋白的表达。结果: GB治疗组外核层细胞凋亡指数显著低于模型组(P<0.01)。MNU作用后12 h、1 d、2 d、3 d和5 d,bcl-2/bax mRNA模型组为0.36、0.15、0.29、0.42和0.64,GB治疗组为0.98、0.92、0.53、0.45和0.68,显著高于模型组(P<0.01)。GB治疗组Bcl-2蛋白在MNU给药后1 d表达最强,2 d阳性表达下降,3 d后阳性表达消失,模型组未见视网膜Bcl-2阳性表达;GB治疗组Bax蛋白表达显著低于模型组(P<0.01)。结论: 银杏苦内酯B能抑制MNU诱导的视网膜光感受器细胞凋亡,可能与上调Bcl-2的表达量,提高Bcl-2/Bax比值有关。     

BA46基因转染树突状细胞治疗乳腺癌的研究

目的探讨以乳腺癌特异抗原删46基因转导树突状细胞（DC）治疗乳腺癌的可行性。方法取健康人外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞（DC前体细胞），以AIM-V培养基于6孔板培养，贴壁5h，轻轻洗去悬浮细胞（T细胞，冻存备用），取贴壁细胞，将细胞分为基因转染组及对照组，基因转染组感染携带翻46基因的重组腺相关病毒rAAV／BA46/Neo，对照组以293细胞冻融液刺激，两组细胞均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）、白细胞介素4（IL-4）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导DC前体细胞成熟。第7天，收集悬浮细胞（DC），显微镜观察细胞形态，流式细胞仪分析DC的表面标志CD80、CD86、CD40的表达情况；另取该DC与T细胞按1：20比例混合，含5％人血清蛋白的AIM—V为培养基，同时加入IL-2与GM—CSF，共育7d，诱导获得细胞毒性T淋巴细胞（CTL），取删46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T为靶细胞，采用^51Cr释放法测量杀伤效率，同时以流式细胞仪检测CTL群体中CD8／CD4和CD8／CD56的比值。结果酗46基因转导的DC表面标志CD80、CD86、CD40的表达均明显高于对照组DC，所激活的T细胞对鲋46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T有很好的杀伤效果，此杀伤具有抗原特异性和MHC限制性，且该T细胞中CD8／CIM和CD8／CD56的比值均明显高于对照组（细胞裂解物冲击DC所激活的T细胞）。结论删46基因转染成功制备DC，并诱导特异的CTL，为乳腺癌的DC基因转染疗法打下基础。     

基因修饰树突状细胞诱导前列腺癌患者外周血T细胞亚群重排的研究

目的探讨以腺相关病毒（AAV）为载体,前列腺特异性抗原（PSA）基因转染树突状细胞（DC）诱导前列腺癌患者外周血T细胞亚群变化特点及临床意义。方法抽取30例前列腺癌患者外周血,采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,以rAAV/PSA感染DC前体细胞,采用系列细胞因子诱导DC前体细胞成熟。第6天收集成熟DC并与T细胞按比例混合培养,诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。分别于DC与T细胞混合培养前后应用流式细胞术分析外周血T细胞亚群及调节性T细胞（CD4^＋CD25^＋FoxP3^＋Treg）的表达水平。结果 PSA基因转染DC刺激T淋巴细胞爆发增殖,与培养前比较,混合培养6d后CD8^＋、CD8^＋CD69^＋、CD8^＋CD28^＋T细胞的比例和CD8^＋/CD4^＋比值均明显增高,差异有统计学意义（P〈0.01）;而CD8＋CD28-T细胞和Treg细胞的比例均显著降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。CD4^＋T细胞比例较前略有升高,但差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 PSA基因转染DC能够有效地激活CD8＋抗原特异性CTL,下调免疫抑制性T细胞,提高患者的细胞免疫功能,为前列腺癌的免疫治疗提供新的有效策略。     

MNU诱导的视网膜光感受器细胞损伤过程中视网膜VEGF表达的变化

目的： 探讨N-甲基-N-亚硝脲（MNU）诱导的大鼠视网膜光感受器细胞损伤过程中视网膜血管内皮生长因子（VEGF）的表达变化。方法: 50 d龄雌性SD大鼠55只,随机分5组,正常组和造模组（分4个组）,造模组40 mg/kg MNU单次腹腔注射,在注射后1 d、3 d、7 d和10 d取眼球立即分离视网膜以提取总RNA,通过RT-PCR检测VEGF mRNA的表达情况;摘取眼球进行冰冻切片,免疫荧光技术检测VEGF蛋白质在视网膜中的表达以及分布的变化。结果: RT-PCR检测结果表明,与正常对照组比较,MNU造模后1 d,VEGF mRNA的表达均较强,3 d VEGF表达最高,P＜0.01;7 d和10 d恢复正常,无明显差异,P＞0.05。免疫荧光检测结果显示,VEGF蛋白质表达与RT-PCR检测结果基本一致,VEGF蛋白质在视网膜各层均有表达,造模后1 d和3 d,外核层损伤较重,外核层VEGF的表达明显增强。结论: MNU诱导的视网膜光感受器细胞损伤可使VEGF的表达增强,提示VEGF可能参与MNU诱导的视网膜光感受器细胞的损伤修复。     

N-甲基-N-亚硝脲诱导的大鼠视网膜感光细胞损伤模型中Müller细胞增殖和细胞因子分泌的变化

目的：建立N-甲基-N亚硝脲（N-methyl-N-nitrosourea,MNU）损伤视网膜的模型,研究视网膜神经元凋亡对Müller细胞生物学特性的影响及神经营养因子的表达变化.方法：腹腔注射MNU建立视网膜损伤模型,免疫荧光染色方法研究感光细胞缺失对Müller细胞的生物学特性的影响,并检测主要神经营养因子表达的变化.结果：TUNEL法显示,腹腔注射MNU后2 d,视网膜外核层细胞凋亡现象明显.核增殖抗原（PCNA）及细胞周期素CyclinD1的表达明显增高.与此同时,Müller细胞也开始表达神经干细胞抗原巢蛋白（nestin） RT-PCR显示胰岛素样生长因子（IGF）,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和肝细胞生长因子（HGF）mRNA的表达均升高.结论：在视网膜受到损伤时,Müller细胞增殖、去分化呈现出干细胞的特性.而视网膜中IGF、bFGF和HGF等细胞因子的表达明显增高,提示视网膜损伤后可能通过大量分泌细胞生长因子,促进Müller细胞的增殖.     

妊娠诱导的调节性T细胞对na?ve T细胞抑制作用的体外研究

目的研究调节性T细胞（ Treg）及妊娠诱导的调节性T细胞（ piTreg）对na?ve T细胞增殖的体外抑制,评价其抑制率的差异。方法对孕12．5 d（E12．5d）异基因交配孕鼠C57/B6（♀）× BALB/c（♂）的piTreg和未孕雌鼠C57/B6鼠的 Treg 进行流式细胞术检测,观察piTreg 和Treg 在CD4＋T细胞中比例及其胞内Foxp3表达变化;采用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（ CFSE ）标记的na?ve T作为效应细胞和丝裂霉素C灭活的CD4-T细胞作为刺激细胞的单向混合淋巴细胞培养体系,比较piTreg和Treg对效应细胞的体外抑制强度。结果 piTreg水平明显高于Treg（P＜0．001）,且这些细胞均表达高水平的Foxp3;piTreg 在体外实验中对na?ve T细胞的抑制效应明显高于Treg （ P＜0．006）,并受其细胞数量的影响。结论妊娠诱导的调节性T细胞较来自于非孕鼠的Treg对na?ve T细胞有更明显的抑制作用,这一现象很可能是由妊娠中父系抗原刺激诱导的CD4＋CD25＋Treg活性差异造成。     

重组FoxP3腺相关病毒转染小鼠CD4+CD25 -T细胞的实验研究

目的：研究FoxP3（Forkhead Box P3）基因在小鼠T细胞的表达情况，以及重组FoxP3腺相关病毒（adeno-associatedvirus，AAV）对小鼠CD4^＋CD25^-T细胞功能的影响。方法：采用实时定量PCR检测CD4^＋CD25^-T细胞和CD4^＋CD25^-T细胞FoxP3 mRNA表达情况，利用基因重组技术构建FoxP3腺相关病毒载体，体外转染CD4^＋CD25^-T细胞，通过细胞增殖试验观察转染CD4^＋CD25^-T细胞功能变化。结果：CD4^＋CD25^-T细胞较CD4^＋CD25^-T相比高水平表达FoxP3基因mRNA，重组FoxP3腺相关病毒转染后的CD4^＋CD25^-T细胞对CD3单抗的刺激呈低反应性，并且能抑制新鲜分离CD4^＋CD25^-T细胞的增殖。结论：FoxP3基因转染的CD4^＋CD25^-T细胞在体外具有抑制T细胞活化增殖的功能。     

Rhodopsin和S-opsin在MNU诱导的大鼠视网膜损伤过程中的表达变化

目的:观察在N-甲基-N亚硝酸脲(MNU)诱导的大鼠视网膜外核层细胞损伤过程中视紫质(rhodopsin)和蓝光视蛋白(blue-sensitive opsin/S-opsin)在视网膜中的表达变化,分析其与MNU诱导的视网膜损伤的关系。方法:将30只SPF级50 d龄雌性SD大鼠随机分为正常对照组和MNU模型1、3、7、10 d组,每组各6只大鼠。模型组以腹腔注射MNU(40 mg/kg)建立MNU模型;正常对照组大鼠腹腔注射生理盐水(5 mL/kg)。右眼冰冻切片行苏木素-伊红(HE)染色判断视网膜损伤程度。通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫荧光检测各组视网膜中rhodopsin和S-opsin的mRNA及蛋白表达情况。结果:病理检测确定造模结果与以往实验一致,各组病理分级之间的差异显著(2=16.838,P0.01)。RT-PCR检测结果表明,与正常对照组相比,各MNU模型组rhodopsin和S-opsin的mRNA表达水平随MNU作用时间增加而逐渐降低且差异均显著(rhodopsin 1 d组P0.05;S-opsin 1 d组P0.01;3、7、10 d组rhodopsin和S-opsin均P0.01)。免疫荧光检测结果显示,在正常大鼠视网膜rhodopsin主要在光感受器细胞外段表达,MNU作用后rhodopsin主要在外核层表达,少量在内核层表达,并随MNU作用时间增加而逐渐表达降低。S-opsin在正常视网膜各层均有表达,在各模型组随MNU作用时间增加S-opsin的表达逐渐降低,在外核层和光感受器细胞内、外段尤为明显。结论:MNU诱导的视网膜外核层细胞损伤可降低rhodopsin和S-opsin的表达,并与MNU选择性引起光感受器细胞丧失有关。     

CTLA4Ig基因修饰的BMSCs支持CD34+细胞扩增的实验研究

目的：通过腺病毒介导CTLA4Ig在骨髓基质细胞（BMSCs)中的表达，探讨CTLA4Ig基因修饰的BMSCs支持CD34^ 细胞扩增的功能变化，为该基因修饰的BMSCs联合造血干细胞移植（HSCT），达到预防移植物抗宿主病（GVHD）和纠正预处理损伤的造血微环境（HIM）积累实验依据。方法：以CTLA4Ig-重组腺病毒按感染复数（Multiplicity of infection,MOI)50转染BMSCs，以RT－PCR检测目的基因转录；免疫磁珠（MACS）阳性选择分选骨髓CD34^ 细胞，流式细胞仪检测其纯度；通过骨髓基质细胞支持CD34^ 扩增的细胞总数及集落形成细胞数（CFC）的变化，比较转染和未转染BMSCs在支持CD34^ 细胞扩增方面的差异。结果：RT－PCR在转染组及转染后传两代BMSCs中检测到CTLA4Ig基因的转录；通过观察扩增后细胞总数及CFC数的变化，发现CTLA4Ig基因转染组与未转染组BMSCs支持CD34^ 细胞扩增的能力也无显著差异（P＞0．05）。结论：CTLA4Ig－重组腺病毒有效介导目的基因对BMSCs的转染，在MOI为50时对其支持造血的功能无显著影响。     

雷帕霉素对同种移植耐受模型CD4+CD25+ T细胞活性的影响

目的：研究雷帕霉素（Rapa）对同种移植耐受个体CD4^＋CD25^＋ T细胞体内负免疫调节作用的影响.方法：建立同种皮肤移植模型, 受体鼠术前预输注供体鼠脾细胞, 术后给予环孢素A（CsA）进行耐受诱导.移植后第14天提取耐受诱导模型鼠的T细胞, 经不同浓度Rapa和/或IL-2体外处理后, 混合淋巴细胞反应（MLR）确定T细胞特异增殖水平;流式细胞术（FCM）检测CD4^＋CD25^＋ T细胞比例变化;RT-PCR检测Foxp3 mRNA表达情况;ELISA检测细胞培养不同时间后上清中IL-10的变化.然后将Rapa和/或IL-2处理的T细胞过继转移给同种移植后的BALB/c-SCID鼠, 观察移植物存活状态.结果：CsA加供体脾细胞预先注射可明显延长小鼠移植皮片的存活期（P＜0.05）;移植耐受状态的T细胞经Rapa和/或IL-2体外处理后CD4^＋CD25^＋ T细胞比例升高、增殖水平明显降低、 Foxp3表达量明显增加;过继转输给同种移植SCID鼠后, 其移植皮片存活时间显著延长（P＜0.05）.结论：Rapa可体外扩增耐受诱导模型中CD4^＋CD25^＋ T细胞, 使CD4^＋CD25^＋ T细胞相关的Foxp3和IL-10明显升高, 过继免疫后, 小鼠同种移植物存活时间明显延长, 而低浓度IL-2可以协同Rapa的这一作用.     

Foxp3转染对哮喘小鼠脾淋巴细胞功能的影响

目的: 转染Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴细胞,探讨Foxp3表达对脾淋巴细胞功能的影响。方法: 卵白蛋白(OVA)致敏激发制作哮喘小鼠模型,收集培养脾脏淋巴细胞;使用电穿孔法转染真核表达载体pcDNA3.1(-)-Foxp3至脾脏淋巴细胞,并设转染空质粒组和对照组;RT-PCR和Western blotting检测Foxp3的表达;流式细胞术检测转染后CD4⁺CD25⁺ Treg细胞/CD4⁺细胞比例;MTT法检测转染后的脾脏淋巴细胞增殖反应,ELISA检测脾淋巴细胞上清中白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)的含量。结果: 转染组Foxp3 mRNA 和蛋白的表达水平显著高于空质粒组和对照组;转染Foxp3后CD4⁺CD25⁺ Treg细胞/CD4⁺细胞比例显著高于空质粒组和对照组;与空质粒组和对照组相比,转染pcDNA3.1(-)-Foxp3质粒明显抑制了脾淋巴细胞增殖;转染组细胞上清中IL-4和IFN-γ含量低于空质粒组和对照组。结论: 转染pcDNA3.1(-)-Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴细胞,Foxp3得到有效表达。Foxp3的高表达能增加CD4⁺CD25⁺ T细胞的数量,抑制哮喘小鼠脾淋巴细胞的增殖以及Th1和Th2细胞因子的产生。     

携带靶向干扰小鼠早期生长反应基因1短发夹RNA的慢病毒载体转染小鼠视网膜的干扰效率研究

目的 构建携带绿色荧光蛋白(GFP)和靶向干扰早期生长反应基因1(Egr-1)短发夹RNA(shRNA)共表达的慢病毒载体,转染小鼠视网膜组织,观察其对Egr-1基因的干扰效率.方法 针对已经筛选确定的Egr-1基因shRNA有效靶序列,构建携带GFP和靶向干扰Egr-1 shRNA的慢病毒载体LV-shRNA(Egr...     

人参二醇组皂苷具有与地塞米松类似的改善LPS处理小鼠肾功能的作用*

 目的：研究人参二醇组皂苷（PDS）和地塞米松（DEX）是否具有类似的减轻LPS诱导的小鼠急性肾损伤（AKI）的作用,并探讨它们的作用机制。方法：C57BL/6小鼠随机分为4组,除对照组腹腔注射生理盐水外,其余3组均经腹腔注射LPS 10 mg/kg,PDS组和DEX组小鼠在LPS注射前1 h分别经腹腔注射PDS（25.0 mg/kg）或DEX（2.5 mg/kg）。12 h后麻醉下取血和肾脏组织备生物化学与免疫印迹检测。结果：LPS组小鼠血尿素氮和肌酐含量显著高于对照组（P<0.01）,而PDS组和DEX组则明显低于LPS组（P<0.05）;PDS和DEX上调 LPS处理的小鼠肾组织IκB蛋白的表达,抑制NF-κB信号通路的活化,进而减少TNF-α和IL-6的产生;PDS和DEX均能下调LPS处理的小鼠肾脏诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达,上调肾组织锰过氧化物歧化酶的表达,减轻肾脏的氧化应激损伤。此外,PDS和DEX均明显上调LPS处理的小鼠肾脏组织细胞核糖皮质激素受体蛋白的含量。结论：人参二醇组皂苷具有与DEX相类似的减轻LPS诱导的小鼠AKI的作用,而且,它们的作用机制相似,但PDS的药效学是否也通过糖皮质受体介导还需进一步研究。     

荧光标记肿瘤转移体内模型的建立

目的 建立一种带荧光标记的肿瘤转移模型并探讨其应用价值.方法 人胃癌MGC-803细胞和小鼠宫颈癌U14细胞进行体外传代培养,转染pEGFP-N1质粒,24h检测转染效率,用无限稀释法筛选稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的单克隆细胞株MGC-803-GFP和U14-GFP.分别体内移植于BALB/c-nn裸鼠和C57BL/6J小鼠,观察成瘤潜伏期,绘制体内生长曲线,利用活体荧光成像系统活体连续观察GFP在体内的表达,观察肺部和淋巴结的转移情况,计算转移率.免疫组织化学检测与转移相关的分子CD44和E-cadherin在移植瘤中的表达.结果 MGC-803细胞和U14细胞pEGFP-N1转染24 h后的转染效率分别为30%和60%.获得了GFP(+)的单克隆MGC-803-GFP细胞株和U14-GFP细胞株.MGC-803-GFP在BALB/c-nu裸鼠和U14-GFP在C57BL/6J小鼠移植成瘤的潜伏期分别是3～5 d和2～4 d,成瘤率均为100%.利用活体荧光成像系统连续观察,可以清楚直观地观察表达GFP的MGC-803-GFP移植瘤在体内的生长,接种后第60天处死全部荷瘤鼠,解剖后仅有1只可见同侧腋窝下淋巴结的转移.接种U14-GFP后,分别在第28、37和52天观察了荷瘤小鼠肿瘤转移的发展过程.在U14-GFP原发瘤体积达到≥5 cm3时,肺部和淋巴结转移率分别为67%和100%.在MGC-803-GFP和U14-GFP的移植瘤中都可以检测到CD44的表达,而无E-cadherin的表达.结论 成功建立了表达绿色荧光蛋白单克隆细胞株MGC-803-GFP和U14-GFP,体内移植建立了荧光标记的肿瘤转移模型.该模型可用于可视化肿瘤体内的研究.     

HGF基因转染对裸鼠人淋巴瘤移植瘤的促进作用

 目的：探讨肝细胞生长因子（HGF）基因转染对裸鼠人淋巴瘤移植瘤的促进作用及其机制。方法：采用HGF基因重组质粒pVITRO2-HGF转染的Raji细胞建立裸鼠皮下人淋巴瘤移植瘤模型,动态监测裸鼠体重和肿瘤大小;8周后获取瘤组织,分别采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(TUNEL) 和免疫组化检测移植瘤组织的细胞凋亡和微血管密度（MVD）,并进行相关分析。结果：造模成功率为96.7%。HGF转染组的瘤体积明显大于HGF转染+VP-16组(P<0.01)、未转染组与空载体组(P<0.01),HGF转染+VP-16组也大于对照组(P<0.01),未转染组与空载体组间无显著差异(P>0.05)。pVITRO2-HGF转染组凋亡指数显著低于对照组(P<0.01),经VP-16诱导后凋亡增加(P<0.01),但仍低于对照组(P<0.01)。pVITRO2-HGF转染组的MVD显著高于对照组(P<0.01),但经VP-16诱导后血管增生降低（P<0.01）,但仍高于对照组 (P<0.05),对照组间无显著差异(P>0.05) 。结论：HGF基因转染可显著促进裸鼠人淋巴瘤移植瘤的生长,明显抑制凋亡的发生,这一效应可能与其促进肿瘤血管新生和抑制肿瘤细胞凋亡有关。     

重组色素上皮衍生因子对人视网膜微血管内皮细胞迁移及凋亡的影响

目的: 构建rAAV2-PEDF腺相关病毒,研究色素上皮衍生因子(PEDF)基因高表达对人视网膜微血管内皮细胞的作用。方法: 将PEDF基因克隆、重组到腺相关病毒载体pSNAV,得到的pSNAV-PEDF后转染BHK细胞,用含G418的培养基进行筛选,得到稳定转染pSNAV-PEDF的生产细胞系,用重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2感染细胞进行病毒包装,纯化后得到高滴度rAAV2-PEDF 病毒颗粒。按照10⁵v.g./cell的剂量进行rAAV2-PEDF病毒转染,分别设空白和阴性对照,激光共聚焦显微镜下观察GFP阳性细胞,Western blotting检测PEDF蛋白表达。Boyden小室法观察细胞迁移情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果: 通过PCR、酶切及基因测序的方法,证实rAAV2-PEDF构建成功。转染病毒48 h后,激光共聚焦显微镜下观察可见GFP阳性细胞,Western blotting检测,实验组PEDF表达明显强于其它组。rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,正常对照组凋亡细胞比例为2.10%±0.53%,rAAV2-GFP组为3.40%±0.62%,rAAV2-PEDF组为1.60%±0.47%,各组间无显著差异(P＞0.05)。rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,单纯CoCl₂组凋亡细胞比例为4.00%±0.55%,CoCl₂+rAAV2-GFP组为6.10%±0.71%,CoCl₂+rAAV2-PEDF组为40.00%±2.10%。rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。细胞迁移计数显示,正常对照组为33.0±2.7,rAAV2-GFP组为35.0±3.6,rAAV2-PEDF组为12.0±2.1,rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。结论: 成功构建了rAAV2-PEDF,转染人视网膜血管内皮细胞后PEDF可稳定表达。PEDF高表达可显著抑制人视网膜微血管内皮细胞迁移并可在低氧条件下诱导其凋亡。     

Treatment of established tumor is associated with ICAM-1 upregulation and reversed by CD8 depletion in a tumor necrosis factor-alpha gene transfected mouse mammary tumor.

INTRODUCTION: We have performed TNF-alpha gene transfection in a mouse mammary cancer line and found significant antitumor effects. We hypothesize that the antitumor effects observed in this model are mediated by ICAM-1 and by the recruitment of CD4+ and CD8+ T cells. In vivo (Balb/c mice) tumor growth inhibition, treatment of established tumor and the effects of ICAM-1 and CD4+ and CD8+ T cells were evaluated. METHODS AND RESULTS: Gene transfection with highly efficient vectors resulted in secretion of large amounts of TNF-alpha (ELISA). In vivo antitumor effects were tested. The number of cells required to generate palpable tumor 7-10 days after subcutaneous injection was determined (1 x 10(6)). The same number of transfected cells were injected subcutaneously and compared to nontransfected controls. Tumors were measured blindly and size was analyzed on day 30 by the Wilcoxon rank sum test. Mean tumor size after injection of transfected cells is compared to that of controls. Control tumors reached the maximum allowable size by day 30 (4 cm(2)). On day 30 EMT6-TNF-alpha tumors were 0.48 cm(2) (p < 0.05). The effect of repeat injection (challenge was also tested. Animals were injected with transfected cells or wild-type control on day -6 and challenged with the same number of wild-type tumor cells on day 0. Significant immune protection against subsequent challenge was seen after first time injection with EMT6-TNF-alpha but not after first time EMT6 wild-type injection (1.62 vs. 4 cm(2)). Treatment of 6-day-old tumor was also evaluated. On day 30, mean tumor size in animals treated with EMT6-TNF-alpha was 0.9 cm(2) compared to 4 cm(2) for controls. In all experiments, CD8+ T cell depletion and CD4+ T cell depletion caused a reversal of TNF-alpha-induced inhibitory effects. In addition, in vivo antibody blocking of ICAM-1 in tumor growth experiments reversed antitumor effects (control 4 cm(2), TNF-alpha 0.2 cm(2) and ICAM-1 blocking 3.14 cm(2)). Using flow cytometry, MHC class I and II and ICAM-1 adhesion molecule expression of transfected tumor was tested. ICAM-I expression was significantly upregulated. MHC class II antigen expression was also increased. TNF-alpha-transfected human breast cancer was also evaluated. Three cell lines and fresh tumor were transfected to express TNF-alpha. In vitro analysis revealed ICAM-1 upregulation following transfection. Histologic analysis and immunohistochemical staining revealed TNF-alpha and ICAM-1 in transfected tumors and not in wild-type tumors. CONCLUSION: Highly significant in vivo tumor growth inhibition and immune protection after injection with TNF-alpha-transfected tumors appears to be mediated predominantly by CD8+ T cells and ICAM-1 upregulation. These findings suggest that TNF-alpha increases recruitment and adhesion of effector T cells.     

慢病毒介导的CCN1基因对大鼠骨髓间充质干细胞

 目的：探讨外源性CCN1对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长和迁移的作用。方法：构建带有绿色荧光蛋白的大鼠CCN1慢病毒载体（Lenti-GFP-CCN1）并感染大鼠BMSCs,筛选最适感染复数（MOI）;实验分为空白组、感染Lenti-GFP组和感染Lenti-GFP-CCN1组,倒置荧光显微镜下观察BMSCs感染后荧光表达情况;MTT法检测细胞存活率,划痕愈合实验检测细胞迁移作用。结果：与空白组和阴性对照组相比,Lenti-GFP-CCN1感染大鼠BMSCs后,细胞的存活率未见明显差异;感染组细胞划痕愈合实验的愈合宽度/原宽度值与空白组及阴性对照组相比差异显著（P<0.05）。结论：外源性CCN1对正常大鼠BMSCs存活率无影响,可促进BMSCs迁移。     

CXCR4启动子的条件复制型腺病毒对肺癌细胞的靶向杀伤作用

目的:构建CXCR4启动子的条件复制型腺病毒载体CRAd-CXCR4-GFP,探究CRAd-CXCR4-GFP对肺癌细胞的靶向杀伤效应。方法:PCR法扩增人CXCR4-E1A基因并克隆至穿梭质粒p DC316-GFP,将骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre和重组质粒p DC316-CXCR4-GFP共转染293细胞,产生重组腺病毒CRAd-CXCR4-GFP并扩增,扩增后进行PCR鉴定和腺病毒滴度测定;real-time PCR检测5种肺癌细胞株CXCR4的mRNA表达,筛选出表达最高的A549细胞;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞,检测两者转染后CXCR4启动子活性和腺病毒复制数;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞和16HBE细胞,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,CCK-8检测各组细胞活性。结果:成功构建重组质粒p DC316-CXCR4-GFP,与骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre共转染293细胞后第11天可见片状绿色荧光;PCR表明目的基因CXCR4-E1A已成功整合在重组腺病毒基因组中;测定重组腺病毒滴度为1×1013PFU/L;CRAd-CXCR4-GFP转染A549细胞后E1A的mRNA和E4表达较Ad-NULL组明显上升;与Ad-NULL组和空白对照组相比,CRAd-CXCR4-GFP组前4 d A549细胞凋亡率和活性无明显差异,第5天细胞凋亡率明显增加,细胞活性明显降低,各组间5 d内16HBE细胞的细胞凋亡率和细胞活性均无明显变化。结论:成功构建条件复制型腺病毒表达载体CRAd-CXCR4-GFP,该载体对肺癌细胞具有靶向杀伤作用。     

MUC1 mRNA体外负载树突状细胞诱导细胞毒性T细胞对非小细胞肺癌的杀伤作用

 目的：将体外扩增的黏蛋白1 （MUC1） mRNA转染入成熟的树突状细胞（DCs）,观察其体外诱导的特异性抗肿瘤效应。方法：将分离提纯的单核细胞培养诱导为DC并用流式细胞术鉴定。构建pcDNA3.1（+）-MUC1质粒,体外转录为mRNA,电穿孔法转染DCs。定量 PCR检测转染的DCs中MUC1的表达;MTT法检测T细胞增殖情况;流式细胞术检测CD8+ 在T细胞的表达;LDH释放法测定细胞毒性,ELISA检测IFN-γ分泌水平。结果：流式细胞术结果表明成熟DCs标志表型的表达明显高于对照组。定量PCR结果说明转染后的DCs MUC1 mRNA相对表达量增高。转染组DCs与T细胞按1∶10共培养时,刺激增殖能力明显高于未转染组,且CD8+  T细胞表达率高于未转染组,诱导产生特异性的细胞毒性T细胞杀伤表达MUC1蛋白的靶细胞,而未转染组的杀伤作用较弱。转染组DCs与T细胞共培养的上清中IFN-γ的分泌水平高于未转染组。结论：电穿孔法可以将MUC1 mRNA成功转染至DCs,产生特异性杀伤效应,为以MUC1为靶点的非小细胞肺癌的免疫治疗提供实验和理论依据。