转基因表达干扰素-α1抑制乙型肝炎病毒的实验研究

目的 研究转基因表达干扰素-α1(IFN-α1)对乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用.方法 采用分子克隆技术,将HBV全基因插入真核细胞表达载体pBK-CMV中,用FuGENETM6,把pBK-HBV转染人肝癌细胞系SMMC-7721,建立HBV瞬时表达和稳定表达两种细胞模型;导入腺相关病毒载体介导的人IFN-α1重组体(pWP8A-IFN-α1),研究转基因表达IFN-α1对HBV的抑制作用.结果 pWP8A-IFN-α1转基因表达,在HBV瞬时表达的细胞培养系统中,对HBV有显著的抑制作用,HBeAg的产生被完全抑制;在HBV稳定表达系统中,对细胞培养液HBeAg的抑制率为70.6%,3 000 IU/ml外源重组IFN-α1b对HBeAg抑制率为53.6%.结论 转基因表达IFN-α1,能有效抑制HBV标志表达,其抑制作用与3 000 IU/ml的外源重组IFN-α1b的抑制作用相当.因而有可能应用转基因IFN-α1对HBV感染人群进行基因治疗.     

人干扰素-α基因转移、表达及其抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的研究人干扰素-α(hIFN-α)基因的转移、表达及其抗乙型肝炎病毒的作用.方法利用聚合酶链反应(PCR)技术和基因重组技术,体外扩增hIFN-α基因并构建重组表达hIFN-α基因的逆转录病毒表达载体(pDOR-IFN-α),用NIH 3T3细胞扩增法测定其假病毒颗粒滴度,用染料吸收法检测hIFN-α活性;将假病毒颗粒感染2.2.15细胞,用固相放免法检测其上清HBsAg和HBeAg,用斑点杂交法结合计算机扫描检测其细胞HBV DNA密度.结果PCR克隆出648 bphIFN-α全基因;假病毒颗粒滴度为1×106CFU/ml;hIFN-α生物活性为239 IU/ml/1×106/48 h;对HBsAg的抑制率随培养时间(2、4、6和8 d)的延长而逐渐增高,抑制率分别为33%、55%、55%和62%,而对HBeAg的抑制则在转染后的第2天抑制率最高,以后随培养时间延长而逐渐下降,其抑制率分别为67.7%、40%、19.5%和25.3%.而对照组对HBsAg第2、4、6、8天的抑制率分别为0%、10.8%、0%和13%,对HBeAg的抑制率分别为0%、0%、0%和1.2%.而且对HBV DNA亦有明显的抑制作用,抑制率达66%;而对照组(空白载体)抑制作用不明显.结论hIFN-α基因可以成功地转移和表达,并有抑制HBV复制和表达的作用.     

白花香莲解毒颗粒对HBV全基因组1.3倍体细胞模型病毒复制与表达的影响

目的:观察白花香莲解毒颗粒对HBV全基因组1. 3倍体Hep G2细胞模型(HBV 1. 3P)病毒复制与表达的影响。方法:按照白花香莲解毒颗粒最优提取工艺制备稠膏,并使用无菌纯水配制为0. 1g稠膏/ml母液,滤纸及0. 45μM、0. 22μM孔径PVDF超滤膜依次过滤后,应用MEM完全培养基稀释为8个浓度梯度的细胞干预液。CCK-8法测定细胞干预液对HBV 1. 3P增殖的抑制率; q PCR法检测干预24h、48h后细胞上清液中HBV DNA水平;化学发光法检测细胞上清液中HBs Ag、HBeAg表达量;免疫荧光法测定细胞内HBs Ag表达强度。结果:(1)白花香莲解毒颗粒的去乙酰车叶草酸甲酯含量为1. 23mg/g。(2)CCK-8法的最佳检测时间是加入试剂后2h,适宜细胞数范围是2×103～1. 2×104个。在0. 04～0. 625mg/ml范围内白花香莲解毒颗粒对HBV 1. 3P增殖无明显抑制作用;在1. 25～5mg/ml范围内则会显著抑制HBV 1. 3P增殖。(3)0. 625mg/ml是白花香莲解毒颗粒的最佳药物浓度,其干预48h HBV DNA的抑制率达(41. 86±5. 35)%,并能显著降低细胞上清液及细胞内HBs Ag、HBeAg的表达。结论:白花香莲解毒颗粒体外具能较强地抑制HBV复制及HBs Ag、HBeAg表达的生物活性。     

靶向ASGPR1的外源性microRNA对HBV表达和复制的抑制作用

目的:设计并构建ASGPR1靶向的mieroRNA表达载体,观察其对ASGPR1基因的抑制作用及其在HBV感染基因治疗中的应用价值.方法:以ASGPR1为靶基因.设计并构建3个针对ASGPR1不同位点的microRNA表达栽体.通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RTPCR和Western blot检测其对ASGPR1 mRNA和蛋白的抑制作用,乙肝五项定量和HBVDNA检测其对HBV的抑制作用.结果:ASGPR1 mRNA和蛋白的平均水平分别下降了57.3%和49.8%(P＜0.01);在病毒水平3种amiRNA均能明显抑制相应细胞株中HBsAg和HBeAg的分泌,其中以amiRNAASGPR1-610抑制作用最强,对培养72 h的细胞上清中的HBsAg和HBeAg抑制率分别为31.3%和33.6%(P＜0.01),HBV DNA的抑制率为29.7%(P＜0.01).结论:靶向ASGPR1的外源性microRNA能显著抑制靶基因的表达,进而抑制HBV的复制和表达.ASGPR1可以作为慢性HBV感染基因治疗的候选靶点.     

rAAV载体介导的HDV核酶对HBV基因表达的抑制作用

目的探讨重组腺相关病毒介导的HDV核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法将针对HBV基因序列C区的反式HDVR z与U6启动子和绿色荧光蛋白基因EGFP及其启动子CMV共同插入腺相关病毒载体pSNAV中并取代其原有CMV启动子区域,构建为pSNAV-CR z重组载体。并将pSNAV-CR z、pSNAV及pLEGFP质粒转染HepG2.2.15培养细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光,对转染后培养细胞内蛋白进行HBeAg和HBsAg的ELISA分析。结果所构建的重组载体经双酶切及PCR验证与实验设计一致。重组载体转染培养细胞后,荧光显微计数表明,pSNAV-CR z的转染效率为30%。HBeAg和HBsAg的ELISA检测显示,pSNAV-CR z重组载体对HepG2.2.15细胞中HBV病毒的HBeAg和HBsAg表达抑制率分别为63.5%和50.07%。结论细胞水平试验证明,重组腺相关病毒载体介导的反式HDVR z在体外培养细胞水平对HBV的复制起到一定的抑制作用。     

表达HBsAg特异性siRNA的重组腺相关病毒载体的构建

目的构建表达针对HBsAg小发卡RNA(shRNA)的重组腺相关病毒载体,以观察该病毒在体外对HBsAg和HBeAg的抑制作用。方法将表达针对HBsAg的shRNA定向克隆到pAAV/U6-hrGFP质粒中,获得重组表达质粒(pAAV-shHBs-hrGFP);采用磷酸钙转染法将该质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共同转染AAV293细胞,进行rAAV-shHBs-hrGFP重组病毒包装。收获病毒感染HepG2.215细胞;采用ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平。结果酶切鉴定、测序结果表明,pAAV-shHBs-hrGFP载体成功构建。包装收获的rAAV-shHBs-hrGFP病毒液可以感染HepG2.215细胞,并且可以抑制HBsAg和HBeAg的表达。结论制备的rAAV-shHBs-hrGFP病毒载体能够抑制HBV在体外的抗原表达。     

靶向乙型肝炎病毒X区的siRNAs对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用

目的观察siRNA对HBV基因表达和复制的抑制情况。方法针对HBVX区设计并化学合成4条siRNAs,观察在不同浓度下对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用。结果 siRNA在30nmoL/L浓度时,4种siRNA对HepG2.2.15细胞HbsAg和HBeAg无明显的抑制作用(P0.05);在60nmoL/L和90nmoL/L浓度下,siR-NA-1和siRNA-4有明显的抑制作用(P0.05),他们对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为41%和43%;siRNA能降低HepG2.2.15细胞HBVDNA的拷贝数。结论化学合成的siRNAs可以有效地抑制HBV基因的表达和复制。     

针对HBV—P基因的RNA干扰抑制乙型肝炎病毒的研究

目的构建针对乙型肝炎病毒P基因编码区、能在体内转录产生发夹状小干扰RNA（siRNA）的表达载体psiHBV／p,观察RNA干扰对HBsAg、HBeAg及乙型肝炎病毒DNA复制的抑制作用。方法针对HBV—P基因区特异序列,构建siRNA的表达载体psiHBV／p。采用脂质体介导方法将其与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞。分别于转染后24小时、48小时、72小时用ELISA法对HepG2细胞培养上清液进行HBsAg、HBeAg的检测;于转染后72小时通过FQ-PCR法分析RNA干扰作用对HBVDNA的抑制效果。结果成功构建了针对HBV—P基因区的siRNA的真核表达重组体psiHBV／p,并发现它能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌,转染后第二天抑制率达高峰,分别为84％、65％。FQ—PCR结果也证实了转染72小时后,随psiHBV／p比例的升高,其对HBV DNA的抑制作用也随之增加。结论成功构建的psiHBV／p,它能在体内持续转录产生针对P基因转录体的发夹状siRNA;在细胞水平上,体内转录产生的、针对乙型肝炎病毒P基因区特异序列的siRNA对共转染的重组载体pHBV1．3有显著和特异的抑制作用。     

乙型肝炎病毒在HepG2细胞中的稳定复制及表达

目的 建立HBVHepG2肝细胞株，使HBV能长期稳定地表达抗原并复制。方法将含完整转录单位的1．2倍体HBVDNA经Sal1位点克隆入真核表达载体pREP10，构建的重组载体pREP—HBV以Lipofemamine2000转染HepG2细胞，250μg／ml。潮霉素筛选抗性细胞克隆。ELISA检测细胞上清液中的HBsAg和HBeAg。电子显微镜下观察细胞上清液HBV颗粒。制备HBV特异性探针，以Southern印迹法检测细胞株内HBV核心颗粒DNA。结果获得含1．2倍体HBVDNA的重组载体，即pREP—HBV，该重组载体转染HepG2细胞后，获得5株潮霉素抗性细胞RHBV1～RHBV5。均能表达HBsAg和HBeAg。Southern印迹结果显示各株细胞均可见明显的杂交拖带，即存在HBVDNA复制中间体。细胞培养上清液浓缩后在电子显微镜下可见成簇的、直径约42nm的HBV颗粒及直径为22～26nm的球形颗粒。结论 成功建立了HBV稳定复制及表达的HepG2细胞株，目前细胞已传代50次，每3天1次。     

针对HBV X基因的siRNA抑制HepG2细胞HBV的复制和表达

目的构建能转录产生针对乙型肝炎病毒（HBV）X基因转录体的小干扰RNA（siRNA）转录载体pSIH—BV／X,研究其在体外对HBV复制和抗原表达的抑制作用。方法将构建成功的pSIHBV／X与HBV1．3倍体真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞，转染后24、48、72h检测上清液中HBsAg、HBeAg的变化，并检测72h时HBV DNA的变化。结果成功构建了针对HBVX基因转录体的siRNA表达载体pSIHBV／X，并发现它能抑制HBsAg、HBeAg的分泌，抑制高峰在72h．抑制率分别是64％和61％，而无关对照序列的siRNA无此作用。荧光定量PCR证实HBV DNA的复制亦受到抑制，抑制率31％。结论针对HBVX基因转录体的siRNA在体外具有抑制HBV复制和抗原表达的作用。     

舒肝宁注射液体外抗HBV作用

目的采用体外细胞模型评价保肝护肝药物舒肝宁注射液(Shuganning Zhusheye,SGN)对Hep G2.2.15细胞中稳定复制的野生型(wild type,WT)HBV和Hep G2.A64细胞中稳定复制的恩替卡韦(entecavir,ETV)耐药型HBV的抗病毒及协同抗病毒作用。方法采用CCK8细胞计数法评价SGN细胞毒性作用,选择安全用药浓度系列稀释后单独或与对照药物[ETV及替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate,TDF)]联合进行抗HBV实验,以对HBV DNA、HBsAg和HBeAg的抑制率评价SGN的抗病毒作用。结果 SGN对Hep G2.2.15和Hep G2.A64细胞的CC50分别为198.40μg/ml和85.81μg/ml;SGN单独使用对Hep G2.2.15和Hep G2.A64细胞中HBV DNA的最大抑制率分别为55.89%(t=14.195,P=0.0094)和46.29%(t=4.953, P=0.0037),SGN联合ETV对Hep G2.2.15和Hep G2.A64细胞中HBV DNA的最大抑制率分别为94.28%(t=9.745,P=0.00068)和54.75%(t=9.335,P=0.00028),SGN联合TDF组对HepG2.2.15和HepG2.A64细胞中HBV DNA的最大抑制率分别为93.11%(t=9.274,P=0.00071)和88.27%(t=43.68,P=6.03×10-6);SGN对野生型HBsAg和HBeAg未见明显抑制作用(抑制率12.00%),对ETV耐药型HBsAg抑制率为19.69%～34.26%(t=39.118,P=0.028;t=19.73,P=0.0024)。8μg/ml SGN与低浓度(0.01μmol/L)ETV联合对WT型HBV DNA的抑制有协同效应,抑制率为86.28%(t=30.745,P=0.001)。8μg/ml SGN与低浓度(0.2μmol/L)TDF联合对ETV耐药型HBV的抑制有协同效应,抑制率为60.26%(t=7.568,P=0.017)。结论 SGN可显著抑制WT型和ETV耐药型HBV的复制,联合低浓度ETV或TDF有显著协同抑制作用。     

干扰素α-2b治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者CIM＋／CD8＋T细胞活化分子CD69和HLA—DR的表达

目的观察HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者干扰素α-2b治疗前、中、后期CD4＋/CD8＋T细胞的活性与疗效的相关性。方法 32例患者隔日1次干扰素5 MU肌注,共24周。抽取干扰素α-2b治疗前,治疗1、4、12、24周的外周静脉血,密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞（PBMC）,流式细胞仪检测CD4＋/CD8＋T细胞比例及CD4＋/CD8＋T细胞表面CD69、HLA-DR的表达。结果干扰素α-2b治疗结束,HBV DNA含量转阴者12例（37%）,其中HBeAg、抗-HBe血清转换5例（16%）;12例治疗无效（37%）及8例HBV DNA抑制（25%）。HBV DNA转阴者治疗前,治疗1、4周时CD69、HLA-DR表达率较治疗无效及HBV DNA抑制者高,差异有统计学意义（P〈0.05）。HBV DNA转阴者治疗后1周时,CD69、HLA-DR表达率最高;4周时CD4＋/CD8＋T细胞的CD69、HLA-DR表达率较前下降,但仍保持较高表达率;12周时CD69、HLA-DR表达率较前更下降,与治疗无效及HBV DNA抑制者相比差异无统计学意义（P﹥0.05）;24周时CD69、HLA-DR表达率最低,与治疗无效及HBV DNA抑制者比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者CD4＋/CD8＋T细胞活化分子CD69、HLA-DR的表达,对干扰素α-2b的疗效有预测作用。     

肽核酸抑制HBV复制与表达的体外研究

合成肽核酸(PNA)片段,由OligofectamineTm转染至HepG2.2.15细胞与HBV各编码区保守区域相结合。用ELISA方法测定HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg滴度,PCR测定HBV DNA含量。通过计算抑制百分率,筛选有效PNA片段。结果在500 mol/L浓度下,PG3 HBsAg、HBeAg、HBV DNA表达抑制率分别为51.03%、55.38%、20.10%;PG6 HBsAg、HBeAg、HBV DNA表达抑制率分别为47.00%、43.10%、51.03%。表明PNA可由OligofectamineTm转染至HepG2.2.15细胞,从而抑制HBV的复制和抗原系统的表达。     

C基因截短型HBV载体的复制、包装与表达

目的 探索C基因截短型重组HBV载体的复制、包装和表达。方法 采用分子克隆、定点突变技术构建C基因截短型HBV载体；瞬时转染HepG2细胞，在荧光显微镜下观察外源目的基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达；提取转染细胞胞内、胞外DNA分别进行半巢式聚合酶链反应(PCR)、非变性凝胶电泳杂交技术、sourhern blot杂交定量分析及常规PCR等分析，检测重组HBV载体的复制、包装及子代病毒的生成。结果 经酶切鉴定，C基因截短型HBV载体构建成功；转染HepG2细胞，外源目的基因能够高效表达；在辅助载体的辅助下，C基因截短型HBV载体能够在肝细胞进行复制，包装，通过定量分析，C基因截短型HBV载体的包装效率比C基因非截短型HBV，载体提高4～8倍；另外，C基因截短型HBV载体可以在辅助载体的辅助下包装成携带外源目的基因的子代病毒颗粒分泌到胞外。结论 C基因部分截短不影响HBV载体外源基因的表达和病毒的复制，而且可以提高载体的包装效率。     

1．2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒重组体构建及其在HepG2细胞中表达和复制

目的构建基于pBlueBac4．5质粒的1．2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒（HBV）重组体，并研究其在HepG2细胞中的表达和复制。方法以重组质粒pWT上的1．2倍基因组长度C基因型HBVDNA序列和pBB4．5HBV1．3（D基因型）上的pBlueBac4．5载体序列为模板，构建重组质粒pBB4．5HBV1．2（C基因型）。用FuGENEHD瞬时转染法，将pBB4．5HBV1．2导人HepG2细胞。用化学发光免疫分析法、Southern印迹杂交法、荧光定量PCR法，分别检测转染后不同时间点HBsAg和HBeAg、HBV复制中间体及HBVDNA水平。此外，对转染时重组质粒用量进行优化。结果酶切和序列分析证实，pBB4．5HBV1．2重组质粒构建成功。初步转染实验证实，在转染细胞培养上清中可检测到HBsAg和HBeAg。优化后转染条件为：使用60mm细胞培养皿，8～11tLgpBB4．5HBV1．2，质粒与转染试剂5：9（μg：μl）。在此条件下，5d实验周期内可检测到HBsAg和HBeAg持续表达（峰值一般出现在转染后第3天）、HBVDNA持续复制（10^6～10^8拷贝／ml）及HBVDNA复制中间体形成。结论在HepG2细胞中，建立了以杆状病毒转移载体pBlueBac4．5为基础的1．2倍基因组长度C基因型HBV体外培养体系，有望为研究HBV耐药、筛选新抗病毒药物等提供新技术平台。     

载体法筛选乙型肝炎病毒S基因小干扰RNA靶位体系的建立

目的 构建4个针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因序列的小发央RNA(shRNA)表达载体，作用于增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HBV S基因融合表达载体，观察shRNA对融合蛋白的抑制作用，筛选出有效靶位。方法 利用pAVU6 27质粒，设计并掏建4个shRNA表达载体，与融合表达载体共转染AD293细胞，荧光显做镜下观察融合蛋白的荧光表达情况并通过流式细胞仪分析shRNA对融合蛋白的抑制作用。同时，逆转录聚合酶链反应法验证其筛选的有效性。结果 成功掏建shRNA表达载体和HBs-EGFP融合表达载体；4组shRNA表达载体均可不同程度抑制融合基因的表达，其中以579位点最有效，荧光表达抑制率为69．8％，RNA水平抑制率为74．6％。结论 筛选出有效抑制HBV S基因的siRNA靶位。     

环孢素A对乙型肝炎病毒作用的体外实验

目的探讨环孢素A（CsA）在体外对乙型肝炎病毒（HBV）蛋白合成、DNA复制的影响。方法将不同浓度的CsA（0．6～20．0μg／ml）作用于HepG2．2．15细胞系，通过检测细胞培养上清液中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎e抗原（HBeAg）水平；以及细胞内乙型肝炎核心抗原（HBcAg）mRNA水平和HBVDNA水平来评价HBV复制情况；通过检测细胞内PyK2激酶402位点酪氨酸（PyK2Y402）磷酸化水平来探讨CsA对HBV复制的作用机制。结果CsA对HBV复制具有抑制作用，随着CsA浓度的升高，对HBsAg和HBeAg的抑制率逐渐上升，细胞内HBVDNA复制水平下降。10．0μg／ml CsA作用4d时，对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为49．7％和34．3％，HBVDNA的表达量仅为对照组的34．9％。在2．0“g／ml CsA作用下PyK2 Y402的磷酸化水平下降。结论CsA对HepG2．2．15细胞HBsAg和HBeAg表达、HBVDNA复制均有抑制作用，并呈剂量依赖性。CsA可能通过降低PyK2 Y402的磷酸化水平抑制HBV的复制。     

重组人干扰素α-2b/免疫球蛋白G4 Fc融合蛋白在杆状病毒昆虫系统中的表达

目的 利用杆状病毒昆虫系统表达人干扰素(IFN) α-2b/免疫球蛋白(Ig)G4Fc融合蛋白(IFN/Fc),为长效干扰素的抗病毒治疗探索新方法.方法 利用分子克隆技术获得人IFN α -2b及IgG4 Fc基因cDNA,构建杆状病毒穿梭载体,在DH10 Bac菌株中转座获重组杆粒,转染昆虫细胞High five,Western blot检测目的蛋白表达,细胞病变抑制法检测生物学活性. 结果 穿梭载体在DH10 Bac中转座成功,获得重组杆粒Bacmid-IFN/Fc ; High Five细胞在病毒感染后72 h蛋白表达较好.病毒感染48 h即有少量目的蛋白表达,72 h表达量较高.Western blot结果显示在45×103处有特异性蛋白条带,体外抗病毒活性为580 IU/ml.结论 利用杆状病毒昆虫系统成功表达重组IFN/Fc融合蛋白,为新型长效干扰素研制及慢性病毒性肝炎治疗提供实验依据.     

HDV核酶对乙型肝炎病毒抑制作用的研究

目的研究HDV核酶在细胞内对乙型肝炎病毒(HBV)复制及其抗原表达的抑制作用。方法1)以HBV前基因组mRNA为靶基因,体外筛选出HDV核酶有效作用位点,构建HDV核酶并进行体外测活;2)分别选用tRNA-Val、U6和hCMV 3种真核启动子,重组构建HDV核酶真核表达载体ptVHRz、pSURz和pcDHRz,分别用3种载体转染HepG2.2.15细胞;3)用点杂交、ELISA和实时荧光定量PCR方法分别检测核酶在细胞内的表达及对HBV的抑制作用。结果在HBV C基因区筛选到一位点,所构建的HDV核酶在体外条件下对该位点能产生有效切割。3种核酶表达载体在细胞内均能高效表达,在转染48 h后,ptVHRz和pcDHRz对HBeAg的表达产生了明显的抑制作用,而对HBsAg没有抑制作用。三者对HBV的复制均未产生明显影响。结论HDV核酶在细胞内对HBV抗原的表达能产生特异性抑制作用,但未能有效抑制HBV的复制,对其原因需进一步深入研究。     

4种新疆中草药对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

用2.2.15细胞株进行4种中草药制剂的抑制试验,结果显示雪莲注射液、骆驼蓬水溶液有抑制2.2.15细胞表达HBsAg、HBeAg和HBV DNA的作用,其抑制作用呈剂量效应。复方一枝篙虽能抑制HBeAg的表达,但对HBsAg和HBV DNA无效。复方沙棘亦无抑制HBsAg、HBeAg及HBV DNA的作用。