快速胶体染料试纸条法检测弓形虫病IgM抗体的研究

目的　研制一种检测弓形虫病Ig M抗体的快速胶体染料试纸条法(DDIA) ,与国外进口试剂盒进行比较,以评价其临床应用价值。方法　以本实验室筛选的胶体染料D- 1标记兔抗人Ig M,以此标记物与弓形虫病人血清中的抗弓形虫Ig M抗体结合,用点有弓形虫可溶性抗原的硝酸纤维膜通过层析捕获染料标记兔抗人Ig M与弓形虫Ig M抗体的复合物,采用正交试验确定DDIA的最佳检测条件;对2 5份弓形虫Ig M抗体阳性血清和5 0份正常人血清进行检测;同时对弓形虫病流行病学筛查时的84份血清进行检测并与进口试剂盒的检测结果进行比较。结果　DDIA的最佳检测条件为:弓形虫可溶性抗原的点膜浓度为1mg/ m l,血清用量为10μl和兔抗人Ig M胶体染料检测液作1∶2 0稀释时的检测带清晰且背景较浅;2 5份弓形虫Ig M抗体阳性血清均为阳性,5 0份正常人血清有3份为Ig M抗体阳性;DDIA与进口试剂盒的总符合率为97.6 % ,其中阳性和阴性符合率分别为10 0 .0 % (35 / 35 )和95 .9% (47/ 4 9)。结论　DDIA简便快速,有较好的敏感性和特异性,同时与进口试剂盒有较高的符合率,表明该法具有较高的弓形虫病诊断价值。     

5种市售弓形虫抗体检测试剂盒的评价

目的　评价国内公司研制的 5种弓形虫抗体检测试剂盒。方法　以敏感性、特异性、符合率和Youden指数作分析指标 ,比较 5种试剂盒对国外进口的 2种弓形虫抗体试剂盒筛选出的弓形虫IgG或IgM阳性血清和正常人血清的检测结果。结果　A、B、C 3种IgM试剂盒的检测敏感性和特异性分别为 0和 92 1%、6 7%和 10 0 %、以及 13 3%和 85 7% ,Youden指数分别为 - 0 0 8、0 0 7和 - 0 0 1,基本无诊断价值。A’、B’ 2种IgG试剂盒的检测敏感性分别为 96 4 %和 32 1% ,特异性为 98 4 %和 96 8% ,Youden指数为 0 95和 0 2 9。A’试剂盒与进口IgG试剂盒的符合率达到 97 8% ,诊断价值较大 ,而B’试剂盒与进口试剂盒的符合率仅为 76 9% ,A’、B’ 2种试剂盒之间的符合率也只有 76 9%。结论　国内研制的市售弓形虫试剂盒的检测效果与质量存在一定的问题 ,尤以IgM试剂盒为甚。     

检测犬弓形虫感染双抗体夹心ELISA方法的建立

目的用42#抗弓形虫SAG3单抗为捕获抗体、29#抗弓形虫SAG3单抗作为检测抗体建立检测犬弓形虫感染的双抗体夹心ELISA方法。方法利用HRP标记检测29#抗弓形虫SAG3单抗;采用棋盘滴定法确定捕获抗体42#抗弓形虫SAG3单抗的包被浓度和弓形虫阳性血清稀释度;对封闭剂、检测抗体的工作浓度等条件进行优化,并进行敏感性、特异性、重复性以及稳定性测定。用所建立的双抗体夹心ELISA方法对76份犬待检血清进行检测,计算阳性率。结果最佳优化条件为捕获抗体包被浓度为1∶800稀释(0.34μg/孔),弓形虫阳性血清稀释度为1∶12,封闭剂为10%FBS溶液,最佳封闭时间为2h,参考阳性血清最佳作用时间为2h,检测抗体稀释度1∶3 000,TMB底物最佳显色时间为10min。优化的ELISA敏感性为1∶48;与犬心丝虫阳性血清、犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清及犬巴贝斯虫阳性血清之间均无交叉反应;批内、批间重复性试验的CV均15%;保存于4℃中的包被板稳定性90d。用该方法检测76份犬血清中的弓形虫抗原,阳性率为5.26%。结论建立的双抗体夹心ELISA方法特异、敏感,重复性好,可用于犬弓形虫感染的早期检测。     

两种抗原检测弓形虫病IgM的效果

目的观察弓形虫P30重组抗原及可溶性抗原检测弓形虫病IgM的效果。方法建立斑点免疫金渗滤法（DIGFA）。采用2种抗原分别包被在两条硝酸纤维素膜（NC）上,与待检血清中的相应IgM抗体结合,通过金标记兔抗人IgM直接显色,以检测弓形虫病IgM。2种抗原的DIGFA分别检测弓形虫IgM抗体阳性、类风湿、支原体肺炎、血吸虫病人和正常人血清。结果两种抗原建立的DIGFA检测试剂共检测5种血清样本166份,其中弓形虫感染IgM抗体阳性病人血清38份,弓形虫P30DIGFA敏感性为92.1%（35/38）,可溶性抗原DIGFA敏感性为81.6%（31/38）,差异无统计学意义（P〉0.05）。正常人群对照血清63份,检测全部阴性,特异性为100%。检测类风湿病人血清30份、血吸虫病人血清25份及支原体肺炎病人血清10份,仅类风湿病人血清出现阳性交叉反应,其中弓形虫P30DIGFA阳性2例,可溶性抗原DIGFA阳性3例。结论弓形虫P30重组抗原检测弓形虫病人血清IgM的DIGFA试剂可用于临床早期或急性期弓形虫病的诊断。     

弓形虫IgM-抗体捕捉酶联免疫吸附法的初步探讨

<正> 本文主要报道采用羊抗人IgM(n链特异)抗体包被,加受检血清,然后加弓形虫抗原和抗弓形虫特异性多抗的IgM-抗体捕捉酶联免疫吸附法(I_gM anti-body-capture ELISA)检测抗弓形虫特异性IgM的结果。该法检测肉类加工人员,献血员阳性率分别为44.7％×(38/85)和2.6％(1/36),而用常规间接IgM-ELISA阳性率分别为62.3％(53/85)和13.9％(5/36);同时与抗核抗体阳性血清和类风湿因子阳性血清的交叉反应阳性率,捕捉法为0％(0/36),间接法为0％和42.9％(15/36),并且对其中7份捕捉法检出IgM阳性的类风温因子阳性血清经2-ME吸收试验,结果确     

一种检测弓形虫IgM抗体试剂盒的评价

目的 评价一种新近研发的国产弓形虫IgM抗体检测试剂盒的应用价值.方法 以进口弓形虫IgM试剂盒检测结果为标准,评价国产试剂盒的敏感性、特异性、符合率和约登指数,分析Kappa值和变异系数.结果 检测血样531份,国产试剂盒的敏感性为93.55%,特异性为100.0%,与进口试剂盒符合率为98.87%,约登指数为0.936,Kappa值为0.84,变异系数为1.67%.结论 国产试剂盒各项指标均较理想,检测效果达到国外同类试剂盒水平,其重现性和精密性极好,具有临床应用价值.     

ABC-ELISA检测血清粉尘螨特异性IgE

目的　应用ABC -ELISA法检测粉尘螨特异性IgE。 方法　按常规ABC -ELISA法操作 ,以阳性血清光密度值1 0时所需要的条件为最适条件 ,经预实验选择最适抗原包被浓度、血清稀释度和酶结合物浓度 ,并经特异性抑制试验验证。用ABC -ELISA法对 76例哮喘患者和 30例正常人进行粉尘螨特异性IgE检测 ,并与皮肤挑刺试验结果比较。 结果　ABC -ELISA法检测粉尘螨特异性IgE最适抗原包被浓度为 10 μg/ml,血清稀释倍数为 1∶4 0 ,Avidin -HRP为 1∶6 0 0 ,粉尘螨浸液和鼠抗人IgE均能抑制阳性反应。支气管哮喘患者和正常人粉尘螨特异性IgE校正OD值分别为 2 4 1± 1 13和 1 2 5± 0 5 6 ,差异具显著性 (χ2 =5 36 ,P <0 0 1)。粉尘螨浸液皮试与螨特异性IgE测定的符合率为 93 4 0 % (99/10 6 )。 结论　ABC -ELISA法检测粉尘螨特异性IgE耗时短 ,且具有较好的抗原特异性 ,建议临床推广应用。     

抗弓形虫主要表面抗原1单链抗体的筛选及鉴定

目的采用重组抗原从人源化单链抗体库(Human single fold scFv library)中筛选和鉴定抗弓形虫主要表面抗原1(rSAG1)的单链抗体,对其特异性的弓形虫靶向作用进行分析,为弓形虫靶向生物治疗提供靶向分子。方法以重组SAG1融合蛋白作为包被抗原对噬菌体抗体库进行3轮固相筛选,获得抗rSAG1融合蛋白的阳性克隆;用纯化的原核表达载体pET-32C的亲和标签(Trx-His-Stag)、鼠可溶性抗原和大肠杆菌抗原对上述阳性克隆进行差异筛选,获得能特异性结合rSAG1的噬菌体克隆;差异筛选获得的特异性阳性克隆转染大肠杆菌HB2151进行诱导表达和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,获得能分泌抗rSAG1单链抗体(anti-rSAG1scFv)的阳性噬菌体克隆;DNA测序分析抗rSAG1的单链抗体基因序列。用Ni2 螯合柱亲和纯化rSAG1单链抗体,并用免疫印迹技术(Westernblot)对纯化的抗rSAG1单链抗体进行免疫反应性检测;免疫组化检测rSAG1单链抗体对弓形虫速殖子的靶向作用。结果经过rSAG1抗原的固相筛选后获得24株阳性克隆,差异筛选后获得5株能特异性结合rSAG1的噬菌体克隆,其中有3株分泌性表达抗rSAG1的单链抗体,DNA测序和Genbank比对表明其为3株不同的抗弓形虫主要表面抗原1的单链抗体;West-ernblot表明亲和纯化的单链抗体能较好结合rSAG1;免疫组化显示抗rSAG1单链抗体可与弓形虫速殖子结合。结论利用噬菌体抗体库技术获得的特异性人源rSAG1单链抗体与弓形虫速殖子有较强的结合能力,这对弓形虫的靶向生物治疗具有潜在应用价值。     

弓形虫抗体免疫印迹试剂盒的研制

目的 研制敏感、特异的检测弓形虫IgM和IgG抗体免疫印迹试剂盒。 方法 收集人工感染RH株弓形虫速殖子昆明系小鼠的腹腔液，提取弓形虫胞质蛋白，采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离弓形虫可溶性抗原，并经电泳转印至硝酸纤维膜，以无毒灵敏的四甲基联苯胺（TMB）为底物分别检测30份弓形虫IgM和28份IgG阳性血清，40份健康人血清。通过比较抗原制备方法和使用剂量、封闭剂、洗涤和稀释剂、工作浓度、作用时间以及反应带出现率，选择最佳实验条件，以敏感性、特异性、Youden指数以及稳定性作为试剂盒评价标准。 结果 用免疫印迹试剂盒检测30份弓形虫IgM和28份IgG阳性血清，敏感性分别为90.0%（27/30）和85.7%（24/28），40份健康对照者血清的弓形虫IgM和IgG抗体均为阴性，特异性均为100%，Youden指数分别为0.9和0.86。试剂盒于4℃ 保存约6个月的检测结果一致。 结论 该免疫印迹试剂盒敏感性和特异性均较高，且操作简便、快速。     

刚地弓形虫表面抗原1、2 B细胞表位基因的融合表达和鉴定

目的构建刚地弓形虫(以下简称弓形虫)表面抗原(SAG)1、2 B细胞表位基因片段的原核表达系统,并对其免疫反应性进行分析。方法根据GenBank中已公布的编码弓形虫表面抗原的SAG基因序列,分析SAG1和SAG2基因的B细胞表位,设计并合成弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因,将目的基因与p ET-28a(+)表达质粒连接,并转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中,挑取完整单个菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中,菌液进行PCR扩增、双酶切和测序鉴定;菌液振荡培养至吸光度(A450值)为0.6~0.8时,加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,得到带有His标签的融合蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE))电泳,对蛋白的可溶性进行分析。使用His亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化,将带有His标签的纯化重组蛋白进行蛋白质印迹(Western blotting)分析和ELISA分析免疫反应性。结果构建的p ET28a(+)-SAG重组质粒,菌液经PCR、双酶切鉴定结果显示,在909 bp处出现特异性目的条带,与预期相符,经测序表明重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE鉴定结果显示,重组蛋白rSAG相对分子质量(Mr)约50 000,为可溶性表达,与预期结果相符。Western blotting分析结果显示,重组蛋白可以与弓形虫感染小鼠阳性血清1∶100发生特异性结合。ELISA检测结果显示,重组蛋白稀释度为1∶1,阳性血清稀释度为1∶50时,阳性反应最明显,A450值为1.037 9。不同稀释倍数的重组蛋白r SAG与不同浓度的小鼠弓形虫阳性血清均可发生反应,并能很好的区分阴性和阳性血清。结论构建了弓形虫表面抗原SAG1和SAG2蛋白的B细胞表位基因的原核表达系统,重组蛋白rSAG为可溶性表达,并具有较好的免疫反应性。