HSU17714基因反义重组质粒的构建及其对人大肠癌细胞生长的影响

我所应用减式杂交方法筛选人大肠癌负相关基因,得到一与已知基因同源性仅50％的cDNA片段,已作为新发现的基因被NCBI收录入国际基因库,我们将此cDNA片段反向克隆至非整合型哺乳动物表达载体pREP9的多克隆位点中,构建了HSU17714基因的反义RNA表达载体,并籍脂质体将之导入人结肠癌SW1116细胞中,双层软琼脂集落培养试验、流式细胞技术分析及MTT比色法等结果分别提示转染该重组体的肠癌细胞的非锚着依赖性生长能力、增殖周期活性和细胞生长速度均受到不同程度的抑制,说明外源重组体pREP9 HSU17714(AS)对肠癌SW1116细胞的生长具有抑制作用。     

逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子基因转染的肿瘤细胞克隆株的建立及其生物学活性的观察

人p53基因是一种抑癌基因．p53蛋白作为一种细胞增殖的负调节目子．调控细胞的生长和分化，维持基因组DNA的稳定．其突变．缺失或与细胞、病毒、肿瘤蛋白结合所致的p53失功能，在恶性肿瘤发生发展中起着非常重要的作用。为了进一步探讨野生型p53基因的抗肿瘤特胜．我们采用分子克隆方法将人野生型p53基因(WT—p53)cDNA全长正向插入到哺乳动物表达载体(pREP9)的BamHI位点，构建了pREP9-p53重组体，用电穿孔方法将其导入有p53基因突变的人肠癌SW1116细胞．通过标记基固Neo筛选带外源p53基因的G418抗药胜克隆，以观察抗药性克隆数量．同时对G418抗药性细胞的生长速度及细胞增殖周期进行观察：结果表明，导入WT-p53基因能使肠癌SW1116细胞的G418抗药性克隆形成减少，细胞生长速度较对照细胞明显减慢．细胞增殖周期G1期增加、S期下降。这些结果证明人野生型D53基因能抑制肠癌细胞的生长。本研究为大肠癌WT-p53实验性基因治疗提供了理论依据，说明基于恢复p53肿瘤抑制基因功能的基因治疗在治疗结、直肠癌方面有着广阔的应用前景。     

增强型绿色荧光蛋白基因稳定转染胰腺癌细胞

目的：建立稳定高表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）并能连续传代的胰腺癌细胞株。方法：将携带EGFP基因的pEGFP—C1质粒体外转染人胰腺癌细胞株SW1990，G418筛选稳定表达绿色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养，用荧光显微镜和流式细胞仪检测癌细胞荧光蛋白表达。结果：转染EGFP的胰腺癌细胞用G418筛选18天后，挑选克隆扩大培养，癌细胞几乎均见荧光蛋白表达并可连续稳定传至20代以上。结论：胰腺癌细胞株SW1990-EGFP的建立有助于构建理想的动物模型来研究肿瘤侵袭和转移的机制。     

人骨髓、脐血CD34~ 干细胞体外扩增的树突状细胞的表型及其T细胞刺激活性分析

目的:扩增出单纯疱疹病毒I型(HSV-I)Stocker株胸苷激酶(tk)基因,并将其克隆到真核表达质粒中,构建一个含有tk基因片段的高效真核表达载体.方法:根据已发表的HSV-I CL101株tk基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以HSV-I Stocker株核酸为模板,进行PCR扩增,并将扩增产物连接到pUCll9中,进行序列分析,将此基因进一步克隆到含巨细胞病毒极早期启动子的真核表达质粒pCR3-Uni中,并对重组子进行酶切鉴定.结果:PGR扩增出1.427Kb大小的片段,通过酶切和序列分析证明含完整的tk基因序列,此序列与CL101株tk基因的同源性为98.5%.酶切证实了构建的真核表达载体株的同源性很高,重组子pCR3-tk含tk基因并获得了正向重组子.结论:克隆的HSV-I Stocker株tk基因与CL101株的同源性很高,重组于pCR3-tk是一种高效真核表达载体,这为今后应用非病毒载体特别是脂质体进行基因转导来研究HSV-tk/CCV系统在肿瘤基因治疗中的应用打下了基础.     

Ki67基因RNA干扰腺病毒表达载体的构建及其抗结肠肿瘤作用研究

目的:构建针对肿瘤增殖基因Ki67的小干扰RNA(Ki67-siRNA)腺病毒表达载体,体外研究其对人结肠癌细胞株SW620细胞生长影响,为结肠癌的基因治疗提供参考。方法:设计可形成小发夹结构的Ki67-siRNA对应模板DNA序列,克隆至缺陷型腺病毒质粒pCA13,构建Ki67-siRNA表达质粒pCA13-Ki67。鉴定正确后,将pCA13-Ki67与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染至293细胞,包装成复制缺陷型腺病毒Ad-Ki67。大量扩增Ad-Ki67,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度。Ad-Ki67感染人结肠癌细胞,结晶紫染色法检测细胞病理作用,MTT法检测细胞存活,Western印迹法检测Ki67表达。结果:酶切分析、测序鉴定表明pCA13-Ki67构建成功,PCR分析表明Ad-Ki67含有Ki67-siRNA序列。Ad-Ki67可显著抑制Ki67蛋白表达及结肠癌细胞生长。结论:含有Ki67-siRNA的重组腺病毒构建成功,其能抑制人结肠癌细胞Ki67基因表达和生长。     

人IL-15基因修饰肺癌细胞的抗肿瘤作用研究

本研究构建了重组质粒pL-IL-15-SN,以Lipofectin脂质体介导将其分别转染到人肺鳞癌细胞(PC细胞系)、小鼠肺腺癌细胞(LA795细胞系),经G418筛选后获得阳性表达克隆,我们选用了两株高表达IL-15的细胞克隆——人PG1细胞(201 U/ml/10~6 cells/24小时)和小鼠LA795A(178 U/ml/l0~6cells/24小时)细胞作为研究对象进行体内外实验.     

转染NK4基因对人胰腺癌SW1990细胞生物学特性的影响

背景与目的:肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)通过其受体c-Met的激活,在调节肿瘤侵袭和转移和血管形成中具有重要作用。NK4不仅是HGF的拮抗剂,也是血管形成的抑制剂,阻断HGF/c-Met途径和肿瘤血管的形成可成为抗肿瘤治疗的策略之一。为此,我们构建NK4基因真核细胞表达载体并进行转染研究,探讨NK4基因在胰腺癌细胞中的表达及其对胰腺癌细胞生物学特性的影响。方法:对重组pcDNA3/hNK4质粒进行酶切,将NK4基因克隆到真核表达载体pRC/CMV2,应用脂质体将重组pRC/CMV2-hNK4质粒转入胰腺癌SW1990细胞中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(Westernblot)分别检测转染的肿瘤细胞中NK4mRNA和蛋白的表达并筛选出高表达的细胞克隆。采用Transwall小室和Matrigel侵袭小室测定转染NK4基因对胰腺癌细胞运动和侵袭的影响。结果:转导NK4基因的SW1990细胞可表达并分泌NK4,RT-PCR扩增出预期的453bp片段,Westernblot显示有50000的NK4蛋白,转染NK4基因对胰腺癌细胞SW1990的生长无抑制作用(P>0.05),但可显著抑制HGF或成纤维细胞所诱导胰腺癌细胞的运动和侵袭(P<0.01),而转染空载体则无此作用(P>0.05)。结论:转染NK4基因可抑制胰腺癌细胞的运动和侵袭,在胰腺癌抗转移治疗中可能具有重要作用。     

VP3和TRAIL基因共表达沙门菌载体对胃癌细胞生长作用的影响

目的: 构建鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)VP3基因和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apopto-sis-inducing ligand,TRAIL)基因的真核表达载体,并观察其对胃癌细胞生长的影响情况.方法: 采用分子克隆技术,将VP3基因插入真核表达载体pBud-TRAIL中,构建获得质粒pBud-TRAIL-VP3,采用电转化法将该重组质粒转入减毒沙门菌SL7207,再直接转染胃癌细胞株SGC-7901.48 h后采用RT-PCR检测VP3基因表达状况并在荧光显微镜下观察细胞内有无绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达.MTT法检测重组菌株对SGC-7901细胞生长状况的影响.AO/EB荧光染色检测其对肿瘤细胞凋亡率的影响.透射电镜观察胃癌细胞形态改变.结果: 获得VP3基因正确插入的真核表达载体;重组质粒经减毒沙门菌介导转染胃癌细胞后,RT-PCR检测到VP3基因存在;荧光显微镜下观察到在转染细胞内有GFP表达;转染48 h后可见到TRAIL和VP3对胃癌细胞生长有明显抑制作用(P<0.05),荧光染色可见胃癌细胞有凋亡现象,pBud-TRAIL-VP3能够明显提高胃癌细胞的凋亡率(P<0.05),透射电镜观察到转染细胞发生凋亡形态变化.结论: 减毒沙门菌可将外源基因VP3和TRAIL基因导入胃癌细胞并进行表达,TRAIL和VP3对胃癌细胞的生长起协同抑制作用并能促进胃癌细胞的凋亡.     

p53反义RNA对肠癌细胞恶性表型的抑制作用

研究ｐ５３反义ＲＮＡ对大肠癌细胞中突变型ｐ５３致癌性的抑制效应,为肿瘤基因治疗提供新思路。方法２．１ｋｂ的人ｐ５３全长ｃＤＮＡ反向插入哺乳动物表达载体ｐＲＥＰ９,得到ｐ５３反义ＲＮＡ表达载体ｐＲＥＰ９－ｐ５３（ＡＳ）,并将其导入人肠癌细胞株ＳＷ１１１６（内源性突变型ｐ５３）,采用ＭＴＴ和ＦＣＭ方法测定ｐＲＥＰ９－ｐ５３（ＡＳ）表达的ｐ５３反义ＲＮＡ对ＳＷ１１１６细胞生长的影响。结果带有ｐＲＥＰ９－ｐ５３（ＡＳ）的ＳＷ１１１６细胞,与对照组ＳＷ１１１６细胞和带ｐＲＥＰ９空载体的ＳＷ１１１６细胞相比,由于ｐ５３反义ＲＮＡ的表达,其增殖速度显著下降,ＦＣＭ的结果也证明带ｐＲＥＰ９－ｐ５３（ＡＳ）的细胞部分受阻于Ｇ０／１期,而带ｐＲＥＰ９空载体的细胞则无明显变化。结论ｐ５３反义ＲＮＡ可以有效地抑制大肠癌细胞中突变型ｐ５３的致癌性,可用于实验性肿瘤基因治疗研究     

人突变p27基因对大肠癌细胞SW480生长的影响

目的：观察人突变p27基因（p27mt）对人大肠癌细胞生长的影响，探讨p27mt基因在大肠癌基因治疗中的作用机制。方法：以携带突变p27基因复制缺陷型腺病毒（Ad—p27mt）为载体，转染大肠癌细胞SW480；用Western blot方法检测p27mt蛋白的表达；细胞计数法检测p27mt对SW480细胞生长的抑制作用；用流式细胞仪检测细胞周期：用DNA片段分析法检测细胞凋亡。结果：通过免疫印迹分析Ad—p27mt转染SW480细胞后，p27在细胞中出现了蛋白高表达。PI染色流式细胞仪检测77．96％的细胞阻滞于G0/G1期，而Ad—LacZ组及空白对照组分别为27．57％和25．29％；生长曲线显示Ad—p27mt对细胞生长就有明显的抑制作用；DNA片段分析示p27mt基因可诱导细胞的凋亡。结论：p27mt对细胞周期有明显的阻滞作用，主要阻滞于G0／G1期；p27mt基因对细胞的生长抑制机制与诱导细胞凋亡和细胞周期的阻滞有关。     

转染外源p53基因在荷瘤裸鼠人肠癌细胞中表达的检测

采用直接注射外源ＤＮＡ－脂质体复合物的方法分别在荷瘤裸鼠人肠癌组织中转染外源正义ｐ５３ｃＤＮＡ和反义ｐ５３ｃＤＮＡ的重组表达质粒及非整合型哺乳动物表达载体ｐＲＥＰ９，并以注射等量生理盐水为对照，然后应用链菌素亲生物蛋白－过氧化酶免疫组化法检测肿瘤组织中突变型ｐ５３蛋白的表达。结果表明：体外培养ＳＷ１１１６细胞中约有５０％为突变型ｐ５３蛋白阳性；转染反义ｐ５３ｃＤＮＡ表达质粒组的裸鼠移植瘤细胞ｐ５３蛋白阳性率为２５％，而注射生理盐水、转染ｐＲＥＰ９及正义ｐ５３ｃＤＮＡ表达质粒组阳性率分别为６６．７％，７７．８％，６６．７％；前者与后三者之间有显著住差异（Ｐ＜０．０１，Ｘ［２］检验），但各组间肿瘤大小并无显著性差异。据此认为，肿瘤体内直接转染外源反义ｐ５３基因能封闭肠癌ＳＷ１１１６细胞中突变型ｐ５３基因的表达。     

NOEY2基因对人乳腺癌细胞体外生长的影响

目的：构建NOEY2基因真核表达载体。研究其对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231生长的影响。方法：RT-PCR获得目的基因编码区,经T/A策略克隆后,再亚克隆至pcDNA3,获得真核表达载体。用lipofectAMINE辅助转染MDA-MB-231细胞,经G418长期筛选而获得稳定转染细胞克隆。Western印迹检测NOEY2蛋白水平的表达。通过记录生长曲线和流式细胞分析术观察转染细胞的生长和细胞周期变化。结果：NOEY2真核表达载体pcDNA3/NOEY2-CR构建成功。被稳定转染该载体的MDA-MB-231细胞有明显NOEY2蛋白表达,而对照细胞无表达。NOEY2转染细胞的生长抑制率可达46.3%,在细胞周期改变上可见明显的S期分数和G2/M期分数下降,而G0/G1期比例上升。结论：NOEY2基因转染对体外培养的人乳腺癌细胞生长具有一定的抑制作用。支持其人微言轻一个抑癌基因的推测,本研究为进一步探索NOEY2作为治疗基因的价值创造了条件。     

两个大肠癌负相关新基因的研究

目的：在分子水平寻找与人大肠癌的发生发展相关的新的因素。研究两个大肠癌负相关基因的结构与功能。方法：采用强化荧光原位杂交（FSIH）,进行两个新大肠癌基因染色体定位。通过Dot blot,Northern blot,RT-PCR-ELISA,免疫组化及体内外转染实验进行新基因功能研究。结果：已完成两个新基因的全长cDNA序列及染色体定位等结构研究并进行了两基因的核心酸与表达研究及功能研究。SNC6基因全长3168bp,定位于染色体22q13区带,共12个外显子及11个内含子,SNC19全长3152bp,这位于染色体11q24区带,两个基因于1998年被国际命名委员会分别命名为ST13、ST14基因,并被列入人类基因组图谱中,对比两个新基因在正常大肠粘膜及癌组织核酸水平表达情况,癌组织低于正常粘膜,在不同肿瘤细胞系及组织中表达不一。两基因均懂得获得了表达蛋白。SNC6已制备了单抗,经免疫组化检测表达与核酸表达结果相似,经体内外研究SNC6基因有抑制大肠癌细胞系生长的作用,SNC19已明确为丝氨酸蛋白酶家族成员,结论SNC6与SNC19基因可作为新的大肠癌相关基因加以研究、利用。目前仍需继续深入研究该两基因的功能。     

人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用

目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.     

Prokineticin 2 (PROK2) is an important factor for angiogenesis in colorectal cancer

The Prokineticin 2 (PROK2) is correlated with indispensable in maintaining the homeostasis of healthy human tissues. Herein, we examined the role of PROK2 in human colorectal cancer.After total RNA extraction from 6 colorectal cancer cell lines, we examined the expression of PROK2 mRNA. For investigating angiogenesis and tumor growth in mice, the PROK2 gene was transfected into colorectal cancer cell lines having low PROK2 mRNA expression. In addition, small interfering RNA (siRNA) was transfected into colorectal cancer cell lines having high PROK2 mRNA expression for investigation of angiogenesis and tumor growth in mice.From 6 colorectal cancer cell lines studied, PROK2 mRNA expression was increased in 3 cell lines. When the PROK2 gene was transfected into the colorectal cancer cell line with low PROK2 mRNA expression, angiogenesis and tumor growth in mice increased significantly compared to the cell line with the control vector.When PROK2 siRNA was transfected into colorectal cancer cell lines with high PROK2 mRNA expression, angiogenesis and tumor growth in mice were suppressed significantly compared to the cell line with siRNA (control).This is the first report of the association of PROK2 as an angiogenic growth factor in colorectal cancer.     

γ-synuclein对结肠癌细胞SW1116体外及体内增殖潜能的影响

目的:研究γ-synuclein对人结肠癌细胞系体外及体内增殖潜能的影响.方法:利用真核表达载体pIRES2-EGFP和RNA干扰载体pGCsi-U6/neo/GFP构建针对γ-synuclein的重组质粒,并转染至人结肠癌细胞株SW1116,经G418筛选出稳定转染细胞株.应用CCK8法检测细胞增殖活性;软琼脂克隆法检测细胞克隆形成能力;裸鼠皮下成瘤实验检测细胞在裸鼠体内的成瘤能力.结果:经测序以及RT-PCR和Westernblot验证,重组质粒成功构建,并能够过表达或抑制γ-synuclein基因和蛋白.结果显示,y-synuclein受抑制后,SW1116细胞的增殖数目从48h至120h持续显著减少(P＜0.05),克隆形成率亦显著降低(P＜0.05).SW1116细胞的增殖和克隆形成能力与其γ-synuclein的表达水平呈正相关.过表达γ-synuclein能够部分增强SW1116细胞的增殖和克隆形成能力,但差异无统计学意义(P＞0.05).体内实验也有类似结果,过表达γ-synuclein能够稍微加快SW1116细胞瘤体生长速度,但直至第27天,其生长速度才显著加快(P＜0.05).γ-synuclein受抑制后,SW11 16细胞裸鼠皮下成瘤速度从第6天至第30天显著减慢(P＜0.05).结论:γ-synuclein与结肠癌细胞体外及体内的增殖潜能密切相关.     

人核糖体蛋白S13(RPS13)编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞的初步研究

目的：扩增人核糖体蛋白S13（RPS13）编码基因序列，构建其正，反义真核表达载体，分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法：采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列，利用DNA重组技术的建正，反义真核表达载体，经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，筛选正，反义基因稳定转染细胞，RNA斑点杂交法检测正，反义稳定转染细胞mRNA水平的变化。结果：从高表达RPS13的SGC7901/VCR耐药细胞中提取细胞总RNA，RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列，并经测序证实；目的基因因按正，反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),并经酶切鉴定证实；经脂质体介导将正义真核表达载体转染SGC7901细胞，反义真核表达载体转染SGC7901/VCR细胞，G418筛选获得稳定转染细胞；RNA斑点杂交试验证实；正义稳定转染细胞RPS13mRNA水平上调，反义稳定转染细胞RPS13mRNA水平下调。结论：成功克隆了人RPS13编码基因序列，并构建了其正，反义真核表达载体，在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901/VCR中得到稳定转染细胞，正义转染细胞中RPS13mRNA表达明显增加，反义转染细胞中表达明显受抑。