哺乳动物精子顶体反应检测考马斯亮蓝染色法

顶体反应(acrosomereaction,AR)是精子在受精过程中经历的重要环节之一。在AR机理研究中,检测精子是否发生AR是生殖生物学和生殖医学中常用的研究手段。目前已建立了十多种较实用的AR检测技术,但由于精子及其顶体存在种间差异性,使许多方法在应用上都存在一些局限。近年来Moller[1]和Aarons[2,3]等报道采用考马斯亮蓝染色法来检测小鼠精子AR,作者等人先前已将此法移用于人精子AR的检测中[4],方法简便、经济。本研究目的是为了推广考马斯亮蓝染色的适用范围,建立一种哺乳动物精子AR检测较通用简便的技术。1　材料与方法1.1　材料1.1.1…     

考马斯亮蓝染色评价哺乳动物精子顶体反应发生的效果

精子获能是正常受精的前提，形态学表现为顶体反应(Acmsome reaction,AR)。目前，对AR评价尚缺乏简单、有效的方法，有报道考马斯亮蓝可用于小鼠精子顶体反应发生的检查，但尚未见其他哺乳动物的研究报道。本实验以小鼠、猪、牛、羊精子为材料，通过与台盼蓝-姬母萨枪查方法的比较，评价考马斯亮蓝在哺乳动物精子顶体检查上的准确性和可靠性。     

利血平对人精子顶体反应的影响

用间接免疫荧光法对利血平作用后的人精子顶体反应进行了观察和分析。结果表明:利血平对由ionophore A23187(A23187)诱导的人精子顶体反应有明显的抑制作用,其抑制强度随利血平浓度的降低而减弱。提示利血平有希望成为一种新的外用避孕药。     

附睾蛋白RhoA参与人精子顶体反应

目的:研究RhoA在男性生殖系统中的表达和功能.方法:采用RT-PCR来检测RhoA的mRNA表达,Western blot和免疫组化用来检测RhoA蛋白在人睾丸,附睾及成熟精子中的表达.免疫荧光用来观察这个蛋白在人精子上的定位.豌豆凝集素(PSA)染色用来确定精子顶体反应率.结果:只能在附睾中检测到RhoA的mRNA,而RhoA蛋白不仅在附睾上皮中表达,在人精子上也有表达.它位于人精子的顶体和尾部,并且随着顶体反应转移到精子的赤道部及顶体后区.同时特异的RhoA抗体能够显著地抑制精子发生顶体反应(P<0.01).结论:结果表明RhoA可能是在附睾成熟过程中带到人精子质膜表面,从而使精子获得发生顶体反应的能力.     

精子功能检测技术的应用浅析

人的体外受精最初由Roek和Menkin(1944年)进行实验,他们从卵巢取出卵子,培养后与精液共孵育45小时,133个卵子有4个受精,并达到2～3个卵裂球阶段。继而,由Schettles(1955年)将卵子与精子共同培养,并在培养液中加入输卵管液,发现部     

小鼠透明带溶解液诱导人精子顶体反应

目的 研究小鼠透明带溶解液诱导人精子顶体反应的效果，建立人精子顶体反应模型，方法正常生育力人精子经ＢｉｇｇｅｒｓＷｈｉｔｔｅｎａｎｄＷｈｉｔｔｉｎｇｈａｍｍｅｄｉｕｍ（ＢＷＷ）获能５～６ｈ后，分别用小鼠透明带溶解液（ｍＺＰＳ），ｍＺＰＳ的缓冲液ｈａｌｏｇｅｎｂｕｆｆｅｒ（ＨＢ），Ｃａ＾２＋载体Ａ２３１８７处理１ｈ，对实验和对照组精子用经典的豌豆凝集素（ＰＳＡ）法检测顶体反应。结果 ｍＺＰＳ组的顶体     

精子形态、顶体反应与卵子受精率的相关性研究

目的 研究体外受精(in vitro fertilization,lVF)中精子形态、顶体反应与卵子受精率之间的关系,分析精子 各参数在IVF受精率方面的参考意义。方法 分析男方精液标本125份,进行常规精液分析、精子形态及精子顶 体反应分析。观察受精卵1 475个,记录受精和未受精卵的数目,并分析精子各参数与卵子受精率之间的相关性。 结果 根据精子形态分析将精子正常形态分为4组,<14％、14％～24％、25％～34％和≥35％,其相对应的卵子受 精率分别为61．5％、66．7％、74．8％和79．1％,各组间相比差异有显著性,精子形态与卵子受精率有明显的相关性。 精子的顶体反应率分为3组,分别为≤3％、4％～7％和≥8％,其对应的卵子受精率分别为75．2％、75．O％和 74．5％,各组间相比差异无显著性,在体外精子顶体反应率与IVF受精率无明显的相关性。结论 在IVF中,精子 的形态对卵子的受精率有着明显的影响,卵子对正常形态的精子有一定的选择性。在体外,精子顶体反应率的高低 与卵子受精率没有明显的相关性。因此,精子形态分析和顶体反应二项参数,在自然周期和IVF周期中,对受精功 能的评价有着不同的参考价值和意义;同时,在人类辅助生殖技术实施过程中可以作为选择不同辅助生殖技术的依 据。     

人精子顶体反应与孵育时间的关系

以人新鲜及冷冻精子在不同孵育时间内及不同Ａ２３１８７浓度下进行实验。采用低渗溶液处理以观察精子的死活及顶体反应情况，比较不同条件下，精子顶体反应的变化。结果表明：（１）新鲜及冷冻精子均可受Ａ２３１８７诱发，而出现顶体反应；（２）Ａ２３１８７可使部分精子在极短时间内出现顶体反应；（３）一定范围内延长孵育时间，可提高Ａ２３１８７的诱发效率；（４）人精子间存在明显不均一性。     

IL-1对冷冻复温人精子顶体反应的影响

目的：研究复温温度和白细胞介素－1（IL－1）对冷冻精子复温后存活率和顶体反应率的影响。方法：采用精液速冻法，不同浓度IL－1作用于解冻后的精液，以三色染色法检测顶体反应率。结果：对冻融精子37℃水浴复温效果优于41℃，10ng/ml,50ng/ml IL-1可减少精子存活率和顶体反应率。结论：一定剂量IL－1可降低精子存活率和顶体反应率，可能是由于IL－1可使Na^ -K^ -ATP酶活性降低，而对丙二醛（MDA）无影响。     

尿毒症患者肾移植前后精子形态学及顶体反应变化的研究

目的 了解尿毒症患者肾移植前后精子形态及精子受精能力的变化.方法 对20例尿毒症患者接受肾移植手术前后的精液进行精子运动参数、精子形态学及顶体反应率的检测.结果 尿毒症患者肾移植手术前的精液主要参数明显低于正常对照组(P＜0.05).接受肾移植手术后前向运动精子百分率有显著提高(P＜0.05),而精子密度与术前无统计学差异(P＞0.05).肾移植术后,正常形态精子百分率有明显提高,为(19.58±7.73)%,但仍低于正常对照组(P＜0.05).尿毒症患者肾移植手术前精子顶体反应率平均为(11.20±4.38)%,低于正常对照组(32.44±12.91)%(P＜0.05),接受肾移植手术后,精子顶体反应率为(14.18±5.97)%,较术前稍增高,但无统计学差异(P＞0.05).结论 尿毒症患者肾移植术后生育能力有所改善,但其精子受精能力仍低于正常男子.     

17β-雌二醇诱导人精子顶体反应及胞内钙离子增加的研究

目的探讨雌激素对人精子的激活作用及其可能的作用机制。方法以17β-雌二醇(E2)及非透膜性大分子雌二醇-牛血清白蛋白交联物(E2-BSA)分别作用于生育力正常男性的精子,以三色法染色评价精子顶体反应(AR)发生率,流式细胞术检测精子内游离Ca2 浓度[Ca2 ]i的变化。结果E2可引起获能精子AR率明显增加,使[Ca2 ]i快速升高,对非获能精子则无明显影响;E2-BSA同样可以提高获能精子AR率及[Ca2 ]i,其作用与E2相似;E2诱导获能精子[Ca2 ]i升高依赖于胞外Ca2 的内流。结论雌激素对人精子有一定的激活作用,该作用可能是通过与人精子膜上的雌激素结合位点作用后使胞外Ca2 内流而实现的。     

对人精子顶体反应率在优选及冷冻前后变化的实验研究

目的 旨在了解人精子顶体反应率优先及冷冻前后的变化。方法 应用甘油、甘油－卵黄、柠檬酸钠（GYC）及甘油－卵黄－柠檬酸钠－L－谷氨酰胺（GYCG）三种冷冻保护剂及上游法、Percoll密度梯度离心法及双曲管优选法，检测冻贮前后及优选前后人精子顶体反应率。结果 （1）人精子冻融后其顶体反应率在GYCG组无显著改变，而在甘油组、GYC组则明显下降；（2）在上游法、Percoll密度梯度离心法及双曲管优选法优选后顶体反应率均有显著增加。结论 冷冻复温使人类精子顶体反应率下降，GYCG对人类精子的顶体反应率有较好的保护作用；本研究中的三种优选方法均可增加精子顶体反应率。     

孕酮和A23187对精子顶体反应、活力和活率的影响

目的 研究精子顶体反应诱导剂孕酮和A23187对顶体反应（Acrosome reaction，AR）、精子活力和活率的影响。方法 10例健康生育男子精液，采用PercoU密度梯度分离法优选精子，用FITC—PSA荧光染色法分析AR，用伊红Y染色法分析精子活率，用精子自动分析仪分析精子活力。结果当A23187终浓度为5、10、20及40μmol／L时，顶体反应率均明显增加，与对照组比较，差异均有显著性（P〈0．05）。随着A23187浓度增加，精子活力和活率均明显下降（P〈0.01）。当孕酮终浓度为5、10、20及40μg／mL时，顶体反应率均明显增加，与对照组比较，差异亦均有显著性（P〈0．05）。但随着孕酮浓度增加，精子活力和活率与对照组比较差异均无显著性（P〉O．05），与A23187组比较，差异均有显著性（P〈0．001）。结论 孕酮诱导顶体反应过程不影响精子活力和活率，与A23187比较更接近生理过程。     

猪射出精子体外获能与顶体反应的超微结构研究

应用透射电镜技术，研究了猪射出精子的超微结构，添加咖啡因和透明质酸，对体外培养猪射出精子获能和顶体反应的影响。在体外培养液中，精子发生两种顶体反应，主要表现为质膜大部分完整，顶体外膜在质膜下发生囊泡化和质膜消失；顶体外膜发生囊泡化两种类型。透明质酸处理，不能产生诱导顶体反应：添加获能剂的自发顶体反应中，主要表现为前一种类型，而在咖啡因诱导的顶体反应中，第二种类型反应增加，质膜可能与顶体外膜发生融合而产生杂合泡。     

小鼠睾丸巨细胞病毒感染对精子顶体反应与膜功能的影响

目的探讨小鼠睾丸巨细胞病毒(MCMV)感染对附睾尾部精子顶体反应与膜功能的影响。方法随机选择无MCMV感染史的BALB/c雄性小鼠48只作为实验组,睾丸直接接种MCMV,分别于感染后第1、2、4、6、9、14天处死小鼠,用地高辛标记的MCMVM83mRNA寡核苷酸探针对睾丸组织进行原位杂交,检测睾丸MCMV感染情况,同时取附睾尾部成熟精子进行精子顶体反应与精子膜低渗肿胀功能检测。另设平行对照组雄性小鼠30只(同法随机选择),睾丸接种不含MCMV的细胞培养液,其他处理方法同实验组。结果实验组48只雄性小鼠睾丸组织间质及(或)生精细胞中均出现原位杂交阳性信号。实验组精子顶体反应与膜功能在接种病毒后的第2天、第4天,精子顶体反应率(58%±9%、56%±9%)低于平行对照组(71%±6%、70%±7%)(P均<0.05),精子膜尾部低渗肿胀率(48%±9%、38%±8%)低于平行对照组(60%±7%、50%±4%)(P均<0.05)。结论小鼠睾丸MCMV感染模型成功建立。小鼠睾丸MCMV急性感染可导致精子顶体反应与膜功能的显著下降。     

精子正常形态率、顶体完整率、顶体反应率与卵子体外受精率的相关性研究

目的:通过检测常规体外受精中(in vitro fertilization IVF)精液常规分析正常男性的精子正常形态率、顶体完整率、顶体反应率并分析其与卵子的体外受精率之间的关系,旨在为辅助生殖技术提供几种可靠的判断精子生育力的参数与指标。方法:选择2008年7月1日到2009年12月30日间在广西医科大学第三附属医院生殖医疗中心进行控制性长方案超排卵下行常规IVF-ET的100对夫妻,共100个周期的资料做前瞻性分析,男方精液常规分析属正常范围,分析100份标本精子正常形态率、精子顶体完整率以及精子顶体反应率;观察并记录获卵个数、成熟卵个数、受精卵个数、未受精卵个数,计算其受精率。然后应用计量资料t检验,F检验以及线性相关等统计学方法对精子各项参数与卵子受精率之间的相关性进行分析。结果:实验组1,精液标本按其正常精子形态百分率分为3组,A组:≥5%而<10%、B组:≥10%而<15%、C组:≥15%,卵子体外受精率分别为67.05%、74.51%、82.49%,各组间两两相比差异有统计学意义(P<0.05)。实验组2,按顶体完整率分为两组,A组:≤85%组、B组:>85%组,卵子体外受精率分别为74.25%和82.14%,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。实验组3,按顶体反应率分为三组,A组:<14%、B组:≥14%而≤25%、C组:>25%,其卵子体外受精率分别为73.45%、77.19%、82.74%,各组间的差异有统计学意义(P<0.05)。实验组4,按精子正常形态百分率分为两组<15%和>15%组,所对应的顶体完整率分别为79.51%、87.27%,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。实验组5,用多重线性回归分析,精子正常形态率、顶体完整率、顶体反应率的标准化系数和P值分别为0.352、0.497、0.271;0.045、0.005、0.017,各个系数均有统计学意义。其中又以顶体完整率的标准化系数最大。结论:1.对于精液常规分析正常的男性,约有50%存在着不同程度的精子形态异常。卵子的受精率随正常形态精子所占百分率的升高而增高;其正常精子形态率≥5%,仍可得到一个较好的体外受精率,因此可行常规体外受精助孕。2.对于精液常规分析正常的男性,约有65%男性的精子顶体完整率>85%,随着精子顶体完整率的增加,卵子的受精率也明显增高;3.对于精液常规分析正常的男性,其78%男性精子顶体反应率≥14%,在体外受精中卵子的受精率随着精子顶体反应率所占百分比的增加而增高;4.上述三者都是影响卵子受精的重要因素,卵子体外受精率与以上三项指标间存在较强的相关关系,而其中又以顶体完整率对卵子体外受精率的影响程度最大。5.对于精液常规分析正常的男性,若正常精子形态率≥5%,在体外受精助孕前,精子顶体完整率和精子顶体反应率的检测,可不作为常规检查项目。     

精子透明带结合与辅助生殖技术中的精子优选问题

卵胞质内单精子注射技术(ICSI)使严重少弱精子症及梗阻性无精子症患者获得生育其遗传学子代成为可能。但ICSI后受精胚胎的质量和植入率仍不理想且人为选择的精子不能确保其子代的安全。选择何种精子进行ICSI,能否改善胚胎质量,降低子代风险等已成为现今研究的热点。各国学者分别从受精的关键、影响受精的因素以及ICSI治疗不育症的潜在风险等多方面进行研究。     

抗人精子单克隆抗体HZ4对人精子的作用

用人精子抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠制备抗人精子单克隆抗体。对其中ＨＺ４株进行抗生育作用测试。ＨＺ４使Ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ诱导的人精子顶体反应率由７３．３％降至２８．５％；使人精子仓鼠卵穿透率由２４％降至０；但对精子免疫制动、精子顶体蛋白酶活性无影响。